本发明涉及纳米材料制造领域，尤其涉及一种利用微波辅助法制备罗丹明杂化的碳点的方法及应用该纳米材料进行细胞内线粒体靶向识别的方法。
背景技术：
经过十几年的发展，碳点（cds）作为一种新型的光致发光纳米材料，以其独特的光电性质，在生物标记、癌症诊断、荧光传感、太阳能电池等发面有了广泛的应用。和传统的半导体量子点（cdte，cdse，pbs）相比，碳点以其毒性低、环境友好、光稳定性强、制备方法简单等优势在生物标记领域成为研究热点，并被认为是一种最理想的荧光标记和检测材料。
在碳点“自下而上”的合成方法中，前体分子的选择尤为重要，它们在一定程度上决定了合成目标碳点的性质以及应用情况。目前，人们选用常见的有机小分子，包括柠檬酸、糖类和胺类等作为碳源，通过水热、微波、超声、等离子体处理等方式合成了一系列荧光性质良好的碳点（参见：zhu,s.j.;meng,q.n.;wang,l.;zhang,j.h.;song,y.b.;jin,h.;zhang,k.;sun,h.c.;wang,h.y.；yang,b.angew.chem.int.ed.,2013,52,3953;pan,l.l.；sun,s.;zhang,a.d.；jiang,k.;zhang,l.;dong,c.q.;huang,q.;wu,a.g.;lin,h.w.adv.mater.,2015,27,7782.）。但是，这些碳点的发光性质在设计之初是无法准确预知的。早期，人们在研究碳点荧光发光机理的时候，将其归因于碳点表面的缺陷或氧化程度（参见：ding,h.;yu,s.b.;wei,j.s.;xiong,h.m.acsnano,2016,10,484.）。2012年以后，人们以柠檬酸和氨基乙醇、硫醇等反应为例开展了碳点的发光基团结构的初步探讨，通过简单的有机反应确定了发光基团的基本结构（参见：krysmann,m.j.;kelarakis,a.;dallas,p.;giannelis,e.p.j.am.chem.soc.,2012,134,747;song,y.b.;zhu,s.j.;zhang,s.t.;fu,y.;wang,l.;zhao,x.h.；yang.b.j.mater.chem.c,2015,3,5976.）。研究表明，具有较高量子产率的碳点发光中心通常含有分子荧光团。然而，对于大多数碳点来说，它们普遍荧光发射波长较短，大多在蓝光范围内，在生物领域内应用易受背景光干扰。所以，基于分子荧光团杂化碳点的方法，开发出具有长波长荧光的碳点，并应用于生物识别是具有重要意义的。
罗丹明染料以其摩尔消光系数大、荧光量子产率高、光稳定性强等优势在荧光标记、荧光探针等方面具有广泛的应用。将罗丹明荧光团杂化到碳点的内部或表面，可以可控的得到产率高、具有特定识别性质的罗丹明杂化碳点（rho-cds）。
线粒体作为细胞生命活动的能量提供者，其失调与人类的多种疾病相关，如心血管疾病、帕金森氏症以及恶性肿瘤等。带有正电荷的罗丹明分子易于富集到线粒体中。因此，rho-cds也同样具有富集到线粒体，实现细胞内线粒体成像的作用。
技术实现要素：
本发明提出一种制备罗丹明分子荧光团杂化碳点的方法，该方法操作简单、原料易得、绿色环保。本发明还涉及该碳点的应用，即可以应用于细胞中线粒体靶向识别。
实现本发明的技术方案是：一种罗丹明杂化碳点的制备方法，步骤如下：
（1）将柠檬酸与间氨基苯酚类化合物混合溶于蒸馏水中，配制成前体溶液，放置于微波反应管中；
（2）将步骤（1）中的微波反应管放置于微波反应器中，将该前体溶液加热到120-160℃，反应0.5-6h，得到的产品自然冷却至室温；
（3）将步骤（2）冷却后的产品用0.22μm滤膜处理，去除大颗粒；再用截留量为3kda的超滤管处理，得到纯化后的rho-cds溶液；
（4）将步骤（3）得到的rho-cds溶液真空冷冻干燥，得到rho-cds固体粉末。
所述步骤（1）中间氨基苯酚类化合物为间氨基苯酚，间乙基氨基对甲苯酚，间二乙氨基苯酚和8-羟基久洛里定中的任意一种。
所述步骤（1）中柠檬酸与间氨基苯酚类化合物的摩尔比为（1:2）-（2:1）。
所述的罗丹明杂化碳点在线粒体靶向识别中的应用步骤如下：
（1）将细胞接种于共聚焦皿中，在37℃、5%co2、饱和湿度的细胞培养箱中培养12-24h，得到培养液a；
（2）将rho-cds加入到步骤（1）得到的培养液a中，在37℃、5%co2、饱和湿度的细胞培养箱中培养4h，得到培养液b；
（3）将线粒体染色剂rho123加入步骤（2）得到的培养液b中，孵育10min，得到培养液c；
（4）将核染试剂nucredtmlive647加入步骤（3）得到的培养液c中，孵育10min，得到混合液d；
（5）用磷酸盐缓冲液冲洗细胞，之后加入新鲜的不含酚红的细胞培养液；用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像。
所述步骤（1）中细胞为hela细胞、a549细胞、mcf7细胞和3t3细胞中的任意一种。
所述步骤（1）中共聚焦皿中细胞培养液由dmem高糖培养基、10%体积百分数的胎牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素组成。
所述步骤（2）中rho-cds加入后的浓度为50μg/ml。
所述步骤（3）中线粒体染色剂rho123加入后溶液的浓度为1μm。
所述步骤（5）中核染试剂nucredtmlive647加入后溶液的浓度为2drops/ml。
本发明的有益效果是：本发明利用微波辅助法，以常见的柠檬酸及间氨基苯酚类物质为原料，通过改变苯酚间位氨基形式，有效的调控荧光发射波长，成功将罗丹明分子荧光团生成并杂化入碳点，实现了可控的、可预测的荧光发射波长碳点的制备。该类rho-cds荧光性质优异，制备简单，环境友好。同时，该类碳点可以对细胞线粒体进行靶向识别，并具有进一步应用于线粒体相关疾病的研究中的价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1罗丹明杂化碳点（rho-cds）制备原理图及实物荧光照片。
图2为实施例1、2、3和4所制备rho-cds580、rho-cds520、rho-cds540和rho-cds600的紫外吸收光谱图。
图3为实施例1、2、3和4所制备rho-cds580、rho-cds520、rho-cds540和rho-cds600激发光谱图。
图4是实施例1、2、3和4所制备rho-cds580、rho-cds520、rho-cds540和rho-cds600荧光发射光谱图。
图5是实施例1制备的rho-cds580的透射电镜图。
图6是实施例1制备的rho-cds580的碳点粒径分布图。
图7实施例1制备的rho-cds580在不同激发波长下碳点荧光发射图谱（激发波长为470nm，480nm，490nm，500nm，510nm，520nm，530nm，540nm，550nm）。
图8实施例1制备的rho-cds580在细胞中线粒体靶向识别中的应用，及rho123、nucredtmlive6470染色图和叠加图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
rho-cds580的制备方法，包括以下步骤：
将30mg柠檬酸与12.9mg间二乙氨基苯酚（摩尔比=2:1）混合溶于2ml蒸馏水中，配制成前体溶液，放置于微波反应管中；将微波反应管放置于微波反应器中，将该前体溶液加热到160℃，反应2h；得到的产品自然冷却到室温；用0.22μm滤膜处理，去除大颗粒；再用截留量为3kda的超滤管处理，去除未反应完的原料，得到纯化后的rho-cds580溶液；将rho-cds580溶液真空冷冻干燥，得到rho-cds580固体粉末。rho-cds580溶液的紫外-可见光吸收光谱、激发光谱和荧光发射光谱见附图2-4。其电镜图及粒径分布图见附图5和6，其在不同激发下的荧光发射图见附图7，图7曲线从下往上与标号相对应，即470nm对应最下面曲线，其余类推。
实施例2
rho-cds520的制备方法：
将30mg柠檬酸与8.5mg间氨基苯酚（摩尔比=2:1）混合溶于2ml蒸馏水中，配制成前体溶液。其余步骤如实施例1。rho-cds520溶液的紫外-可见光吸收光谱、激发光谱和荧光发射光谱见附图2-4。
实施例3
rho-cds540的制备方法：
将30mg柠檬酸与11.8mg间乙基氨基对甲苯酚（摩尔比=2:1）混合溶于2ml蒸馏水中，配制成前体溶液。其余步骤如实施例1。rho-cds540溶液的紫外-可见光吸收光谱、激发光谱和荧光发射光谱见附图2-4。
实施例4
rho-cds600的制备方法：
将30mg柠檬酸与14.8mg8-羟基久洛里定（摩尔比=2:1）混合溶于2ml蒸馏水中，配制成前体溶液。其余步骤如实施例1。rho-cds600溶液的紫外-可见光吸收光谱、激发光谱和荧光发射光谱见附图2-4。
实施例5
rho-cds580的制备方法，包括以下步骤：
将7.5mg柠檬酸与12.9mg间二乙氨基苯酚（摩尔比=1:2）混合溶于2ml蒸馏水中，配制成前体溶液，放置于微波反应管中；将微波反应管放置于微波反应器中，将该前体溶液加热到120℃，反应6h；得到的产品自然冷却到室温；用0.22μm滤膜处理，去除大颗粒；再用截留量为3kda的超滤管处理，去除未反应完的原料，得到纯化后的rho-cds580溶液；将rho-cds580溶液真空冷冻干燥，得到rho-cds580固体粉末。
实施例6
rho-cds580的制备方法，包括以下步骤：
将15mg柠檬酸与12.9mg间二乙氨基苯酚（摩尔比=1:1）混合溶于2ml蒸馏水中，配制成前体溶液，放置于微波反应管中；将微波反应管放置于微波反应器中，将该前体溶液加热到140℃，反应0.5h；得到的产品自然冷却到室温；用0.22μm滤膜处理，去除大颗粒；再用截留量为3kda的超滤管处理，去除未反应完的原料，得到纯化后的rho-cds580溶液；将rho-cds580溶液真空冷冻干燥，得到rho-cds580固体粉末。
应用于细胞中线粒体的靶向识别，包括以下步骤：
将hela细胞接种于共聚焦皿中，在37℃、5%co2，饱和湿度的细胞培养箱中培养24h（细胞培养液包含dmem高糖培养基、10%体积百分数的胎牛血清，100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素）；将rho-cds580配制成溶液加入共聚焦皿中，使终浓度为50μg/ml，在37℃，5%co2，饱和湿度的细胞培养箱中培养4h；为了考察rho-cds580对线粒体靶向识别功能的准确性，在共聚焦培养皿中加入商业化线粒体染色剂rho123，终浓度为1μm，孵育10min；并将核染试剂nucredtmlive647加入共聚焦皿中，2d/ml，孵育10min；移去上述的混合液，用磷酸盐缓冲液冲洗细胞3遍，加入新鲜的不含酚红的dmem高糖细胞培养液。用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像。用波长为552nm的激光器照射，收取560-650nm范围内的荧光图像，对应为rho-cds580染色区域；用波长为488nm的激光器照射，收取500-550nm范围内的荧光图像，对应为商业化线粒体染色剂rho123染色区域；用波长为638nm的激光器照射，收取650-750nm范围内的荧光图像，对应为核染试剂nucredtmlive6470染色区域。结果图片见附图8。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。