基于pcr?rlfp?dhplc技术扫描分析食品中动物源性成份组成的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种分析肉制品的动物物种来源的方法。更具体地，本发明提供一种基于PCR?RLFP?DHPLC技术全景扫描分析食品中动物源性成份组成的方法。本发明还提供了一种用于分析肉制品的动物物种来源的试剂盒。
【专利说明】
基于PCR-RLFP-DHPLC技术扫描分析食品中动物源性成份组成
技术领域
[0001] 本发明属于食品检测领域。更具体地，本发明设及一种分析肉制品的动物物种来 源的方法。特别地，本发明提供一种基于PCR-RLFP-DHPLC技术扫描分析食品中动物源性成 份组成的方法。本发明还提供了一种用于分析肉制品的动物物种成份的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 国内外市场上肉制品渗假现象频发，运种假冒伪劣产品虽不至于损害人民群众的 身体健康，但却足W侵害消费者利益，扰乱市场的公平竞争环境，极端情况下还会引发民族 矛盾。因此，有必要研发肉制品中动物源性成分鉴定技术，对市场上"肉制品渗假"风险进行 防控。
[0003] 目前国内外用于动物源性成分鉴定的主流技术为巧光实时定量PCR(real-time PCR)技术，虽然该技术具有检测灵敏度高、特异性好和耗时短等优势，但是利用该技术对动 物源性成份进行鉴定时，检测结果只能显示样品中是否含有某种动物源性成份，而无法对 样本中的动物源性成份组成进行全景分析。正是由于运种技术缺陷，常常会使"肉制品渗 假'的风险疏于防控，从而引发一系列的社会问题。例如：2013年英国的"马肉风波"事件在 世界范围内造成了极大的负面效应，不久，欧盟继马肉风波之后，又爆出鱼肉制品造假程度 更甚的消息。因此，研发一种可W对肉制品中的动物源性成份进行全景扫描分析的技术方 法对于"肉制品渗假"的风险防控至关重要。
[0004] PCR-RFLP技术是一类被广泛用于物种鉴定的技术方法，该技术方法包括用通用引 物扩增一段预选的DNA片段，根据DNA片段的序列选择合适的限制性内切酶，酶切DNA片段并 产生特异性的酶切图谱，根据酶切图谱实现对物种的鉴定。通过构建标准物种酶切图谱库 W及与测序技术的联合应用，PCR-RFLP可W很好的弥补real-time PCR技术的不足，实现对 肉制品中的动物源性成份组成全景扫描目前，基于PCR-RFLP开发的鱼类物种鉴定技术 已经相当成熟，已经有商品化的试剂盒出售。该试剂盒由Agilent Technologies公司研发， 可W用于鉴定50种W上的鱼类物种W。基于PCR-RFLP技术对非鱼类物种成份的鉴定虽常有 报道，但未形成商品化检测试剂盒。2005年Aida AA等人选用内切酶BsaJ I对长度为350bp 的PCR产物进行酶切，实现了对清真食品中猪肉成份的鉴定W。2009年Abde^Rahman SM.等 人选用限制性内切酶Alu I对驴肉和马肉进行了有效区分W。同年，chandrika M等人利用 PCR-RFLP技术实现了对猪、牛、水牛、鹤譜、鸡、山羊和兔子的鉴定。在该技术方法中，扩增的 PCR产物片段长度为359bp，选用的内切酶包括Alu I，BsaJ I，Rsa I，Mse I和BstU 1[6]。 2012年，化dia化ider等人W线粒体DNA为模板，利用条形码通用引物扩增长度为71化p的 C0I序列，选择限制性内切酶化a II切割C0I片段，实现了对牛、鸡、火鸡、绵羊、猪、水牛、骆 驼和驴的有效区分W。同年M.Eaqub等人选用限制性内切酶Alu I实现了对猪肉成份的鉴 定W。2014年，Abbas D等人利用PCR-RFLP技术实现了对肠类食品中牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、 驴肉和马肉的鉴定[9]。虽然近年来相关研究报道不断，但是运些方法主要存在W下几点技 术局限性：1)所鉴别的物种种类范围狭窄；2)限制性内切酶片段多样性的分析手段自动化 程度不高，样品之间易形成交叉污染;3)-些研究选择的内切酶种类过多，需进行多次酶切 反应才能实现对动物源性成份的鉴别，操作繁琐。因此，有必要继续深入研究基于PCR-RFLP 的物种鉴定技术，W实现对肉制品中禽类和哺乳动物类的物种成份进行全景扫描分析。
[000引DHPLC(变性高效液相色谱）是近年来发展起来的一项核酸分析技术。应用 lYansgenomic公司的DNA S邱Cartridge分离柱可W有效分离长度不同的DNA片段，并且该 技术分辨率高，分析过程自动化，可W有效的防止样品间的交叉污染。本研究拟设计一对可 W从样品中扩增出所有禽类和哺乳动物类物种成份C0I片段的通用引物序列;通过对C0I片 段的核酸序列分析，筛选出可W有效区分各物种成份的限制性内切酶;利用筛选获得的内 切酶对扩增获得的C0I片段进行酶切;利用DHPLC技术绘制酶切图谱，构建阳性样本库，W实 现对肉制品中禽类和哺乳动物类的物种成份进行全景扫描分析。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供一种分析肉制品的动物物种来源的方法，所述方法包括 W下步骤：
[0007] 1)提取肉制品样品的基因组DNA;
[000引 2)w所述基因组DNA为模板，使用通用C0I引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
[0009] 3)将所述PCR产物进行酶切;和
[0010] 4)利用DHPLC对酶切产物进行分析，
[0011] 其中步骤2)中所述的通用C0巧I物对的序列为(方向5'-3'):
[0012] C01-F(正向引物）：CGNATAAAYAAYATRAGCTTYTGA
[0013] C01-R(反向引物）：TANACTTCDGGRTGNCCRAARAATCA
[0014] 其中；
[0015] R表示 A或 G;
[0016] Y表示 C或 T;
[0017] 慷示G或A或T;
[001引 N表示A或T或G或C。
[0019] 根据本发明的一个优选实施方案，其中步骤3)中进行酶切使用的内切酶为 Hindlll和/或Hpall。
[0020] 根据本发明的另一个优选实施方案，其中所述动物物种选自哺乳动物和禽类，优 选选自反当动物、犬科动物、兔科、猫科和家禽，和优选选自绵羊、山羊、马、驴、兔子、猫、鼠、 牛、猪、狐狸、狗、骆、鹿、骆驼、鹤譜、大雁、错子、鸡、鸭、火鸡和山鸡。
[0021] 根据本发明的另一个优选实施方案，其中在步骤3)中将获得的DHPLC的洗脱峰与 同样条件下确定的已知动物物种的DHPLC的洗脱峰进行比对，如果两者的洗脱峰重合，则指 示所述肉制品样品中存在来源于所述已知动物物种的成份。
[0022] 根据本发明的另一个优选实施方案，所述方法可用于分析所述肉制品样品中动物 源性成份组成。
[0023] 在另一方面，本发明还提供一种用于分析肉制品的动物物种来源的试剂盒，其包 括针对哺乳动物和禽类的通用C0I引物对，其中所述通用C0I引物对的序列为(方向5'-3'):
[0024] C0I-F(正向引物）：CGNATAAAYAAYATRAGCTTYTGA
[0025] CO I -R (反向引物）：TANACTTCDGGRTGNCCRAARAATCA
[0026] 其中；
[0027] R表示 A或 G;
[002引 Y表示C或T;
[0029] D表示G或A或T;
[0030] N表示A或T或G或C。
[0031] 根据本发明的一个优选实施方案，所述试剂盒还包含限制性内切酶化nd III和/ 或限制性内切酶化a III。
[0032] 根据本发明的另一个优选实施方案，所述试剂盒还包含标准DNA模板和/或PCR反 应液，优选其中所述标准DNA模板是含有已知动物物种的C0I序列的质粒或者基因组。
[0033] 在一个优选实施方案中，所述标准DNA模板是含有已知动物物种的C0I序列（如 cDNA序列或其互补序列）的质粒或者基因组。所述PCR反应液包括进行PCR反应所需的各种 组分，如MgCl2、缓冲液、dNTP、Taq酶等，它们都是本领域技术人员公知的。
[0034] 根据本发明的另一个优选实施方案，所述试剂盒还包含阳性样本酶切图谱库，所 述阳性样本酶切图谱库是指根据已知动物物种的C0I序列的质粒或者基因组作为模板，使 用权利要求6中所述的通用C0I引物进行扩增，所获得的PCR产物使用限制性内切酶Hind III和/或限制性内切酶化a III进行酶切后的DHPLC洗脱峰图谱。
[0035] 本发明还提供根据本发明所述的试剂盒在分析肉制品的动物物种来源中的应用。
[0036] 通过使用本发明的方法和试剂盒，能够对食品中的动物源性成份进行全景扫描， 从而提升了监管部口的监控能力，可W主动发现并防控风险。
[0037] 发明详述
[0038] 本发明的一个方面是提供一种分析肉制品中动物源性成份的方法，所述方法包括 W下步骤：
[0039] 1)阳性样本菌种库的构建；
[0040] 2)设计针对哺乳动物类和禽类C0I片段的通用引物；
[0041] 3)内切酶的筛选；
[0042] 4)阳性样本酶切图谱库的构建；
[0043] 5)肉制品样本中动物源性(哺乳动物类和禽类)成份的分析。
[0044] 根据本发明的一个优选实施方案，所述动物物种选自禽类和哺乳动物类，优选选 自反当动物、犬科动物、兔科、猫科和家禽，和优选选自绵羊、山羊、马、驴、兔子、猫、鼠、牛、 猪、狐狸、狗、骆、鹿、骆驼、鹤譜、大雁、错子、鸡、鸭和火鸡。从NCBI数据库中获取上述物种 C0I片段的核酸序列，利用体外基因组合成技术合成运些物种的C0I片段，并将合成的片段 分别克隆至PTC57载体中。将连接成功的质粒转入D册a感受态细胞中，挑取阳性克隆菌，扩 增培养，用终浓度40 %的甘油保菌，-80°C冻存储藏，制备阳性样本菌种库。
[0045] 根据本发明的另一个优选实施方案，在上述方法的步骤2)中针对禽类和哺乳动物 类物种的C0I片段设计一对通用引物，使用运对引物进行PCR扩增，可W扩增出禽类和哺乳 动物类中不同物种的C0I片段。将上述方法步骤1)中阳性样本菌种库中储藏的菌种活化，扩 增，并提取含有物种C0I序列的质粒作为模板，使用设计获得的通用引物进行PCR扩增，得到 PCR产物，并对PCR产物进行测序分析。
[0046] 根据本发明的另一个优选实施方案，在上述方法的步骤3)中通过肥Bcutter V2.0 分析上述方法步骤2)中获得的PCR产物的酶切位点，通过比对，初步确定可W对物种进行区 分的限制性内切酶;通过酶切实验，筛选出可W对物种进行区分的限制性内切酶。
[0047] 根据本发明的另一个优选实施方案，在上述方法步骤4)中利用上述方法步骤3)中 筛选获得的限制性内切酶对上述方法步骤2)中的PCR片段进行酶切;利用DHPLC对酶切产物 进行分析，绘制酶切片段的洗脱峰图谱，从而获得阳性样本酶切图谱库。
[0048] 根据本发明的另一个优选实施方案，在上述方法步骤5)中从市场购买肉制品作为 分析样本，提取样本的基因组作为扩增模板;使用上述方法步骤2)中的通用引物进行PCR扩 增;获得的产物使用上述方法步骤3)中筛选的限制性内切酶进行酶切处理;获得的酶切产 物用DHPLC进行分析，绘制酶切产物的洗脱峰图谱;将样品的酶切图谱与阳性样本酶切图谱 库进行比对，如果两者的洗脱峰重合，则指示所述肉制品样品中存在来源于所述已知动物 物种的成份;如果两者的洗脱峰不重合，则指示所述肉制品样本中存在未知的动物物种成 份;将存在未知动物物种成份的样本PCR产物克隆至T-载体，挑取阳性克隆进行测序分析， 直至寻找到未知的动物物种成份；W含有未知动物物种成份的T-载体作为模板，按照上述 方法4)处理，扩增阳性样本酶切图谱库。
[0049] 根据本发明的一个特别优选的实施方案，所述动物物种特异性的C0I引物选自W 下序列(方向5'^3'）：
[00 加]C01-F:CGNATAAAYAAYATRAGCTTYTGA [0化 1 ] C0I-R:TANACTTCDGGRTGNCCRAARAATCA [0化2 ] R：A/G；Y:C/T；D:G/A/T；N:A/T/G/C
[0053] 在另一方面，本发明还提供一种用于分析肉制品的动物物种来源(哺乳动物类和 禽类)的试剂盒，其包括：
[0054] 1)-种动物物种(哺乳动物和禽类特异性)的通用C0I引物对；
[0055] 2)阳性样本酶切图谱库；
[0化6] 3)PCR反应液；和
[0057] 4)内切酶反应液。
[0058] 在一个优选实施方案中，所述标准物种酶切图谱库是由上述方法步骤4)制备获得 的。所述PCR反应液包括进行PCR反应所需的各种组分，如MgCl2、缓冲液、dNTP、Taq酶等，它 们都是本领域技术人员公知的。所述的酶切反应液包含上述方法步骤3)中筛选获得的内切 酶W及与之相匹配的反应缓冲液。
[0059] 根据本发明的一个特别优选的实施方案，所述试剂盒中的所述动物物种(哺乳动 物和禽类特异性)的通用C0I引物对选自W下序列(方向5'^3'）：
[0060] C0I-F:CGNATAAAYAAYATRAGCTTYTGA [0061 ] C0I-R:TANACTTCDGGRTGNCCRAARAATCA
[0062] R：A/G；Y:C/T；D:G/A/T；N:A/T/G/C
[0063] 通过使用本发明的方法和试剂盒，可W:l)本技术方法可W快速、准确的鉴定肉制 品中哺乳动物和鸟类的动物源性成份，多个肉制品中动物源性成份分析结果表明，本方法 的鉴定准确率为100% ;2)本方法采用一对引物和两种限制性内切酶即可实现对现有常见 肉制品中哺乳动物成份和禽类成份的检测。
【附图说明】
[0064] 图1.阳性样本酶切图谱库，即W阳性样本菌种库中的阳性质粒为模板，用通用引 物扩增后酶切，用DHPLC分析获得的阳性样本酶切图谱(色谱截图）；
[0065] 图2.设计获得的通用引物对对哺乳动物和禽类的C0I序列扩增图；
[0066] 图3.样品1的分析结果(色谱截图）。（1)样品1的酶切图谱；（2)阳性样本图谱库中 兔子的酶切图谱；（3)阳性样本图谱库中兔子的酶切图谱与样本1的酶切图谱重叠图。
[0067] 图4.样品2的分析结果(色谱截图）。（1)样品2的酶切图谱；（2)阳性样本图谱库中 鸭子的酶切图谱；（3)阳性样本图谱库中鸭子的酶切图谱与样本2的酶切图谱重叠图。
[0068] 图5.样品3的分析结果(色谱截图）。（1)样品3的酶切图谱；（2)阳性样本图谱库中 牛的酶切图谱；（3)阳性样本图谱库中猪的酶切图谱；（4)阳性样本图谱库中牛和猪的酶切 图谱与样本3的酶切图谱重叠图。
[0069] 图6.样品4的分析结果(色谱截图）。（1)样品4的酶切图谱；（2)阳性样本图谱库中 驴的酶切图谱；（3)阳性样本图谱库中马的酶切图谱；（4)阳性样本图谱库中驴和马的酶切 图谱与样本4的酶切图谱重叠图。
[0070] 图7.样品5的分析结果(色谱截图）。（1)样品5的酶切图谱；（2)阳性样本图谱库中 马的酶切图谱；（3)阳性样本图谱库中猪的酶切图谱；（4)阳性样本图谱库中马和猪的酶切 图谱与样本5的酶切图谱重叠图。
[0071] 图8.样品6的分析结果(色谱截图）。（1)样品6的酶切图谱；（2)阳性样本图谱库中 绵羊的酶切图谱；（3)阳性样本图谱库中猪的酶切图谱；（4)阳性样本图谱库中绵羊和猪的 酶切图谱与样本6的酶切图谱重叠图。
[0072] 图9.样品7的分析结果(色谱截图）。（1)样品7的酶切图谱；（2)阳性样本图谱库中 绵羊的酶切图谱；（3)阳性样本图谱库中鸭子的酶切图谱；（4)阳性样本图谱库中绵羊和鸭 子的酶切图谱与样本7的酶切图谱重叠图。
[0073] 图10.样品8的分析结果(色谱截图）。（1)样品8的酶切图谱；（2)阳性样本图谱库中 鸡的酶切图谱；（3)阳性样本图谱库中鸭子的酶切图谱；（4)阳性样本图谱库中绵羊的酶切 图谱；（5)阳性样本图谱库中鸡、鸭子和绵羊的酶切图谱与样本8的酶切图谱重叠图。
【具体实施方式】
[0074] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0075] 实施例1:阳性样本菌种库的构建
[0076] 通过NCBI数据库获得绵羊（Ovis aries|KR868678.1)、山羊（Capra hircus KR059175.1)、马化quus cabal lus I KT757764.1)、驴化quus asinus I X97337.1)、牛（Bos Taurus IKT184472.1)、猪（Sus scrofa IKF569218.1)、巧牛（Bos muUis I KR106993.1)、水牛 (Bubalus bulalis I JN632607.1)、兔子（Oiyctolagus cuniculus |AJ001588.1)、猫（Felis 。日化3|肥0753.1)、大鼠（1?日《113 11〇'￥6邑1。113|阳011917.1)、狐狸（化1口63|1^11443.1)、狗 (Canis familiaris I AY29880.1)、骆（Nyctereutes procyonoides I GU25622.1)、马鹿 (Cervus elaphus|AB245427.2)、骆驼（Camelus bactrianus fe;rus|EF212038.2)、鸡 (Gallus I KR：M7464.1)、鸭（Anas I KF751616.1)鹤譜（Coturnix japonica IAP003195.2)、大 雁（Anser 巧即oides IKT427463.1)、错子（Columba livia IKP319029.1)和火鸡(Meleagris gallopavo|EF153719.1)的COI(巧tochrome oxidase subunit I)序列，截取每个物种序列 对 CAACCACAAAGACATTGGCA 和 GGTGTCCGAARAAYCARAA (方向 5 - -3 -)之间的片段核酸序列，委托 北京博轩宏宇生物技术有限公司利用全基因组体外合成技术按照该核酸序列体外合成各 个物种的C0I片段，并将合成好的基因片段分别克隆至pU巧7(武汉森灵生物科技有限公司） 上，将克隆好的载体转入感受态细胞D册a中，制备成具有氨节抗性的阳性菌株。将所有菌株 分别扩增培养，用终浓度40 %的甘油-8(TC保存，制备阳性样本菌种库。
[0077] 实施例2:制备阳性样本质粒
[007引将加 L菌种保存液(来源于阳性样本菌种库)接种至5mL LA培养基(蛋白腺：lOg/L， 酵母:5g/L，化Cl: lOg/L W及氨节青霉素(天根生物）：lOOug/血）中37°C扩增培养24h，按照 质粒提取试剂盒（TaKaRa Mini邸ST plasmid purification kit Ver.4.0)的说明书操作 提取质粒样本。
[0079] 实施例3:设计针对哺乳动物和禽类C0I片段的通用引物
[0080] 比对分析实施例1中截取每个物种序列对CAACCACAAAGACATTGGCA和 GGTGTCCGAARAAYCARAA (方向5' -3')之间的片段核酸序列，在各个物种共有的序列区间共设 计3对不同引物，W实施例2中提取的质粒作为模板进行PCR实验，对引物的特异性进行分析 测试，结果表明第二对引物可W作为通用引物对哺乳动物类和禽类C0I序列进行有效扩增 (结果见附图2)。第二对的引物序列如下(方向5'^3'）：
[0081 ] C0I-F:CGNATAAAYAAYATRAGCTTYTGA
[0082] C0I-R:TANACTTCDGGRTGNCCRAARAATCA
[0083] R：A/G；Y:C/T；D:G/A/T；N:A/T/G/C
[0084] 实施例4:内切酶的筛选
[00化]通过肥Bcutter V2.0分析实施例1中不同物种C0I序列中的内切酶位点，通过比 对，初步确定Alu I，化a II，Hind IIIW及Xba I作为候选内切酶进行实验鉴定。W实施例2 制备的阳性样本质粒为模板，W实施例3筛选获得的通用引物为扩增引物，用PCR扩增试剂 盒(Q5化曲-Fide 1 i ty Ki t，肥B)分别扩增出不同物种的C01序列，PCR的反应条件遵照PCR 扩增试剂盒说明书进行设定。选择肥B的内切酶Alu I，化a II，Hind III-HFW及Xba I对 PCR产物进行单酶切，酶切反应条件为37°C，比，灭活条件为80°C，20min。酶切体系为:PCR产 物：lOuL，内切酶：luL，Cutsmad buf f er:加 L，此0: 34uL，Total: 50uL。将酶切产物用DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography)变性高效液相色谱 (Transgenomic公司）进行分析，上样量为40uL，分析模式为universal model，分析条件如 表1。研究结果表明，单酶切体系无法实现对全部阳性样本的有效区分，因此，进一步筛选双 酶切体系的区分效果，双酶切的组合为I:Alu I+Hpa I+Hind I+Xba I;IV:Hpa II+Hind III-HF;V:Hpa II巧ba I;VI:Hind III-HF巧ba I。酶切反应条 件为37°Cah，灭活条件为80°C，20min，酶切体系为：PCR产物：10uL，酶l:luL，酶2:luL， Cutsmad buffer:加 L，此0:33uL，Total:50uL。鉴定结果表明，仅有IV:Hpa II+Hind III- HF的双酶切组合可W实现对阳性样本的有效区分，为了达到最佳的物种鉴定效果，最终确 定用化a II和化nd III双酶切处理PCR产物，酶切反应条件为37°Cah，灭活条件为80°C， 20min，酶切体系为：PCR产物：lOuL，Hpa II: luL，Hind III: luL，Cutsmad缓冲液：5uL，此0: 33uL，总共：50uL。
[0086] 表1 :DHPLC(universal model)的核酸片段分离条件 [00871
[0088] 实施例5:阳性样本图谱库的构建
[0089] W实施例2制备的阳性样本质粒为模板，W实施例3筛选获得的通用引物为扩增引 物，用PCR扩增试剂盒(Q5化曲-Fidelity Kit,肥B)分别扩增出不同物种的C0I序列，PCR的 反应条件遵照PCR扩增试剂盒说明书进行设定。按照实施例4确定的酶切反应条件对PCR产 物进行酶切，按照实施例4所示的DHPLC分析条件和上样量对酶切产物进行分析，储存所获 得的酶切图谱(见附图1)构建阳性样本图谱库。
[0090] 实施例6:样本一的动物源性成份分析
[0091] 样本一来源于市购标称为"兔肉"的肉制品。称取样本0.2g，使用基因组提取试剂 盒（TakaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0)提取样本基因 组，具体提取步骤按照试剂盒说明书进行，提取获得的基因组样本浓度用超微量核酸测定 仪化U0,购自于英国柏诺有限公司）测定，经测定，样品的基因组浓度为64ng/uL。用实施例3 筛选获得的通用引物为扩增引物，用PCR扩增试剂盒(Q甜i曲-Fidelity Kit,肥B)分别扩增 出不同物种的C0I序列，PCR的反应条件遵照PCR扩增试剂盒说明书进行设定。按照实施例4 确定的酶切反应条件对PCR产物进行酶切，按照实施例4所示的DHPLC分析条件和上样量对 酶切产物进行分析，酶切图谱见图3中的（1)。经比对，所获得酶切图谱与阳性物种图谱库中 的兔酶切图谱（图3中的（2))全重合（图3中的（3))，分析结果显示样品一为兔肉样本。为了 验证检测结果的准确性，将PCR产物测序(委托北京博轩宏宇生物技术有限公司完成），经过 比对，测序结果显示该PCR序列与兔子（OiTctolagus cuniculus IAJ001588.1)的序列相似 度为100% ,本次检测结果正确。
[0092] 实施例7:样本二的动物源性成份分析
[0093] 样本二来源于市购标称为"鸭肉"的肉制品。称取样本0.2g，使用基因组提取试剂 盒（TakaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0)提取样本基因 组，具体提取步骤按照试剂盒说明书进行，提取获得的基因组样本浓度用超微量核酸测定 仪化U0,购自于英国柏诺有限公司）测定，经测定，样品的基因组浓度为128ng/uL。用实施例 3筛选获得的通用引物为扩增引物，用PCR扩增试剂盒(Q5Hi曲-Fidelity Kit,肥B)分别扩 增出不同物种的C0I序列，PCR的反应条件遵照PCR扩增试剂盒说明书进行设定。按照实施例 4确定的酶切反应条件对PCR产物进行酶切，按照实施例4所示的DHPLC分析条件和上样量对 酶切产物进行分析，酶切图谱见图4中的（1)。经比对，所获得酶切图谱与阳性物种图谱库中 任何一张图谱的洗脱峰均不相同。为了进一步确定物种成份，将样品的PCR产物克隆至T载 体(pMD?l8-T Vector Cloning Kit,IMaRa)，挑取100个克隆进行测序分析(委托北京博轩 宏宇生物技术有限公司完成），根据测序结果显示，所测序列均为鸭物种，将测序结果与 NCBI数据库中鸭的C0I序列(Anas|KF751616.1)进行比对，发现存在碱基突变，突变结果刚 好影响酶切结果，测序结果如下（下划线粗体标记的为影响酶切结果的核酸突变位点）。^ 巧。序的T载体为模板，用实施例3筛选获得的通用引物为扩增引物，用PCR扩增试剂盒（Q5 化曲-Fidelity Kit,肥B)分别扩增出不同物种的C0I序列，PCR的反应条件遵照PCR扩增试 剂盒说明书进行设定。按照实施例4确定的酶切反应条件对PCR产物进行酶切，按照实施例4 所示的DHPLC分析条件和上样量对酶切产物进行分析，所获得的酶切图谱与图4中的（1)完 全重合，最终确认，样本二为鸭肉样本，同时将样本二的酶切图谱录入阳性样本图谱库。
[0094] 样品二的测序结果
[0095] 了cggataaataatatgagcttttgactcctcccaccatcattcctccttctactcgcctcatccactgtagaagctg gcgctggtacgggttgaaccgtatacccacctctagcaggcaacctagcccacgccggagcctcagtggacctggct atcttctcacttcacctggctggtgtctcctccatcctcggagccattaacttcattaccacagccatcaacataaa accccccgcactctcacaataccaaaccccacttttcgtctgatcagtcctaattaccgccatcctgctcctcctat cactccccgtcctcgccgccggcatcacaatgctactaaccgaccgaaacctaaacaccacattctttgatcctgcc ggagggggagacccaatcctgtaccaacacctattttgattcttcggacatcccggaagtataa
[0096] 阳性样本库中鸭(Anas|KF751616.1)的序列
[0097] Cggataaaataatatgagcttttgactcctcccaccatcattcctccttctactcgcctcatccactgtagaagctg gcgctggtacgggttgaaccgtatacccacctctagcaggcaacctagcccacgccggagcctcagtggacctggct atcttctcacttcacctggctggtgtctcctccatcctcggagccattaacttcattaccacagccatcaacataaa accccccgcactctcacaataccaaaccccacttttcgtctggtcagtcctaattaccgccatcccgctcctcctat cactccccgtcctcgccgccagcatcacaatgctactaaccgaccgaaacctaaacaccacattctttgatcctgcc ggagggggagacccaatcctgtaccaacacctattttgattcttcggacatcccgaaagtttaa
[0098] 实施例8:样本=的动物源性成份分析
[0099] 样本=来源于市购标称为"牛肉"的肉制品。称取样本0.2g，使用基因组提取试剂 盒（TakaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0)提取样本基因 组，具体提取步骤按照试剂盒说明书进行，提取获得的基因组样本浓度用超微量核酸测定 仪化U0,购自于英国柏诺有限公司）测定，经测定，样品的基因组浓度为86ng/uL。用实施例3 筛选获得的通用引物为扩增引物，用PCR扩增试剂盒(Q甜i曲-Fidelity Kit,肥B)分别扩增 出不同物种的C0I序列，PCR的反应条件遵照PCR扩增试剂盒说明书进行设定。按照实施例4 确定的酶切反应条件对PCR产物进行酶切，按照实施例4所示的DHPLC分析条件和上样量对 酶切产物进行分析，酶切图谱见图5中的（1)。经比对，所获得酶切图谱与阳性物种图谱库中 的牛的酶切图谱（图5中的（2))不重合而与阳性物种图谱库中猪的酶切图谱（图5中的（3)) 完全重合(图5中的(4))，分析结果显示样品=为猪肉样本。为了验证检测结果的准确性，将 PCR产物测序(委托北京博轩宏宇生物技术有限公司完成），经过比对，测序结果显示该PCR 序列与猪(SUS scro化|K巧69218.1)的序列相似度为100%，本次检测结果正确。
[0100] 实施例9:样本四的动物源性成份分析
[0101] 样本四来源于市购标称为"驴肉"的肉制品。称取样本0.2g，使用基因组提取试剂 盒（TakaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0)提取样本基因 组，具体提取步骤按照试剂盒说明书进行，提取获得的基因组样本浓度用超微量核酸测定 仪化U0,购自于英国柏诺有限公司）测定，经测定，样品的基因组浓度为126ng/uL。用实施例 3筛选获得的通用引物为扩增引物，用PCR扩增试剂盒(Q5Hi曲-Fidelity Kit,肥B)分别扩 增出不同物种的C0I序列，PCR的反应条件遵照PCR扩增试剂盒说明书进行设定。按照实施例 4确定的酶切反应条件对PCR产物进行酶切，按照实施例4所示的DHPLC分析条件和上样量对 酶切产物进行分析，酶切图谱见图6中的（1)。经比对，所获得酶切图谱与阳性物种图谱库中 的驴和马的酶切图谱完全重合（图6中的（4))，分析结果显示样品四为马肉和驴肉混合样 本。为了进一步确定物种成份，将样品的PCR产物克隆至T载体(pMD?l8-T Vector Cloning Kit JaKaRa)，挑取100个克隆进行测序分析(委托北京博轩宏宇生物技术有限公司完成）， 根据测序结果显示，所测样本仅包含两种序列，一种与马化quus caballus IKT757764.1)的 序列相似度为100%，另一种与驴化quus asinus I X97337.1)的序列相似度为100%。本次检 测结果正确。
[0102 ]实施例10:样本五的动物源性成份分析
[0103] 样本五来源于市购标称为"驴肉"的肉制品。称取样本0.2g，使用基因组提取试剂 盒（TakaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0)提取样本基因 组，具体提取步骤按照试剂盒说明书进行，提取获得的基因组样本浓度用超微量核酸测定 仪化U0,购自于英国柏诺有限公司）测定，经测定，样品的基因组浓度为64ng/uL。用实施例3 筛选获得的通用引物为扩增引物，用PCR扩增试剂盒(Q甜i曲-Fidelity Kit,肥B)分别扩增 出不同物种的C0I序列，PCR的反应条件遵照PCR扩增试剂盒说明书进行设定。按照实施例4 确定的酶切反应条件对PCR产物进行酶切，按照实施例4所示的DHPLC分析条件和上样量对 酶切产物进行分析，酶切图谱见图7中的（1)。经比对，所获得酶切图谱与阳性物种图谱库中 的猪和马的酶切图谱（图7中的（4))完全重合，分析结果显示样品五为猪肉和马肉的混合 物。为了进一步确定物种成份，将样品的PCR产物克隆至T载体(pMD?l8-T Vector Cloning Kit JaKaRa)，挑取100个克隆进行测序分析(委托北京博轩宏宇生物技术有限公司完成）， 根据测序结果显示，所测样本仅包含两种序列，一种与马化quus cabal lus IKT757764.1)的 序列相似度为100%，另一种与猪(sus scrofa|KF569218.1)的序列相似度为100%。本次检 测结果正确。
[0104] 实施例11:样本六的动物源性成份分析
[0105] 样本六来源于市购标称为"羊肉"的肉制品。称取样本0.2g，使用基因组提取试剂 盒（TakaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0)提取样本基因 组，具体提取步骤按照试剂盒说明书进行，提取获得的基因组样本浓度用超微量核酸测定 仪化U0,购自于英国柏诺有限公司）测定，经测定，样品的基因组浓度为54ng/uL。用实施例3 筛选获得的通用引物为扩增引物，用PCR扩增试剂盒(Q5化曲-Fidelity Kit,肥B)分别扩 增出不同物种的C0I序列，PCR的反应条件遵照PCR扩增试剂盒说明书进行设定。按照实施例 4确定的酶切反应条件对PCR产物进行酶切，按照实施例4所示的DHPLC分析条件和上样量对 酶切产物进行分析，酶切图谱见图8中的（1)。经比对，所获得酶切图谱与阳性物种图谱库中 的绵羊和猪的酶切图谱（图8中的(4))完全重合。分析结果显示样品六为猪肉和羊肉的混合 物。为了进一步确定物种成份，将样品的PCR产物克隆至T载体(pMD?l8-T Vector Cloning Kit JaKaRa)，挑取100个克隆进行测序分析(委托北京博轩宏宇生物技术有限公司完成）， 根据测序结果显示，所测样本仅包含两种序列，一种与绵羊(Ovis aries IKR868678.1)的序 列相似度为100%，另一种与猪(SUS scrofa|KF569218.1)的序列相似度为100%。本次检测 结果正确。
[0106] 实施例12:样本屯的动物源性成份分析
[0107] 样本屯来源于市购标称为"羊肉"的肉制品。称取样本0.2g，使用基因组提取试剂 盒（TakaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0)提取样本基因 组，具体提取步骤按照试剂盒说明书进行，提取获得的基因组样本浓度用超微量核酸测定 仪化U0,购自于英国柏诺有限公司）测定，经测定，样品的基因组浓度为10化g/uL。用实施例 3筛选获得的通用引物为扩增引物，用PCR扩增试剂盒(Q5Hi曲-Fidelity Kit,肥B)分别扩 增出不同物种的C0I序列，PCR的反应条件遵照PCR扩增试剂盒说明书进行设定。按照实施例 4确定的酶切反应条件对PCR产物进行酶切，按照实施例4所示的DHPLC分析条件和上样量对 酶切产物进行分析，酶切图谱见图9中的（1)。经比对，所获得酶切图谱与阳性物种图谱库中 羊和鸭的酶切图谱完全重合（图9中的（4))，分析结果显示样品屯为鸭肉和羊肉的混合物。 为了进一步确定物种成份，将样品的PCR产物克隆至T载体(pMD?l8-T Vector Cloning Kit JaKaRa)，挑取100个克隆进行测序分析(委托北京博轩宏宇生物技术有限公司完成）， 根据测序结果显示，所测样本仅包含两种序列，一种与绵羊(Ovis aries IKR868678.1)的序 列相似度为100%，另一种与鸭(Anas IKF751616.1)的序列相似度为100%。本次检测结果正 确。
[0108] 实施例13:样本八的动物源性成份分析
[0109] 样本八来源于市购标称为"羊肉"的肉制品。称取样本0.2g，使用基因组提取试剂 盒（TakaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0)提取样本基因 组，具体提取步骤按照试剂盒说明书进行，提取获得的基因组样本浓度用超微量核酸测定 仪化U0,购自于英国柏诺有限公司）测定，经测定，样品的基因组浓度为96ng/uL。用实施例3 筛选获得的通用引物为扩增引物，用PCR扩增试剂盒(Q5化曲-Fidelity Kit,肥B)分别扩 增出不同物种的C0I序列，PCR的反应条件遵照PCR扩增试剂盒说明书进行设定。按照实施例 4确定的酶切反应条件对PCR产物进行酶切，按照实施例4所示的DHPLC分析条件和上样量对 酶切产物进行分析，酶切图谱见图10中的（1)。经比对，所获得酶切图谱与阳性物种图谱库 中的绵羊、鸭和鸡的酶切图谱完全重合（图10中的（4))，分析结果显示样本八为羊肉、鸭肉 和鸡肉的混合物。为了进一步确定物种成份，将样品的PCR产物克隆至T载体(pMD?l 8-T Vector Cloning Kit,TaKaRa)，挑取100个克隆进行测序分析(委托北京博轩宏宇生物技术 有限公司完成），根据测序结果显示，所测样本仅包含S种序列，一种与绵羊(Ovis aries KR868678.1)的序列相似度为100%，一种与鸭(Anas IKF751616.1)的序列相似度为100%， 另一种与鸡(Gallus|KR347464.1)的序列相似度为100%。本次检测结果正确。
[0110] 虽然为了清楚的理解，已经借助于附图和实施例在一些细节上描述了上述发明， 但是说明书和实施例不应当被视为限制本发明的范围。本文中引用的所有专利和科学文献 的公开内容通过引用完整地清楚并入。
[0111] 参考文献：
[0112] 1、Teletchea，F.Molecular identification methods of fish species : reassessment and possible application.民ev.Fish Biol.Fisheries 2009,19,265- 293.
[0113] 2、民asmussen，民.S.;Morrissey，M.T.Application of DNA-based methods to identify fish and seafood substitution on the commer i c i a 1 market.Compr.Rev.Food Sci.Food Saf.2009,8,118-154.
[0114] 3、民osalee S.民asmussen Hellberg;Michael T.Morrissey.Advances in DNA- based techniques for the detection of seafood species substitution on the commercial market.Technology Review.2011,8(19),308-321.
[011日]4、A.A.Aida，Y.B.Qie Man,C.M.V丄.Wong,et al?'analysis of raw meats and fats of pigs using polymerase chain reaction for Halal authentication.Meat Science，2005，69:47-52.
[0116] 5、Abdel-Rahman，S.M.;El-Saadani，M.A.;Ashiy，K.M.，Haggag，A.S.
[0117] Detection of adulteration and identification of cat's，dog's，donkey's and horse's meat using species-specific PC民 and PC民一民FLP techniques.Australian Journal of Basic and Applied Sciences 2009,3(3)1716- 1719.
[0118] 6、Chandrika Murugaiah，Zainon Mohd Noor，Maimunah Mastakim，et al..Meat species identification and Halal authentication analysis using mitochondrial DM.
[0119] 7、Nadia Haider，Imad Nabulsi，Bassam Al-Safadi. Identification of meat species by PCR-RFLP of the mitochondrial COI gene.Meat Science.2012,90,490- 493.
[0120] 8、M.Eaqub Ali ? U.Hashim ? S.Mustafa ? Yaakob Bin Che Man.Swine-specific PC民一RFLP assay targeting mitochondrial cytochrome B gene for semiquantitative detection of pork in commercial meat products.Food Anal Methods .2012，5，613- 623.
[0121] 9、Abbas Doosti ? Payam Ghasemi Dehkordi ? Ebrahim 民ahimi.Molecular assay to fraud identification of meat products.J Food Sci Technol，2014,5(1): 148-152.
【主权项】
1. 一种分析肉制品的动物物种来源的方法，所述方法包括以下步骤： 1) 提取肉制品样品的基因组DNA; 2) 以所述基因组DNA为模板，使用通用COI引物对进行PCR扩增，得到PCR产物； 3) 将所述PCR产物进行酶切;和 4) 利用DHPLC对酶切产物进行分析， 其中步骤2)中所述的通用COI引物对的序列为(方向5'-3'): COI-F(正向引物）：CGNATAAAYAAYATRAGCTTYTGA COI-R(反向引物）：TANACTTCDGGRTGNCCRAARAATCA 其中： R表示A或G; Y表示C或T; D表示G或A或T; N表示A或T或G或C。2. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤3)中进行酶切使用的内切酶为Hindlll和/或 HpaII〇3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述动物物种选自哺乳动物和禽类，优选选自反刍 动物、犬科动物、兔科、猫科和家禽，和优选选自绵羊、山羊、马、驴、兔子、猫、鼠、牛、猪、狐 狸、狗、絡、鹿、胳盤、鹤鹤、大雁、鹤子、鸡、鸭、火鸡和山鸡。4. 根据权利要求1所述的方法，其中在步骤3)中将获得的DHPLC的洗脱峰与同样条件下 确定的已知动物物种的DHPLC的洗脱峰进行比对，如果两者的洗脱峰重合，则指示所述肉制 品样品中存在来源于所述已知动物物种的成份。5. 根据权利要求1-4中任一项所述的方法，所述方法可用于分析所述肉制品样品中动 物源性成份组成。6. -种用于分析肉制品的动物物种来源的试剂盒，其包括针对哺乳动物和禽类的通用 C0I引物对，其中所述通用C0I引物对的序列为(方向5'-3'): C0I-F(正向引物）：CGNATAAAYAAYATRAGCTTYTGA COI-R(反向引物）：TANACTTCDGGRTGNCCRAARAATCA 其中： R表示A或G; Y表示C或T; D表示G或A或T; N表示A或T或G或C。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其还包含限制性内切酶Hind III和/或限制性内切酶 Hpa UK8. 根据权利要求6所述的试剂盒，其还包含标准DNA模板和/或PCR反应液，优选其中所 述标准DNA模板是含有已知动物物种的CO I序列的质粒或者基因组。9. 根据权利要求6所述的试剂盒，其还包含阳性样本酶切图谱库，所述阳性样本酶切图 谱库是指根据已知动物物种的C0I序列的质粒或者基因组作为模板，使用权利要求6中所述 的通用C0I引物进行扩增，所获得的PCR产物使用限制性内切酶Hind III和/或限制性内切 酶Hpa III进行酶切后的DHPLC洗脱峰图谱。10.根据权利要求6-9中任一项所述的试剂盒在分析肉制品的动物物种来源中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK106048034SQ201610515926
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月1日
【发明人】路勇, 姜洁, 宋丽萍, 毛婷, 张卫民, 郭淼, 胡智恺
【申请人】北京市食品安全监控和风险评估中心