一种基于硅罗丹明的近红外MOF荧光探针的制备和应用

一种基于硅罗丹明的近红外mof荧光探针的制备和应用
技术领域
1.本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及基于硅罗丹明的三磷酸腺苷近红外mof荧光探针的制备以及应用。


背景技术：

2.三磷酸腺苷(atp)主要产生于线粒体中，是生物体内的生命活动所需能量的来源(schulz g e.binding of nucleotides by proteins[j].curr.opin.in struc.biol.,1992,2,61-67；roberts j.control of the supply line[j].science,1997,278,2073-2074.)。它参与了各种蛋白质合成、能量传递、细胞呼吸、酶催化、信号传导等多种生理过程(szewcyk a,pikula s.adenosine 5
’‑
triphosphate:an intracelluar metabolic messenger[j].biochim.biophys.acta rev.cancer,1998,1365,333-353；zhou y,tozzi f,chen j,fan f,xia l,wang j,gao g,zhang a,xia x,brasher h,widger w,ellis l m,zhang w.intracellular atp levels are pivotal determinant of chemoresistance in colon cancer cells[j].cancer res.,2011,72.)。并且，细胞中atp浓度与许多疾病密切相关，例如缺血性损伤、血小板聚集、炎症和恶性肿瘤等，因此，可以将atp作为某些疾病的标志物来进行研究(morciano g,sarti a c,marchi s,missiroli s,falzoni s,raffaghello l,pistoia v,giorgi c,di virgilio f,pinton p.use of luciferase probes to measure atp in living cells and animals[j].nature protoc.,2017,12:1542；abraham e h,okunieff p,scala s,vos p,oosterveld m j s,chen a y,shrivastav b,guidotti g.cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and adenosine triphosphate[j].science,1997,275,1324-1326.)。开发一种简单而有效的atp检测方法，对于我们进一步了解和研究与atp相关的生理和病理过程是十分必要的。
[0003]
近年来，人们已经研发出了各种各样的方法用于atp检测，例如比色法、化学发光法、电化学分析法、荧光检测法等(li s,zhao x,yu x,wan y,yin m,zhang w,cao b,wang h.fe3o
4 nanozymes with aptamer-tuned catalysis for selective colorimetric analysis of atp in blood[j].anal.chem.,2019,91,14737-14742；yao w,wang l,wang h,zhang x,li l.an aptamer-based electrochemiluminescent biosensor for atp detection[j].biosens.bioelectron.,2009,24,3269-3274；xie h,chai y,yuan y,yuan r.highly effective molecule converting strategy based on enzyme-free dual recycling amplification for ultrasensitive electrochemical detection of atp[j].chem.commun.,2017,53,8368-8371.)。相比于其它检测方法，荧光法具有灵敏度高、选择性好、响应快和成像分辨率强等优点，被广泛用于生物的检测和分析(zhou y,xu z,yoon j.fluorescent and colorimetric chemosensors for detection of nucleotides,fad and nadh:highlighted research during 2004-2010[j].chem.soc.rev.,2011,40,2222-2235.)。然而，目前所报道的atp荧光探针大部分都存在亲水性不足、生物相容性差、合成复杂等缺点，很难达到生物活体成像的要求。因此，设计出一种能够用于生物体内检测atp水
平的近红外发射的荧光探针十分必要。
[0004]
沸石咪唑骨架(zifs)，作为金属有机框架(mofs)中的一个子类，是由金属离子和咪唑连接体自组装形成。由于其孔隙可调、结构可控、负载率高、生物相容性好、易于合成和功能化等优势，在催化、气体储存与分离、药物输送、生物成像和传感等领域被广泛研究和应用(khan n a,hasan z,jhung s h.beyond pristine metal-organic frameworks:preparation and application of nanostructured,nanosized,and analogous mofs[j].coordin.chem.rev.,2018,376,20-45；xu c,fang r,luque r,chen l,li y.functional metal
–
organic frameworks for catalytic applications[j].coordin.chem.rev.,2019,388,268-292；jiao l,wang y,jiang h l,xu q.metal-organic frameworks as platforms for catalytic applications[j].adv.mater.,2018,30,1703663.)。近年来大量的mof材料被报道用于药物、蛋白质、小分子染料包载。但是，利用其对生物体内的atp进行检测的报道较少。因此，将纳米材料和近红外荧光染料相结合，开发一种基于mofs的近红外荧光探针来检测生物体内的atp具有重要意义。


技术实现要素：

[0005]
根据所提出的要求，本发明人对此进行了深入研究，在付出大量创造性劳动后，提供了一种基于金属有机框架(zif-90)的三磷酸腺苷近红外纳米荧光探针。
[0006]
本发明的技术方案是，一种基于硅罗丹明的近红外mof荧光探针，其结构是由金属有机框架(zif-90)和硅罗丹明近红外荧光染料(sib)自组装而成。
[0007]
一种基于硅罗丹明的近红外mof荧光探针的制备方法。步骤如下：
[0008]
1)硅罗丹明近红外荧光染料(sib)的制备方法：在0℃，n2保护下，将1.5～2.5当量的3-br-n,n-二甲基苯胺加至装有60ml乙醚的200ml双口圆底烧瓶中，再加入1.5～2.5当量的正丁基锂，反应1.5～2.5h。将0.5～1.5当量的二氯二甲硅烷溶解到10ml的乙醚中，缓慢加入到上述反应中，待反应物逐渐恢复到室温后，反应过夜，加入50ml水淬灭反应。反应混合物用乙醚萃取，盐水洗净，无水硫酸钠干燥。粗产品用硅胶柱层析法提纯，洗脱液为石油醚:乙酸乙酯(80:1)，减压蒸馏除去溶剂，得到淡黄色油状中间产物(产率75％)。在15ml的封管中加入8～12当量的中间产物、40～60当量的2-甲酰苯甲酸和0.5～1.5当量的溴化铜，在140℃下搅拌反应5h；冷却至室温，将反应混合物溶解在二氯甲烷中，用2m naoh溶液萃取，有机层用盐水洗净，无水硫酸钠干燥。粗产品用硅胶柱层析法提纯，洗脱液为石油醚:乙酸乙酯:三乙胺(50:1:1)，减压蒸馏除去溶剂，得到无色针状晶体(产率45％)。
[0009]
2)基于硅罗丹明的近红外mof荧光探针(zif-90@sib)的制备方法：室温下，在90～110当量的二水合乙酸锌中加入2ml的n,n-二甲基甲酰胺使其完全溶解，同时，将180～220当量的咪唑-2-甲醛和0.5～1.5当量的近红外荧光染料sib完全溶解到另外一份2ml n,n-二甲基甲酰胺中，当上述两份溶液完全溶解后，将其充分混合，再放入超声波清洗机中，振荡4～6min，随后，加入6～8ml的n,n-二甲基甲酰胺，继续超声20min，使悬浊液中纳米颗粒进一步稳定，接着，将所得到的悬浊液以10000rpm的转速离心4～6min，上层液体舍弃，下层固体先用n,n-二甲基甲酰胺洗涤2～3次，再用无水乙醇洗涤8～12次，最后，将所得到的固体放入真空干燥箱中，在室温下，干燥24小时，得到灰白色固体，即为所述的荧光探针。
[0010]
本发明的有益效果是，一种基于硅罗丹明的近红外mof荧光探针对三磷酸腺苷
(atp)具有良好的光谱响应性能。首先，研究了该探针的荧光光谱性质。加入atp之前，探针本身没有明显的荧光发射；加入atp之后，在近红外区(670nm)出现了明显的荧光发射峰。随着atp浓度的增大，探针分子的近红外荧光强度不断增强。当加入7mm的atp时，荧光强度增强8.5倍，因此该探针可以用来检测atp。该探针的荧光增强变化在1mm到7mm检测范围内与atp的浓度呈线性关系，说明该探针在此范围内可以通过检测荧光强度来反映atp浓度。其次，研究了探针的紫外吸收光谱。在没有加入atp时，探针无紫外吸收；加入atp后，探针在640nm处出现吸收峰。接着，研究探针的选择性，考察探针与其他核苷酸(adp,amp,gtp,ctp,utp)，生物体中常见的离子(p3o
105-,p2o
74-,h2po
4-,hpo
42-,cl-,so
42-,no
3-,ch3coo-,co
32-)，以及检测物(atp)的荧光响应情况。结果发现，atp能引起荧光光谱强烈改变，其他检测物对探针的荧光光谱影响不大。然后，研究了ph值对荧光探针测定atp的影响，当ph值介于5.0到8.0之间时，不影响荧光探针对atp的测定。此外，该荧光探针响应迅速，响应时间在500s以内。
[0011]
一种三磷酸腺苷近红外荧光探针的应用。在对照组细胞中观察不到明显的荧光，当细胞中加入荧光探针后，可以观察到较强的荧光，这说明探针能够检测到细胞中存在的atp。当细胞用三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)预处理清除细胞内产生的atp后，发现荧光明显减弱。这些结果说明：荧光探针能够检测到细胞内atp含量的变化。这为监控活细胞内atp的水平提供一种可靠的手段。
附图说明
[0012]
图1为荧光探针的制备路线及与atp作用示意图。
[0013]
图2为荧光探针与不同浓度的atp作用后的荧光光谱图。
[0014]
横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。荧光探针的浓度均为4mg/ml，atp浓度分别为：0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0mm。荧光激发波长为640nm，发射波长为650nm-800nm。
[0015]
图3为荧光探针对不同atp浓度的荧光线性关系图。
[0016]
图4为荧光探针与atp作用前后的紫外可见吸收光谱图。
[0017]
横坐标为波长，纵坐标为吸光度。荧光探针的浓度为4mg/ml，atp浓度为7mm。
[0018]
图5为荧光探针的选择性图。
[0019]
荧光探针的浓度为4mg/ml，atp浓度为7mm，其它分析物浓度均为7mm。
[0020]
图6为ph对荧光探针的影响图。
[0021]
图7为荧光探针与不同浓度atp作用后荧光强度随时间变化的关系曲线图。atp浓度分别为：1.0,2.0,4.0,7.0mm。
[0022]
图8为细胞毒性实验图。横坐标为荧光探针的浓度，纵坐标为细胞的存活率。
[0023]
图9(a)荧光探针与atp作用的细胞成像图；(b)相对荧光强度图。
具体实施方式
[0024]
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。
[0025]
实施例1：
[0026]
荧光探针的制备
[0027]
硅罗丹明近红外荧光染料(sib)的制备方法：在0℃，n2保护下，将2当量的3-br-n,
n-二甲基苯胺加至装有60ml乙醚的200ml双口圆底烧瓶中，再加入2当量的正丁基锂，反应3h。将1当量的二氯二甲硅烷溶解到10ml的乙醚中，缓慢加入到上述反应中，待反应物逐渐恢复到室温后，反应过夜，加入50ml水淬灭反应。反应混合物用乙醚萃取，盐水洗净，无水硫酸钠干燥。粗产品用硅胶柱层析法提纯，洗脱液为石油醚:乙酸乙酯(80:1)，减压蒸馏除去溶剂，得到淡黄色油状中间产物(产率75％)。在15ml的封管中加入10当量的中间产物、50当量的2-甲酰苯甲酸和1当量的溴化铜，在140℃下搅拌反应5h；冷却至室温，将反应混合物溶解在二氯甲烷中，用2m naoh溶液萃取，有机层用盐水洗净，无水硫酸钠干燥。粗产品用硅胶柱层析法提纯，洗脱液为石油醚:乙酸乙酯:三乙胺(50:1:1)，减压蒸馏除去溶剂，得到无色针状晶体(产率45％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.96(d,j＝7.5hz,1h),7.64(t,j＝7.4hz,1h),7.54(t,j＝7.5hz,1h),7.30(d,j＝7.6hz,1h),6.97(d,j＝2.9hz,2h),6.78(d,j＝8.9hz,2h),6.55(dd,j＝8.9,2.9hz,2h),2.96(s,12h),0.64(s,3h),0.61(s,3h).
[0028]
基于硅罗丹明的近红外mof荧光探针(zif-90@sib)的制备方法：如图1所示，室温下，在100当量的二水合乙酸锌中加入2ml的n,n-二甲基甲酰胺使其完全溶解，同时，将200当量的咪唑-2-甲醛和1当量的近红外荧光染料sib完全溶解到另外一份2ml n,n-二甲基甲酰胺中，当上述两份溶液完全溶解后，将其充分混合，再放入超声波清洗机中，振荡5min，随后，加入7ml的n,n-二甲基甲酰胺，继续超声20min，使悬浊液中纳米颗粒进一步稳定，接着，将所得到的悬浊液以10000rpm的转速离心5min，上层液体舍弃，下层固体先用n,n-二甲基甲酰胺洗涤3次，再用无水乙醇洗涤10次，最后，将所得到的固体放入真空干燥箱中，在室温下，干燥24小时，得到灰白色固体，即为所述的荧光探针。
[0029]
实施例2：
[0030]
荧光探针和atp溶液配制
[0031]
探针溶液的制备：称取一定量探针分散在蒸馏水中，配成4mg/ml的探针溶液。atp溶液的配制：称取一定量的腺苷-5'-三磷酸二钠盐溶解在蒸馏水中，配置成20mm的atp溶液，保存在4～8℃的环境中。
[0032]
实施例3：
[0033]
荧光探针与atp作用的荧光光谱的测定
[0034]
图2为荧光探针与atp作用的荧光光谱，荧光探针的浓度为4mg/ml，atp的浓度依次为0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0mm。激发波长固定为640nm，发射波长范围为650～800nm。狭缝宽度为5.0nm/5.0nm，所用的荧光测定仪器为日立f4600荧光分光光度计。从图2可以看出，加入atp之前，荧光探针没有明显的荧光发射；加入atp之后，在近红外区(670nm)出现了发射峰。这是因为atp与构成探针结构中的zn
2+
竞争性配位结合，导致探针的沸石咪唑结构崩塌，从而释放出包裹在其中的荧光团sib，并且发出近红外荧光。同时随着atp浓度的增大，探针分子的近红外荧光强度不断增强。当加入7mm的atp时，荧光强度增强8.5倍，因此可以用来检测atp。图3为探针对不同atp浓度的线性响应图。atp浓度范围在1.0～7.0mm时，探针的荧光强度与atp浓度呈现线性关系，说明探针可以在该浓度范围内定量检测atp。
[0035]
实施例4：
[0036]
荧光探针与atp作用的紫外可见吸收光谱的测定
[0037]
图4为荧光探针与atp作用前后的紫外可见吸收光谱图，荧光探针的浓度为4mg/ml，atp的加入量为7mm。紫外可见吸收光谱测定用的仪器为安捷伦cary60紫外可见分光光
度计。从图4中可以看出，在没有加入atp时，探针无明显吸收；加入atp后，探针在640nm处出现了吸收峰，且与sib本身的紫外吸收峰一致，说明atp导致探针结构崩坍，从而释放出荧光染料sib，产生了紫外吸收。
[0038]
实施例5：
[0039]
荧光探针对atp测定的选择性
[0040]
图5为荧光探针对atp测定的选择性图。考察在浓度为4mg/ml的荧光探针悬浊液中加入atp(7mm)及其他核苷酸类(adp,amp,gtp,ctp,utp)，和生物体中常见的离子(p3o
105-,p2o
74-,h2po
4-,hpo
42-,cl-,so
42-,no
3-,ch3coo-,co
32-)(7mm)的荧光响应情况。从图5中可以看出，只有atp能引起8.5倍的荧光增强，而其他检测物对探针的荧光强度没有明显影响。这些结果表明，荧光探针对atp有较好的选择性。
[0041]
实施例6：
[0042]
溶液ph值对荧光探针测定atp的荧光性质的影响
[0043]
考察ph值对荧光探针测定atp的荧光光谱的影响，其结果如图6。我们研究的ph范围为2.0～12.0，荧光探针的浓度为4mg/ml，atp的浓度为7mm。从图中可以看出，荧光探针在ph为5.0～8.0时，荧光强度基本不变，说明ph在此范围内对探针本身以及对探针检测atp没有影响，是比较合适的ph值范围。这非常有利于该探针用于实际样品中atp的测定。
[0044]
实施例7：
[0045]
荧光探针与atp作用的响应时间的测定
[0046]
我们研究了荧光探针对atp的响应时间，atp浓度依次为1.0,2.0,4.0,7.0mm，其结果如图7。从图中可以看出，该探针对各种浓度atp的响应时间均在500s以内，这能够满足在实际样品中进行实时监测的要求。从图7我们还可以看出，荧光强度达到最大值后，在之后的时间里，几乎不再发生变化，这表明此荧光探针光稳定性较好。
[0047]
实施例8：
[0048]
荧光探针在活细胞中的应用
[0049]
首先，我们做了细胞毒性试验，如图8所示。当加入0～100μg/ml荧光探针，细胞的成活率均在90％以上。这可以说明，该荧光探针毒性较小，可应用于检测活细胞内的atp。然后，我们研究荧光探针在活细胞中的应用，选择hela细胞进行共聚焦显微成像，结果如图9所示。在对照组细胞中，几乎没有观察到荧光。然后细胞中加入探针(4mg/ml)，可以观察到强烈荧光，说明荧光探针与细胞中的atp作用，产生了荧光。当在细胞中加入atp清除剂三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)预处理，再加入探针，发现细胞内荧光几乎消失。这些结果说明该探针能够检测到细胞内atp含量的变化，为监控活细胞内atp水平的动态变化提供了一种可靠的手段。