专利名称：一种碱性铬污染土壤的微生物修复方法
技术领域：
本发明涉及一种铬污染土壤的修复方法，尤其涉及一种碱性铬污染土壤的微生物 修复方法。
背景技术：
据初步调查，目前我国铬渣总堆存量超过600万吨，分散于20多个省市的80余 处。经过几十年的雨水冲淋、渗透，铬渣堆存场地已被严重污染。据有关专家估算，已被铬 渣严重污染、必须治理的土壤数量估计在400万吨至1000万吨之间，由此导致的水体污染 亦不容忽视。《中华人民共和国国民经济和社会发展第十一个五年规划纲要》已将铬渣污染 治理列为环境治理重点工程，明确要求对堆存铬渣及受污染土壤进行综合治理，实现所有 堆存铬渣无害化处置。因此，开展铬污染水体与土壤的修复治理工作已刻不容缓。
铬在环境中主要以Cr(VI)和Cr(III)的形式存在。与Cr(III)相比，Cr(VI)具 有致畸、致癌、致突变等高毒性。而Cr(III)则易与环境中的有机、无机化合物相结合，形成 复杂稳定的难溶化合物，因而迁移性小，生物有效性低，其毒性仅为Cr (VI)的千分之一。因 此，将高毒性的Cr(VI)还原为低毒性的Cr(III)是Cr (VI)污染物修复的基本思路。
传统的物理化学方法，如化学沉淀法、物理隔离法、离子交换法等的实施需要 消耗大量的化学试剂，昂贵的机件设备费与运行费阻碍了其大范围的推广与实际应用， 与此同时，二次污染的控制与处理也成为一项技术瓶颈。生物修复技术因其具有运行 成本低，操作简单，可原地处理，不产生二次污染等优势而得到广泛的重视。近年来，已 有不同种属的铬还原微生物得以分离和报道，如无色杆菌Achromobactersp. Ch-1、微 杆菌 Microbacteriumsp. MP30、苍白杆菌 Ochrobactrumsp.、金黄节杆菌 Arthrobater aurescenssp.、芽孢杆菌Bacillussp.等。然而,有关利用所分离的微生物菌株进行碱性污 染土壤实际修复的研究却相对较少。因此，本领域迫切需要将所分离获得的Cr (VI)还原效 率高、耐受能力强的菌株应用于铬污染土壤的实际修复，从而为碱性铬污染土壤生物修复 的实施提供技术支撑。发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种碱性铬污染土壤的微生物 修复方法。该方法通过利用一种耐盐耐碱的Cr (VI)还原菌株Pseudochrobactrum saccharolyticum LYlO将高毒性的Cr (VI)还原为低毒性的Cr (III),以降低铬的毒性和生 物有效性，从而实现铬污染土壤的修复。该方法操作简单，经济有效，环境友好，为碱性铬污 染土壤生物修复的推进提供了技术支撑。
本发明的目的是通过以下技术方案实现一种碱性铬污染土壤的微生物修复方 法，它包括以下步骤
( I)采集铬污染土壤，土壤经风干磨碎后过100目筛；
(2)菌体活化挑取 Pseudochrobactrum saccharolyticum LYlO 的单菌落接种至液体LB培养基中(氯化钠SgL-1，酵母提取物SgL—1，胰蛋白胨IOgr1, ρΗ7· O 7. 5)， 28°C, 160rpm振荡培养,获得菌体浓度为IO7 108cells mL 1的菌液；Pseudochrobactrum saccharolyticum LYlO的16S rRNA基因具有SEQ ID No.1所不的基因序列，已保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号为 CGMCC No. 5873 ；
(3)按照土壤与菌液质量体积比(g:mL)为1:3的比例，向步骤I处理后的铬污染土壤中添加步骤2得到的菌液；28°C条件下培养，每隔5d补充LB培养基至原体积；
(4)经培养22d后，污染土壤修复完成。
本发明的有益效果是采用本发明的方法对碱性铬污染土壤进行修复，土壤中大部分Cr(VI)得以去除，去除率高达95.9%。经修复后，土壤中的可交换态铬含量显著降低， 铬从生物有效性高的形态向更加稳定的形态转变，从而降低了铬的生物有效性，达到了较好的修复效果。
本发明方法中所米用的微生物为Pseudochrobactrumsaccharolyticum LYlO 菌种，该菌种已于2012年3月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为=CGMCC No. 5873 ;分类命名为解糖假苍白杆菌LY10，拉丁文学名为 Pseudochrobactrum saccharolyticum LY10。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮编为100101。
图1是本发明所用菌株的形貌图；
图2是本发明所用菌体浓度的筛选确定图3是本发明对污染土壤中Cr(VI)的去除效果图4是本发明对污染土壤中不同形态铬的影响柱状图。
具体实施方式
本发明碱性铬污染土壤的微生物修复方法，主要由以下步骤组成
1、采集铬污染土壤，土壤经风干磨碎后过100目筛。
2、菌体活化挑取 Pseudochrobactrum saccharolyticum LYlO 的单菌落接种至液体LB培养基中(氯化钠SglA酵母提取物SgL'胰蛋白胨lOgL—1，pH7. O 7.5)， 28°C，160rpm振荡培养，获得菌体浓度为IO7 IO8CellsmL1的菌液；Pseudochrobactrum saccharolyticum LYlO的16S rRNA基因具有SEQ ID No.1所不的基因序列，已保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号为 CGMCC No. 5873。
3、按照土壤与菌液质量体积比(g:mL)为1:3的比例，向步骤I处理后的铬污染土壤中添加步骤2得到的菌液。28°C条件下培养，每隔5d补充LB培养基至原体积，以补充修复过程中的水分蒸发和营养消耗，从而维持菌体生长和代谢活性。
4、经培养22d后，污染土壤修复完成，Cr(VI)去除率达95. 9%，可交换态铬含量明显降低。
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1 :本发明菌株的筛选、分离与鉴定
1、富集采集杭州原红星化工厂铬渣堆场污染土壤，称取5g 土壤于50mL已灭菌的液体LB培养基中(氯化钠SglA酵母提取物SglA胰蛋白胨IOglApH . O 7. 5)，28°C， 160rpm振荡培养。
2、驯化当土悬液由原来的黄色(Cr(VI)呈黄色)变成灰绿色(Cr(III)呈绿色) 时，取上悬液接种至新配置的含有Cr(VI)的液体LB培养基中，28°C，160rpm振荡培养，当培养液再次变成灰绿色时，将其接种至含有更高Cr(VI)浓度的液体培养基中，以此逐步提高培养基中的Cr(VI)浓度，从而驯化目的菌株。驯化过程中所用的Cr(VI)以过滤灭菌后的K2Cr2O7母液形式进行添加。驯化所用的Cr(VI)浓度梯度依次为5mM、8mM、10mM、12mM、 15mM。
3、分离当驯化浓度为15mM Cr(VI)时，经过5d的培养，培养液变成灰绿色，以该菌液作为分离母液，取ImL按梯度稀释成ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ-7。分别从10_5、10_6、 Kr7的稀释液中吸取50uL涂布于含7mM Cr (VI)的固体培养基中，28°C倒置培养2 3d。
4、纯化分别挑取不同形态的单菌落，于含有7mM Cr(VI)的固体培养基中进行划线接种。28°C倒置培养2 3d后，再次挑取单菌落划线于含铬培养基中。依此纯化3 4 代，获得具有高浓度Cr (VI)耐受和还原能力的菌株，命名为LY10。该菌株耐盐耐碱，能在 PH7. O 10. 7，氯化钠浓度为2 2(^171的条件下很好地生长和进行Cr(VI)还原。
5、鉴定将菌株LYlO送至中国科学院微生物研究所进行菌种鉴定(2011微检字第 243号)，经细胞形态观察、BI0L0G等生理生化检测以及16S rRNA基因序列测定与分析，确定该菌株为解糖假苍白杆菌Pseudochrobactrum saccharolyticum。该菌株的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，测序时所用PCR正向引物BSF8 / 20序列如SEQ I D NO. 2所示5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG — 3’；反向引物 BSR1541 / 20 序列如 SEQ I D NO. 3 所示: 5’一 AAGGAGGTGATCCAGCCGCA — 3’。该菌株形态如图1所示，菌种保藏号为CGMCCNo. 5873。
实施例2 :菌体的培养与接种浓度的确定
将菌株P. saccharolyticum LYlO过夜培养至对数生长期，分别以不同比例接种至含有IOOmgL-1Cr(VI)的液体LB培养基中，使菌体终浓度分别为8. 34X IO5, 5. 68 X IO6, 9. 22X 107，6· 76 X IO8,1. 47 X lOQcellsmr1, 28°C , 160rpm 条件下振荡培养。于不同时间取样，IOOOOrpm离心IOmin后取上清测定Cr(VI)的含量。
试验结果表明当菌体浓度从8. 34X IO5Cells mL—1增加至9. 22X IO7Cells πι Λ 随着菌体浓度的增加，Cr (VI)的还原速率逐渐加快。然而，随着菌体浓度从6. 76Χ108增加至1. 47Χ IO9ceIls HiL-SCr(VI)还原率的提高并不明显，结果如图2所示。因此，从经济有效的原则出发，故选择IO7 IO8Cells mL—1的菌体浓度作为适宜接种量。
实施例3 :铬污染土壤的微生物修复
采集杭州市原红星化工厂铬渣堆场中的碱性铬污染土壤，该污染土壤pH为11. 3， 水溶性Cr (VI)浓度为443. 9mg kg'样品经风干磨碎后过100目筛。取5g过筛后的土壤于250mL三角瓶中，加入15mL经预培养，细胞浓度为IO7 108cells mL—1的菌液，于28°C 下培养。每隔5d补充2mL新鲜的液体LB培养基，以补充修复过程中蒸发的水分和消耗的营养，从而保证菌体生长的营养需求，维持细胞的代谢活性。分别于不同时间取样测定土壤中的Cr(VI)浓度。修复22d后，土壤样品经风干磨细后过100目筛。按照连续提取法测定土壤交换态铬、碳酸盐结合态铬、金属有机结合态铬和易还原态铬的浓度。
试验结果表明培养4d后，土壤中Cr (VI)的去除率达47. 7%，培养至22d时，六 价铬去除率高达95.9%，土壤中绝大多数Cr (VI)得以去除，如图3。修复22d后，土壤中不 同形态铬的含量发生了明显的变化。与未加菌液的对照相比，经P. saccharolyticum LYlO 修复的土壤中，可交换态铬，碳酸盐结合态铬的浓度显著降低，而易还原态铬的浓度有所增 力口，如图4。结果表明，利用本发明提出的碱性铬污染土壤的微生物修复方法，可以有效去除 有毒Cr (VI)，改善土壤中铬的形态分布，使土壤中的铬从生物有效性高的形态向更加稳定 的形态转变，从而降低了铬的生物有效性，达到了较好的修复效果。<110>浙江大学〈120〉一种碱性铬污染土壤的微生物修复方法 〈160〉 3<170> PatentIn version 3. 3 〈210〉 I 〈211〉 1361 〈212〉 DNA<213> Pseudochrobactrum saccharolyticum 〈400〉 Itggtcgcctg cctccttgcg gttagcacag cgccttcggg taaaaccaac tcccatggtg 60 tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcattctg atccgcgatt 120 actagcgatt ccaacttcat gcactcgagt tgcagagtgc aatccgaact gagatggctt 180 ttggagatta gctcgacctc gcggtctcgc tgcccactgt caccaccatt gtagcacgtg 240 tgtagcccag cccgtaaggg ccatgaggac ttgacgtcat ccccaccttc ctccagctta 300 tcactggcag tccctttaga gtgcccaact aaatgatggc aactaaaggc gagggttgcg 360 ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacagcc atgcagcacc 420 tgtgtcctac gccccgaaag gcccaaagtg tctccactaa ggttcatagg catgtcaaga 480 gctggtaagg ttctgcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc 540 ccccgtcaat tcctttgagt tttaatcttg cgaccgtact ccccaggcgg aatgtttaat 600 gcgttagctg cgccaccgaa gtgtaaacac cccgacggct aacattcatc gtttacggcg 660 tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct ttcgcacctc agcgtcagta 720 atggaccagt aagccgcctt cgccactggt gttcctgcga atatctacga atttcacctc 780 tacactcgca attccactta cctcttccat actcaagact tccagtatca aaggcagttc 840 cggggttgag ccccgggatt tcacccctga cttaaaagtc cgcctacgtg cgctttacgc 900 ccagtaaatc cgaacaacgc tagccccctt cgtattaccg cggctgctgg cacgaagtta 960 gccggggctt cttctccggt taccgtcatt atcttcaccg gtgaaagagc tttacaaccc 1020 tagggccttc atcactcacg cggcatggct ggatcaggct tgcgcccatt gtccaatatt 1080 ccccactgct gcctcccgta ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt ggctgatcat 1140 cctctcagac cagctatgga tcgtcgcctt ggtaggcctt taccctacca actagctaat 1200 ccaacatggg ctcatcattc tccgataaat ctttccccaa aagggcgtat acggtattag 1260 cacaagtttc cctgagttat tccgtagaga acggtagatt cccatgcatt actcacccgt 1320 ctgccactgc ctccgaagag accgttcgac ttgcatgtgt a1361〈210〉 2 〈211〉 20 〈212〉 DNA 〈213〉人工设计 〈400〉 2agagtttgat cctggctcag20
权利要求
1.一种碱性铬污染土壤的微生物修复方法，其特征在于，它包括以下步骤(1)采集铬污染土壤，土壤经风干磨碎后过100目筛；(2)菌体活化Pseudochrobactrumsaccharolyticum LYlO 的单菌落接种至液体LB培养基中(氯化钠5 g L—1，酵母提取物5 g L—1，胰蛋白胨10 g L_S pH 7. O 7. 5)， 28°C，160rpm振荡培养,获得菌体浓度为IO7 IO8 cells mL 1饱袁:薇'Pseudochrobactrum saccharolyti cum LYlO的16S rRNA基因具有SEQ ID No.1所不的基因序列，已保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号为 CGMCC No. 5873 ；(3)按照土壤与菌液质量体积比(g:mL)为1:3的比例，向步骤I处理后的铬污染土壤中添加步骤2得到的菌液；28°C条件下培养，每隔5d补充LB培养基至原体积；(4)经培养22d后，污染土壤修复完成。
全文摘要
本发明公开了一种碱性铬污染土壤的微生物修复方法，该方法以解糖假苍白杆菌PseudochrobactrumsaccharolyticumLY10为修复菌株，以107～108cellsmL 1为菌体接种浓度，按照土壤与菌液质量体积比(g:mL)为1:3的比例添加菌液，于28℃下培养，每隔5d补充培养基，以维持菌体的生长代谢活性；修复22d后，土壤中Cr(VI)去除率达95.9%，可交换态铬含量显著降低；经修复后，污染土壤中铬的赋存形态明显改变，其生物有效性降低，达到了较好的修复效果。本发明的方法操作简单，经济有效，环境友好，可为铬污染土壤生物修复的推进提供技术支撑。
文档编号B09C1/10GK103008339SQ201210355258
公开日2013年4月3日 申请日期2012年9月21日 优先权日2012年9月21日
发明者龙冬艳, 陈英旭 申请人:浙江大学