一类glp?1r/gcgr双重激动剂在用于降糖和减肥药物中的运用
【专利摘要】本发明涉及与糖尿病与肥胖相关的药物领域，具体涉及胰高血糖素(Glu)相关的GLP?1R/GCGR双重激动剂、其制备方法、以及该类化合物为活性成分的药物组合物以及它们在制备抗糖尿病与肥胖药物中应用。
【专利说明】
一类GLP-1R/GCGR双重激动剂在用于降糖和减肥药物中的 运用
技术领域
[0001 ]本发明涉及药物化学领域，具体涉及一类胰高血糖素相关的GLP-1R/GCGR双重激 动剂制备用于降糖和减肥药物的应用。
【背景技术】
[0002] 肥胖是2型糖尿病、高血脂和高血压等的重要危险因素。目前全球有三分之一的人 超重或肥胖，预计到2025年将增加至5亿。目前关于肥胖的治疗主要通过手术治疗，有关肥 胖的治疗药物非常有限。
[0003] 胰高血糖素原基因位于2号染色体长臂，由6个外显子和5个内含子组成，在胰腺和 肠道L细胞内表达，生成由160个氨基酸组成的胰高血糖素原(proglucagon，PG)。胰高血糖 素原在胰腺和肠道中裂解后转化的产物不同。PG在肠道中主要裂解为：肠高血糖素 (Glicentin:PGl~69)，肠高血糖素分子继续裂解为GRPP(PG1~30)和胃泌酸调节素 (0叉71^〇111〇(1111丨11 :?633~69);插入肽-2(1?-2:?6111~123);胰高血糖素样肽-2(61^-2 : PG126~158);和GLP-1(1~37)-OH(PG72~108)。
[0004] 胰高血糖素 (Glu):含29个氨基酸组成的，胰脏胰岛α-细胞分泌的激素。肽序结构 为:HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT-OH。它能激活 GLP-1 受体(GLP-1R)和胰高血糖素受体 (GCGR)，其中对GCGR的激动活性远远强于对GLP-1R的激动活性，因此主要表现出GCGR激动 活性，表现出升糖效果，具有很好的减肥作用。
[0005] Glu是一种促进分解代谢的激素，作用途径如下：
[0006] Glu具有很强的促进糖原分解和糖异生作用，使血糖明显升高。胰高血糖素通过 cAMP-PK系统，激活肝细胞的磷酸化酶，加速糖原分解。加速氨基酸进入肝细胞，并激活糖异 生过程有关的酶系，糖异生增强，促进氨基酸的代谢分解。胰高血糖素还可激活脂肪酶，促 进脂肪分解，同时又能加强脂肪酸氧化，使酮体生成增多。胰高血糖素可促进胰岛素和胰岛 生长抑素的分泌。药理剂量的胰高血糖素可使心肌细胞内cAMP含量增加，心肌收缩增强。表 现出一定的生热作用，能一定程度降低体重。
[0007] 因此通过对Glu进行结构改造，改变两受体的激活比率，有可能使得激动GLP-1R表 现出降糖作用，很好的克服激活GCGR引起的升糖作用，并协同发挥降低体重效果。本发明基 于Glu，采用丙氨酸、半胱氨酸等定点替换方法，打破传统，获得更优减肥疗效并且具有很好 降糖效果的GLP-1R/GCGR双重激动剂多肽药物。
【发明内容】
[0008] 本发明涉及一类胰高血糖素相关的GLP-1R/GCGR双重激动剂。其序列为：
[0009] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Cys-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：1)；
[0010] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Cys-Asp-Ser-Arg- Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：2)；
[0011] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Cys-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：3)；
[0012] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID N0：4)；
[0013] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Cys-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：5)；
[0014] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Cys-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO: 6)
[0015] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Cys-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO: 7)
[0016] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Cys-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO: 8)
[0017] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Cys-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO: 9)
[0018] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Cys-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO：10)
[0019] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Cys-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO：11)
[0020] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Cys-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO：12)
[0021 ] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Ala-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：13)；
[0022] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Ala-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：14)；
[0023] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：15)；
[0024] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Ala-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：16)；
[0025] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO：17)
[0026] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Ala-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO：18)
[0027] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Ala-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO：19)
[0028] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Cys-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：20)
[0029] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Cys-Arg-Cys-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO:21)
[0030] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Arg-Arg-Cys-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO:22)
[0031] 本发明的第二个目的是提供了胰高血糖素相关的GLP-1R/GCGR双重激动剂多肽的 制备方法，本发明采用微波促进Fmoc/tBu正交保护固相合成策略高效快速地合成得到胰高 血糖素相关的GLP-1R/GCGR双重激动剂多肽的肽链。
[0032]本发明的优点在于：
[0033] 1.微波促进固相合成的胰高血糖素相关的GLP-1R/GCGR双重激动剂多肽的肽链大 大的提高了偶合反应速率，常规固相合成方法充分偶合一个氨基酸到树脂上去，往往需要2 小时到20小时不等，甚至更长。而微波促进则平均只需要10分钟左右;常规固相合成方法脱 Fmoc保护基，往往需要30分钟到1小时不等，而微波促进则平均只需要5分钟左右，这极大的 提高了多肽合成的效率，缩短了合成周期。
[0034] 2.微波促进固相合成胰高血糖素相关的GLP-1R/GCGR双重激动剂多肽得到肽链的 粗品的纯度大于60%，较常规固相合成方法大大提高，这方便了后续的纯化工作。
[0035] 3.微波促进固相方法合成GLP-1R/GCGR双重激动剂多肽，其成本低，由于偶合效率 较高，所需要保护氨基酸平均只需要2倍过量，较常规固相合成方法需要4到5倍过量大为降 低。
[0036] 4.微波促进固相合成GLP-1R/GCGR双重激动剂多肽的方法易于实现自动化、大规 模化，这使其更适合工业化生产。
[0037]因此用本发明提供的微波促进固相合成技术制备的GLP-1R/GCGR双重激动剂，收 率高、合成周期短、粗品纯化容易，生产成本低、易于工业自动化生产。制备得到的GLP-1R/ GCGR双重激动剂，协同发挥两受体的激动作用，克服了天然胰高血糖素可能引起高血糖的 风险，表现出更好的减肥和降糖效果。
【具体实施方式】
[0038]在本说明书全文中采用以下缩写：
[0039] Et3N:三乙胺；NMM:N-甲基吗啉；DIEAJ，^-二异丙基乙胺；DMF:二甲基甲酰胺； DMS0:二甲亚砜;DCM:二氯甲烷;Fmoc:N-9-芴甲氧羰基;DIC:N，N'_二异丙基碳二亚胺;CDI: N，N'_羰基二咪唑;DMAP:4-二甲氨基吡啶;H0SU:N-羟基琥珀酰亚胺;EDC.HC1:1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐;HATU:2-(7-偶氮苯并三氮唑)-Ν,Ν,Μ，^_四甲基脲六 氟磷酸酯;HBTU:苯并三氮唑-Ν,Ν,Υ-四甲基脲六氟磷酸酯;HCTU: 6-氯苯并三氮唑-1， 1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯;Η0ΑΤ: 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑;Η0ΒΤ: 1-羟基-苯并三氮唑； PyBOP:六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷;HPLC:高效液相色谱;ESI-MS:电喷雾 质谱;Gly:甘氨酸;Ser:丝氨酸;Ala:丙氨酸;Thr:苏氨酸;Val:缬氨酸；Ile:异亮氨酸;Leu: 亮氨酸;Tyr:酪氨酸;Phe:苯丙氨酸;Hi s:组氨酸;Pro:脯氨酸;Asp:天门冬氨酸;Met:蛋氨 酸;Glu:谷氨酸;Trp:色氨酸;Lys:赖氨酸;Arg:精氨酸。Asn:天冬酰胺;Gin:谷氨酰胺。 [0040]本发明是通过下列实施例来进行说明的，但这些实施例不做任何限制本发明的解 释。
[0041 ] 实施例1
[0042] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Cys-Leu-Asp-Ser-Arg- Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO: 1)的微波促进固 相合成
[0043] (1)树脂的溶胀
[0044] 称取Fmoc-Rink amide-MBHA Resin 50mg(取代量0 · 4mmol/g)，经7mL DCM溶胀 30min，抽滤去DCM，再用lOmL NMP溶胀30min，最后分别用NMP，DCM，NMP 7mL冲洗干净。
[0045] (2)微波促进Fmoc保护基的脱除
[0046] 将溶胀好的树脂放入反应器中，加入7mL含0.1M Η0ΒΤ的25%哌啶/NMP(V/V)溶液， 在微波反应器中反应lmin，微波功率为15W，反应温度控制在50°C以内，使用空气压缩机压 缩空气冷却，反应结束后滤去溶液;再加入7mL含0.1M Η0ΒΤ的25%哌啶/NMP(V/V)溶液在微 波反应器中再反应4min，微波功率为25W，反应温度控制在50°C，使用空气压缩机压缩空气 冷却。反应结束后滤去溶液，用NMP洗涤干净。得到脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂。
[0047] (3)微波促进Fmoc-Thr(tBu)-Rink amide-MBHA Resin的合成
[0048] 将Fmoc-Thr(tBu)-OH(0·04mmo1)，HBTU(0·04mmo1)，Η0ΒΤ(0·04mmo1)和DIPEA (0.08mmol)溶于lOmL NMP中，再将此溶液加入上面的树脂中，在微波反应器中反应7min，微 波功率为25W，反应温度控制在50°C，使用空气压缩机压缩空气冷却。反应结束后滤除反应 液，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。
[0049] (4)偶合效率的检测
[0050]用茚三酮法或者溴酚兰法定性检测树脂的偶合效率，显色反应为阴性即可进入下 一个偶合循环。
[0051 ] 茚三酮法:取少量树脂颗粒用乙醇洗涤，放入透明小瓶中加入5 %茚三酮乙醇、KCN 吡啶溶液(2ml 0.001M KCN稀释于98ml吡啶中）、80 %苯酚乙醇溶液各2滴，于100°C加热5分 钟，如果树脂显蓝色即为阳性。
[0052] 溴酚兰法:取少量树脂颗粒用二甲酰乙酰胺洗涤，放入透明小瓶中加入3滴1 %的 溴酚蓝二甲基乙酰胺溶液，常温下振摇3分钟，如果树脂显蓝色即为阳性。
[0053] (5)肽链的延长
[0054]按照多肽的序列，重复上述脱保护和偶合的步骤依次连接上相应的氨基酸，偶合 微波促进反应时间5~20min不等。得到连有Cys13-Glu-NH2的树脂。
[0055] (6)树脂上多肽的裂解
[0056]将上述得到的连有（SEQ. ID NO: 1)多肽序列的树脂放入反应瓶中，各加入裂解剂 Reagent K( TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/ED T，82 · 5: 5 : 5 : 5: 2 · 5，V/V) 1 OmL，先在0 °C 下振摇 3〇min，再在常温下反应3h。反应结束后抽滤，加少量TFA和DCM洗涤三次，合并滤液。将滤液 加入大量的冰乙醚中析出白色絮状沉淀，冷冻离心得到目标多肽的粗品。最终得到Cys 13-GI11NH2粗品 63 · 2mg，收率为94 · 3 %。
[0057]将上述多肽粗品溶于2mL水中，直接进制备液相色谱纯化，色谱条件为:C18反相柱 (320mmX28mm，5ym);流动相Α:0· 1 %TFA/水(V/V)，流动相Β:0· 1 %TFA/乙腈(V/V);流动相 梯度:流动相B 40%~90%，20min;流速为6mL/min检测波长为214nm。收集的溶液冻干得 纯品3011^。理论相对分子质量为3421.7』51-]\^111/2 4〇1111(1[]\1+3!1]3+1141.0，[]\1+4!1]4+ 855.9;calcu[M+3H]3+l 141.6，[M+4H]4+856.4。
[0058] 实施例2~22
[0059] 根据实施例1所述的方法，根据相应的序列合成得到实施例2~22的胰高血糖素相 关的GLP-1R/GCGR双重激动剂多肽通过电喷雾质谱(ESI-MS)确证各自的分子量。
[0060] 实施例2
[0061 ] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Cys-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID N0：2)；
[0062] 理论相对分子质量为3471 · 7iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 158 · 0，[M+4H]4+868 · 6; calcu[M+3H]3+l 158· 2，[M+4H]4+868·9〇
[0063] 实施例3
[0064] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Cys-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID N0：3)；
[0065] 理论相对分子质量为3468 · 6iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 157 · 5，[M+4H]4+868 · 3; calcu[M+3H]3+l 157· 2，[M+4H]4+868·6〇
[0066] 实施例4
[0067] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID N0：4)；
[0068] 理论相对分子质量为3495 · 6iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 166 · 2，[M+4H]4+875 · 0; calcu[M+3H]3+l 166· 2，[M+4H]4+874·9〇
[0069] 实施例5
[0070] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Cys-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID N0：5)；
[0071 ]理论相对分子质量为3426 · 5iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 143 · 8，[M+4H]4+858 · 3; calcu[M+3H]3+l 143· 2，[M+4H]4+857 ·6〇
[0072] 实施例6
[0073] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Cys-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID NO：6)
[0074] 理论相对分子质量为3426 · 5iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 144 · 6，[M+4H]4+857 · 6; calcu[M+3H]3+l 143· 2，[M+4H]4+857 ·6〇
[0075] 实施例7
[0076] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Cys-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID NO:7);
[0077] 理论相对分子质量为3513 · 8iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 172 · 1，[M+4H]4+879 · 0; calcu[M+3H]3+l 172 · 3，[M+4H]4+879 · 5〇
[0078] 实施例8
[0079] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Cys-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID NO:8);
[0080] 理论相对分子质量为3456 · 6dESI-MS m/z :found[M+3H]3+l 153 · 2，[M+4H]4+865 · 2; calcu[M+3H]3+l 153· 2，[M+4H]4+865 · 2〇
[0081 ] 实施例9
[0082] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg- Arg-Ala-Gln-Cys-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID NO:9);
[0083] 理论相对分子质量为3469 · 8iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 157 · 3，[M+4H]4+867 · 6; calcu[M+3H]3+l 157 · 6，[M+4H]4+868 · 5〇
[0084] 实施例10
[0085] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Cys-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID NO：10)；
[0086] 理论相对分子质量为3437 · 7 iSI-MS m/z : found[M+3H]3+l 146 · 4，[M+4H]4+860 · 3; calcu[M+3H]3+l 146 · 9，[M+4H]4+860 · 4。
[0087] 实施例11
[0088] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Cys-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ.ID NO：11)；
[0089] 理论相对分子质量为3485 · 8iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 162 · 6，[M+4H]4+872 · 2; calcu[M+3H]3+l 162·9，[M+4H]4+872·4。
[0090] 实施例12
[0091 ] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Cys-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID NO：12)；
[0092] 理论相对分子质量为3456 · 8iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 153 · 0，[M+4H]4+865 · 1; calcu[M+3H]3+l 153· 2，[M+4H]4+865 · 2〇
[0093] 实施例13
[0094] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Ala-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：13)；
[0095] 理论相对分子质量为3389 · 7iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 130 · 6，[M+4H]4+848 · 2; calcu[M+3H]3+l 130 · 9，[M+4H]4+848 · 4〇
[0096] 实施例14
[0097] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Ala-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：14)；
[0098] 理论相对分子质量为3439 · 7iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 147 · 5，[M+4H]4+860 · 8; calcu[M+3H]3+l 147·6，[M+4H]4+860 ·9〇
[0099] 实施例15
[0100] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：15)；
[0101 ]理论相对分子质量为3347 · 8 ASI-MS m/z : found[M+3H]3++l 146 · 7，[M+4H]4+860 · 4; calcu[M+3H]3+l 146 · 9，[M+4H]4+860 · 5 〇
[0102] 实施例16
[0103] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Ala-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：16)；
[0104] 理论相对分子质量为3396 · 7iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 133 · 0，[M+4H]4+850 · 1; calcu[M+3H]3+l 133· 2，[M+4H]4+850 · 2〇
[0105] 实施例17
[0106] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：17)
[0107] 理论相对分子质量为3437 · 8iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 146 · 6，[M+4H]4+860 · 4; calcu[M+3H]3+l 146 · 9，[M+4H]4+860 · 5 〇
[0108] 实施例18
[0109] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Ala-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：18)
[0110] 理论相对分子质量为3405 · 7iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 136 · 0，[M+4H]4+852 · 3; calcu[M+3H]3+l 136· 2，[M+4H]4+852·4。
[0111] 实施例19
[0112] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Ala-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO：19)
[0113] 理论相对分子质量为3453 · 8 iSI-MS m/z : found[M+3H]3+l 152 · 1，[M+4H]4+864 · 1; calcu[M+3H]3+l 152 · 3，[M+4H]4+864 · 4〇
[0m] 实施例20
[0115] His-Ser-Gln-Gly-Thr-phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Cys-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：20)
[0116] 理论相对分子质量为3444 · 8 iSI-MS m/z : found[M+3H]3+l 149 · 2，[M+4H]4+862 · 1; calcu[M+3H]3+l 149· 3，[M+4H]4+862· 2〇
[0117] 实施例21
[0118] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Cys-Arg-Cys-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO:21)
[0119] 理论相对分子质量为3460 · 8iSI-MS m/z :found[M+3H]3+l 154 · 5，[M+4H]4+866 · 1; calcu[M+3H]3+l 154 · 6，[M+4H]4+866 · 2〇
[0120] 实施例22
[0121 ] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Arg-Arg-Cys-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO:22)
[0122] 理论相对分子质量为3530 · 0 iSI-MS m/z : found[M+3H]3+l 177 · 4，[M+4H]4+883 · 2; calcu[M+3H]3+l 177 · 6，[M+4H]4+883 · 5〇
[0123] 实施例23
[0124] GLP-1R/GCGR双重激动剂的GLP-1R和GCGR受体激动活性筛选
[0125] HEK293细胞分别共转染编码GLP-1R或GCGR的cDNA，细胞系表达并利用Western Blot检测已构建的HEK293细胞中GLP-1R或GCGR的蛋白水平，以考察是否建立了稳定高表达 细胞株HEK293。
[0126] 测定化合物的试验中，提前2h将细胞种于96孔板中，化合物用DMS0溶解，使用含有 0.1 %牛血清蛋白的培养基稀释至不同倍数，加入共转染的细胞中。细胞孵化20min后，使用 Cisbo公司的ELI SA试剂盒，使用酶标仪测定荧光读数，建立标准曲线将荧光读数转化为相 应的cAMP数值，使用Graphpad Prism 5.0软件的非线性回归计算化合物的EC5Q数值。
[0127] 如表1所示，得到的绝大部分化合物较原型胰高血糖素相比，对GLP-1R的激动活性 有不同程度的提高，而略降低了GCGR的激动活性。其中SEQ. ID NO: 4和SEQ. ID NO: 16对GLP-1R激动活性提高明显，分别提高了 7.17和9.68倍。
[0128] 表1 GLP-1R/GCGR双重激动剂对GLP-1R和GCGR激动活性
[0129]
[0130] 实施例24
[0131 ] GLP-1R/GCGR双重激动剂多肽的体内降血糖活性
[0132]同时给予葡萄糖、受试化合物：10周龄雄性ICR小鼠，随机分组，每组6只。只给饮 水，禁食过夜。一组按照小鼠体重每千克腹腔注射18mmo 1的葡萄糖溶液(浓度20 % )和生理 盐水;其他组按照小鼠体重每千克腹腔注射18mmo 1的葡萄糖溶液和Ιμπιο 1 /L的胰高血糖素 类化合物溶液。在〇，15，30，45，60min用血糖仪测定血糖水平。
[0133] 如表2所示，绝大部分GLP-1R/GCGR双重激动剂多肽其体内降血糖活性明显提高。 其中SEQ. ID N0:4和SEQ. ID N0:5表现出明显的降糖活性，很好的克服了Glu的升糖风险，与 这些化合物有较好的GLP-1R激动活性，而适度降低了 GCGR激动活性有关。
[0134]表2胰高血糖素相关的GLP-1R/GCGR双重激动剂降血糖效应
[0135]
[0136] n = 6, X±S-*P<0.05,**P<0.01 ,***P<0.001 vs saline as control
[0137] 实施例25
[0138] 胰高血糖素相关的GLP-1R/GCGR双重激动剂长期给药体内控制体重活性
[0139] 雄性清洁级小鼠16_20g，随机分组，8只为一组，共8组。适应性喂养2周，饲养期间， 皮下给生理盐水0.25ml，使小鼠适应。给药前一天为第0天，第0天晚上小鼠禁食不禁水，次 日腹腔给药后，正常给食给水。分别在第3,5,7,9,11和13天继续给药（重复第1天实验方 案），测试第14天各组小鼠的空腹体重，考察各组小鼠的平均体重变化。
[0140] 由表3可以看出，由于选取的小鼠是8周龄小鼠还处于生长期，因此所有给药组小 鼠体重均增加。绝大部分化合物体重增加值缓慢，表现出明显的控制体重增长，尤其以 SEQ.ID N0:4、SEQ.ID N0:5、SEQ.ID N0:7、SEQ.ID N0:15和SEQ.ID N0:16控制体重最显著， 明显优于对照Glu和0ΧΜ，该结果与我们所获得的化合物具有较好的GLP-1R/GCGR的激动活 性数据相一致。
[0141 ]表3胰高血糖素相关的GLP-1R/GCGR双重激动剂的长期给药体重变化情况
[0142]
[0144] *ρ<0·05，**ρ<0·01 and***p<0.001 compared with respective saline controls；#p<0.05?##p<0.01 and###p<0.001 compared with Glu〇
【主权项】
1. 一种含有式I结构的GLP-1R/GCGR双重激动剂，其序列为： His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Xaai-Xaa2-Xaa3-Xaa4~Xaa5-Xaa6 _Xaa7_Xaa8_Xaa9_Xaaio_Xaan _Xaai2_Trp_Leu_Met_Asn _Thr_NH2 (式I) Xaai: Ala，Cys 或 Tyr Xaa2: Ala，Cy s 或 Leu Xaa3: Ala，Cy s 或 Asp Xaa4:Cys 或 Ser Xaas: Ala，Cy s 或 Arg Xaa6:Cys 或 Arg Xaa7：Ala?^cCys Xaa8:Gys 或 Gin Xaa9: Ala，Cy s 或 Asp Xaaio: Ala，Cys 或 Phe Xaaii :Ala，Cys 或 Val Xaai2:Cys 或 Gin 在所述SEQ. ID NO: 1 多肽的氨基酸位置Xaai、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、 Xaa9、Xaaio、Xaaii、Xaai2中的1或2个氨基酸取代。2. 根据权利要求1所述的多肽，具有如下序列： His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Cys-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：1)； His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Cys-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH 2(SEQ.ID NO：2)； His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Cys-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH 2(SEQ.ID NO：3)； His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID N0：4)； His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Cys-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID N0：5)； His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Cys-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO： 6) His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Cys-Gln -Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO： 7) His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Cys-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO: 8) His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Cys-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH 2(SEQ.ID NO:9) His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Cys-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO：10) His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg- Ala-Gln-Asp-Phe-Cys-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO：11) His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Cys-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO： 1 2) His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-ThT-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Ala-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH 2(SEQ. ID NO：13)； His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Ala-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：14)； His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH 2(SEQ. ID NO：15)； His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Ala-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ. ID NO：16)； His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH 2(SEQ.ID NO:17) His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Ala-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH 2(SEQ.ID NO：18) His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Ala-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr~NH2(SEQ. ID NO：19) His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Cys-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH 2(SEQ.ID NO：20) His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Cys-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH 2(SEQ.ID NO：21) His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Arg-Arg-Cys-Gln -Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr_NH2(SEQ· ID NO:22) 〇3. -种药物组合物，包括治疗有效量的权利要求1和2中所述的GLP-1R/GCGR双重激动 剂和其药学上可接受的盐。4. 一种药物组合物，包括治疗有效量的权利要求1和2中所述的GLP-1R/GCGR双重激动 剂和药学上可接受的载体或稀释剂。5. 权利要求1和2中所述的GLP-1R/GCGR双重激动剂和其药学上可接受的盐在制备用于 降糖和减肥药物中的运用。6. 权利要求1和2中所述的GLP-1R/GCGR双重激动剂和药学上可接受的载体或稀释剂在 制备用于降糖和减肥药物中的运用。7. 权利要求1和2中所述的GLP- 1R/GCGR双重激动剂的制备方法，包括生物表达、液相合 成和固相合成制备方法。
【文档编号】A61P3/10GK106084031SQ201610397275
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月2日 公开号201610397275.2, CN 106084031 A, CN 106084031A, CN 201610397275, CN-A-106084031, CN106084031 A, CN106084031A, CN201610397275, CN201610397275.2
【发明人】黄文龙, 钱海, 周洁, 戴雨轩, 孙李丹
【申请人】中国药科大学