专利名称：苯反硝化降解菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株苯降解细菌及其应用，特别是涉及一株苯反硝化降解菌及其在受污染地下水治理中的应用。
背景技术：
石油及各种燃料油的溢洒和泄漏，以及地下储油设施(罐)的渗漏，导致地下水遭受芳香烃污染在全球范围内日渐严重(吴玉成，钟佐燊，张建立.反硝化条件下微生物降解地下水中的苯和甲苯.中国环境科学，1999，19(6)505-509；黄国强，李鑫钢，李凌，李天成.地下水有机污染的原位生物修复进展.化工进展，2001，(10)13-16；李东艳，钟佐燊，鞠秀敏.地下水有机污染的天然生物恢复综述.焦作工学院学报，1999，18(4)267-270)。我国某些城市及油田地区地下水芳香烃污染亦较为严重并有不断恶化的趋势(王焰新，李连义，付素蓉，蔡鹤生.武汉市区第四系含水层地下水有机污染敏感性研究.地球科学-中国地质大学学报，2002，27(5)616-620；朱学愚，刘建立.山东淄博裂隙岩溶水中石油污染物分布和迁移特征.中国科学，2000，30(5)479-485)。苯和甲苯等单环芳香烃污染物是石油及各种燃料油中水溶性最好的化合物，构成了地下水中最常见的有机污染物(吴玉成，钟佐燊，张建立.反硝化条件下微生物降解地下水中的苯和甲苯.中国环境科学，1999，19(6)505-509)。苯对人体具有致癌作用(百万分之一致癌概率含量为0.67μg/L)，苯污染的地下水对人体健康构成了严重威胁(吴玉成，钟佐燊，陈亮.去除地下水芳香烃污染物实验室含水层土柱研究.长春科技大学学报，2000，30(1)61-64)，引起水文地质学者和环境学者的极大关注，成为近几年环境保护研究的热点问题之一。
以往地下水有机污染处理普遍采用抽出处理方法(pump and tread method)，但这种方法不但耗时而且费用极高，因此，自20世纪80年代以来，人们逐渐探索和开发出地下水原位生物恢复技术，这是目前处理地下水和包气带土层有机污染的最新方法(钟佐燊.地下水有机污染控制及原位恢复技术研究进展(一).水文地质工程地质，2001，(3)1-3；钟佐燊.地下水有机污染控制及原位恢复技术研究进展(二).水文地质工程地质，2001，(4)26-31)。其不但处理费用相对节省，而且还可以减少地表处理设施，最大程度地减少污染物的暴露，减少对环境的扰动，是一种很有前景的地下水污染处理技术(陈秀成，曹瑞钰.地下水污染治理技术的进展.中国给水排水，2001，17(4)23-26；胥思勤，王焰新.土壤及地下水有机污染生物修复技术研究进展.环境保护，2001，(2)22-23，37)。地下还原厌氧条件下如何去除地下水中有机污染物，是地下水原位生物恢复技术研究的焦点问题(吴玉成，钟佐燊，陈亮.去除地下水芳香烃污染物实验室含水层土柱研究.长春科技大学学报，2000，30(1)61-64；钟佐燊.地下水有机污染控制及原位恢复技术研究进展(一).水文地质工程地质，2001，(3)1-3)。
目前，厌氧生物处理研究大部分是微环境(microcosms)和富集培养基的实验室研究(钟佐燊.地下水有机污染控制及原位恢复技术研究进展(二).水文地质工程地质，2001，(4)26-31；Zheng Z，Breedveld G，Aagaard P.Biodegradationof soluble aromatic compounds of jet fuel under anaerobic conditionslaboratory batch experiments.Applied Microbiology and Biotechnology，2001，57(4)572-578)。以NO3-为电子受体的研究最多，并且已有些现场实验(钟佐燊，刘菲.地下水有机污染控制及原位恢复技术研究进展.水文工程地质工程，2001，(5)76-79，31；Cunningham J.A.，Hopkins G.D.，Lebron C.A.，Reinhard M.Enhanced anaerobic bioremediation of groundwater contaminated by fuelhydrocarbons at Seal Beach，California.Biodegradation，2000，11(2-3)159-170)。这是因为，对比厌氧条件下有机物降解的各种反应(反硝化、铁还原、硫酸盐还原、产甲烷反应等)，利用反硝化作用的生物降解技术最具实际意义(李东艳，钟佐燊，孔惠，刘菲，王艳玲.反硝化条件下苯生物降解的微环境研究.地球科学-中国地质大学学报，2000，25(5)493-497)反硝化菌为兼性厌氧菌，不要求严格的厌氧环境；反硝化反应产能高，仅次于以氧作为电子受体的氧化还原反应；硝酸盐易溶，把它作为添加电子受体时成本低。
实验室和野外的实验都证明，好氧条件下微生物可以降解苯(李东艳，钟佐燊，孔惠，刘菲，王艳玲.反硝化条件下苯生物降解的微环境研究.地球科学-中国地质大学学报，2000，25(5)493-497；Jindrova E.，Chocova M.，Demnerova K.，Brenner V.Bacterial aerobic degradation of benzene，toluene，ethylbenzeneand xylene.Folia Microbiologica，2002，47(2)83-93)，但厌氧反硝化条件下苯是否产生降解，目前有两种相反的结论(钟佐燊.地下水有机污染控制及原位恢复技术研究进展(二).水文地质工程地质，2001，(4)26-31；卢晓霞，陈亮.污水快速渗滤处理系统对某些微量有机污染物的净化.环境与开发，1997，12(2)4-7)。比较多的学者认为不能降解(钟佐燊.地下水有机污染控制及原位恢复技术研究进展(二).水文地质工程地质，2001，(4)26-31；Schreiber M.E.，Bahr J.M.Nitrate-enhanced bioremediation of BTEX-contaminated groundwaterparameterestimation from natural-gradient tracer experiments.Journal of ContaminantHydrology，2002，55(1-2)29-56)，因为苯环结构稳定，反硝化菌不能利用苯作为其唯一的碳源，但有些学者的研究证明在反硝化条件下苯可降解(Burland S.M.，Edwards E.A.Anaerobic benzene biodegradation linked to nitrate reduction.Applied and Environmental Microbiology，1999，65(2)529-533)。
我国学者吴玉成、李东艳(吴玉成，钟佐燊，陈亮.去除地下水芳香烃污染物实验室含水层土柱研究.长春科技大学学报，2000，30(1)61-64；李东艳，钟佐燊，孔惠，刘菲，王艳玲.反硝化条件下苯生物降解的微环境研究.地球科学-中国地质大学学报，2000，25(5)493-497)等开展了反硝化条件下苯的生物降解实验研究，证明苯在反硝化条件下可以产生降解。
国内外尚未见获得厌氧反硝化作用降解苯的反硝化菌纯菌株的报道。目前国内外的实验研究，都是用含有反硝化菌的土壤或者混合菌培养物进行反硝化菌的接种(李东艳，钟佐燊，孔惠，刘菲，王艳玲.反硝化条件下苯生物降解的微环境研究.地球科学-中国地质大学学报，2000，25(5)493-497；Lovley D.R.Anaerobicbenzene degradation.Biodegradation，2000，11(2-3)107-116)。限制深入了解苯厌氧降解的主要因素是缺乏苯厌氧降解微生物的纯培养物(Lovley D.R.Anaerobic benzene degradation.Biodegradation，2000，11(2-3)107-116)。
由于土著微生物对环境的适应性强，且污染过程已经历一段自然驯化期，因而是微生物降解的首选菌种。Roy(黄国强，李鑫钢，李凌，李天成.地下水有机污染的原位生物修复进展.化工进展，2001，(10)13-16)调查美国124个污染地点的生物修复实例发现，其中96处采用土著菌种，17处采用外来菌种，11处二者均有。
发明创造内容本发明的目的是提供一株苯反硝化降解菌。
本发明所提供的苯反硝化降解菌，是假单胞菌(Pseudomonas sp.)PAA，已于2004年02月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC №1091。
假单胞菌(Pseudomonas sp.)PAA CGMCC №1091自山东淄博市堠皋地区受苯污染的化工污水中分离得到。其菌落白色，光滑，湿润，凸起，直径2mm；菌株个体为杆状，宽为0.7-0.8μm，长1.4-1.8μm，革兰氏染色阴性，鞭毛数目1；氧化酶阳性，反硝化阳性，利用葡萄糖、果糖，不产生吲哚，不产生H2S，不需要生长因子。
本发明的假单胞菌(Pseudomonas sp.)PAA CGMCC №1091可在厌氧条件下反硝化降解苯，为厌氧反硝化作用苯降解机理的研究提供了重要的基础，将在污水治理，特别是地下水污染治理实践中发挥重要作用。
图1为假单胞菌(Pseudomonas sp.)PAA CGMCC №1091的苯降解性能柱状2为假单胞菌(Pseudomonas sp.)PAA CGMCC №1091代谢对硝酸盐影响柱状3为假单胞菌(Pseudomonas sp.)PAA CGMCC №1091对受污染地下水中苯降解的柱状4为假单胞菌(Pseudomonas sp.)PAA CGMCC №1091对受污染地下水中硝酸盐降解的柱状图具体实施方式
实施例1、假单胞菌(Pseudomonas sp.)PAA CGMCC №1091的分离、鉴定及其反硝化苯降解特性1、菌株的分离(1)采集样品现场采集山东淄博市堠皋地区受苯污染的化工污水样品后，用150ml茶色细口瓶盛装。水样装满瓶，保证没有氧气在运送途中溶解到水中。所有的水样瓶都放入法国BIOMERIEUX公司的96128 GENBOX Jar 7.01厌氧盒保存，装运回实验室。
(2)菌株分离用反硝化菌分离培养基进行纯种分离。反硝化菌分离培养基成分葡萄糖，1g；硝酸钠，2g；酒石酸钠，0.2g；CaCl2·2H2O，0.5g；琼脂，20g；去离子水，1000ml；PH，7.4-7.6。
按照微生物纯种分离的常规方法，在上述反硝化菌分离培养基中使用美国SHELLAB厌氧培养操作系统BACTRON1.5-2，于38℃厌氧培养，得到多株反硝化纯菌株。
将得到的多株反硝化纯菌株在以苯为唯一碳源的反硝化富集培养基上使用美国SHELLAB厌氧培养操作系统BACTRON1.5-2，38℃厌氧培养，进行筛选，再在液体培养基中进行验证，结果得到一株苯反硝化降解菌PM。所用的培养基为苯，0.1-0.2g；K2HPO4，0.5g；CaCl2·6H2O，0.5g；KNO3，1g；蒸馏水，1000ml；PH，7.4-7.6(如为固体培养基，再加入20g/1000ml琼脂)。
2、菌株的鉴定(1)苯反硝化降解菌PAA的菌体及菌落形态特征苯反硝化降解菌PAA为杆状，宽为0.7-0.8μm，长1.4-1.8μm，革兰氏染色阴性，鞭毛数目1；菌落白色，光滑，湿润，凸起，直径2mm。
(2)苯反硝化降解菌PAA的的生理生化特征氧化酶阳性，反硝化阳性，利用葡萄糖、果糖，不产生吲哚，不产生H2S，不需要生长因子。
根据苯反硝化降解菌PAA的上述菌学特性，将其鉴定为假单胞菌(Pseudomonassp.)。
3、反硝化降解性能将假单胞菌(Pseudomonas sp.)PAA以5×106个菌体/L接种于液体培养基(苯，73.96mg/L；K2HPO4，0.5g；CaCl2.6H2O，0.5g；KNO3，576.87mg；蒸馏水，1000ml；PH，7.4-7.6)分别38℃厌氧培养20天和40天，同时设不加菌的空白对照(CK)。培养20天时，检测该菌株对苯的降解性能，结果如图1所示，表明其苯降解率为0.2418mg/l.d；培养40天时，检测该菌株代谢对硝酸盐的影响，结果如图2所示，表明其硝酸盐生物降解率为0.5875mg/l.d。
实施例2、用假单胞菌(Pseudomonas sp.)PAA CGMCC №1091对受苯污染水进行处理采集山东省淄博地区被苯污染的地下水(经测定该受污染地下水中的苯初始浓度为22.312mg/L)，投加营养物CO(NH2)2和KH2PO4，使其终浓度分别为20mg/L和10mg/L，投加硝酸钾使其终浓度为213.45mg/L，再以5×106个菌体/L投加苯反硝化降解菌PAA，苯的降解结果如表1和图3所示，硝酸盐的降解结果如表2和图4所示，因水体中含有一定量的油类，一定程度影响了苯的降解。
表1.苯反硝化降解菌PAA对苯的降解初始 处理25天衰减量(mg/L)生物降解量(mg/L)生物降解率(mg/l.d)(mg/L)(mg/L)PAA 22.16716.163 6.004 1.210.0484CK22.45317.659 4.794 0 0表2.苯反硝化降解菌PAA对硝酸盐的降解NO3-浓度初始(mg/L)处理25天(mg/L) 衰减量(mg/L) 生物降解量(mg/L)生物降解率(mg/l.d)PAA 213.45192.33 21.1220.54 0.8216CK213.45212.87 0.58 0 0
权利要求
1.假单胞菌(Pseudomonas sp.)PAA CGMCC №1091。
2.假单胞菌(Pseudomonas sp)PAA CGMCC №1091在污水治理中的应用。
3.假单胞菌(Pseudomonas sp.)PAA CGMCC №1091在地下水污染治理中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株苯反硝化降解菌及其应用。本发明所提供的苯反硝化降解菌是假单胞菌(Pseudomonas sp.)PAA CGMCC №1091。本发明的假单胞菌(Pseudomonassp.) PAA CGMCC №1091可在厌氧条件下反硝化降解苯，为厌氧反硝化作用苯降解机理的研究提供了重要的基础，将在污水治理，特别是地下水污染治理实践中发挥重要作用。
文档编号C02F3/28GK1570084SQ200410038040
公开日2005年1月26日 申请日期2004年5月14日 优先权日2004年5月14日
发明者李广贺, 金文彪, 张旭 申请人:清华大学