一种能适应高固液比体系的镉污染土壤治理复合菌剂的应用的制作方法

本发明涉及一种能适应高固液比体系的镉污染土壤治理复合菌剂的应用，属于微生物转化治理重金属污染土壤技术领域。

背景技术：

近几年，镉污染事件已成为全世界关注的环境安全保护问题。工业中排放的金属镉废渣、废气、废水会直接或间接污染耕地土壤。镉极易被农作物的根吸收而向籽实迁移，最后通过食物链进入人体，对人类健康构成严重威胁。与传统的物理化学和植物修复镉污染土壤技术相比，微生物修复技术具有很大的优势。微生物能够影响镉在土壤中的地球化学行为，使各种不同形态镉转化为可溶态从土壤中彻底清除，从而使镉失去“毒性”，并且微生物修复技术对土壤肥力和代谢活性没有影响，能够避免二次污染物对人类健康和环境的影响；同时，微生物具有丰富的物种资源，随着分子生物学技术的不断发展，微生物修复机理研究的也越来越深入，使得微生物修复成为最具有发展和应用前景的技术之一。

微生物对镉污染土壤的修复效率受许多因素的影响，比如土壤性质、含水量、温度、氧含量、ph值、氧化还原电位和有机物含量等。其中，修复环境中土壤和液体固液比在构建和优化微生物功能菌群并保持菌群活性，从而提高污染土壤镉去除率方面起到非常重要的作用。随着固液比的提高，修复环境中重金属浓度、有机质的增加以及本土微生物对功能菌群的竞争抑制，均会影响微生物的生长速率；此外，固液比的增加会由于土壤的缓冲能力而影响土壤ph的变化，重金属在土壤中的钝化及溶解反应与土壤ph有很大相关性，ph值是影响微生物转化重金属形态过程的重要因素。要实现镉污染土壤微生物修复技术的工业化应用，提高功能微生物群落对高固液比体系的适应性是一个重要的前提，这将大大降低微生物在扩大培养过程中的生产成本和工业用水量的大量减少。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种能适应高固液比体系的镉污染土壤治理复合菌剂的应用。该复合菌剂不仅保证了污染土壤中不溶态镉转化为离子态镉所需的微生物和化学反应多样性，而且使该功能菌群在高固液比体系中也能有较高的镉去除率。

本发明的目的是通过以下方式实现的。

一种能适应高固液比体系的镉污染土壤治理复合菌剂的应用，将所述的菌剂用于治理镉污染土壤。具体是将菌浓为1-4×10⁷个/ml的复合菌剂中加入60％质量浓度的镉污染土壤，恒温培养箱转速为170～175rpm，温度为25～30℃，初始ph值为2.5-3.0，处理时间为3～7天。所述的复配菌剂由隐性嗜酸杆菌(acidiphiliumcryptum)、皱褶假丝酵母菌(candidarugosa)、固氮醋酸杆菌(acetobacterdiazotrophicus)、粘红酵母菌(rhodotorulaglutinis)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、嗜酸氧化硫硫杆菌(acidithiobacillusthiooxidans)和嗜酸氧化亚铁硫杆菌(acidthiobacillusferrooxidans)混合组成。

作为进一步的改进，先将隐性嗜酸杆菌、皱褶假丝酵母菌、固氮醋酸杆菌、粘红酵母菌和铜绿假单胞菌混合得到复合群落a；嗜酸氧化硫硫杆菌和嗜酸氧化亚铁硫杆菌混合得到复合群落b；然后将复合群落a和b混合得到复合群落c，最后再培养得到复合菌剂。

作为进一步的改进，先将各种微生物单独培养，当达到对数生长期时离心收菌并计数，根据微生物数量比例混合获得两种复合群落，其中隐性嗜酸杆菌、皱褶假丝酵母菌、固氮醋酸杆菌、粘红酵母菌和铜绿假单胞菌按照1～1.5：1～1.5：1～1.5：1～1.5：1～1.5的比例混合得到复合群落a；嗜酸氧化硫硫杆菌和嗜酸氧化亚铁硫杆菌按照1.1～1.5：1.2～1.5的比例混合得到复合群落b；将得到的复合群落a和b按照菌浓数量比1:1混合。

作为进一步的改进，各微生物单独培养的培养基成分为：(nh4)2so4，0.3g/l；kcl，0.01g/l；k2hpo4，0.05g/l；mgso4·7h2o，0.05g/l和ca(no3)2，0.001g/l；单独培养隐性嗜酸杆菌、皱褶假丝酵母菌、固氮醋酸杆菌、粘红酵母菌和铜绿假单胞菌时，培养基中加入葡萄糖0.5～1g/l，酵母粉0.05～0.1g/l；单独培养嗜酸氧化硫硫杆菌和嗜酸氧化亚铁硫杆菌时，在培养基中加入硫粉0.5～1g/l，硫酸亚铁2.50～4.47g/l。

作为进一步的改进，将得到的复合群落a和b分别在含镉培养基中进行驯化；然后将复合群落a和b混合得到复合群落c，最后在高固液比体系的镉污染土壤环境下进行适应性培养得到复合菌剂。

作为进一步的改进，，将得到的复合群落a和b分别在驯化培养基中进行驯化，驯化培养基成分为：(nh4)2so4，0.3g/l；kcl，0.01g/l；k2hpo4，0.05g/l；mgso4·7h2o，0.05g/l和ca(no3)2，0.001g/l；培养复合群落a时，在培养基中加入葡萄糖0.5～1g/l，酵母粉0.05～0.1g/l；培养复合群落b时在培养基中加入硫粉0.5～1g/l，硫酸亚铁2.50～4.47g/l；此外，在培养基中均加入-20目的5-10wt％镉污染土样，土壤中镉含量范围为10～30mg/kg；每次传代接种的微生物浓度为1-4×10⁷个/ml，培养后微生物的浓度至少达到4×10⁸-10⁹个/ml；复合群落a和b各自培养5-8代后，按照菌浓度等比例混合得到复合群落c。

作为进一步的改进，复合群落a和b的驯化过程在200-250ml的锥形瓶中进行，恒温培养箱转速为170-175rpm，培养温度为25-30℃，初始ph值为2.5-3.0。

作为进一步的改进，所述的复合群落c对高固液比的适应性培养过程如下：基本培养基成分为：(nh4)2so4，0.3g/l；kcl，0.01g/l；k2hpo4，0.05g/l；mgso4·7h2o，0.05g/l和ca(no3)2，0.001g/l；培养基还加入葡萄糖0.5～1g/l，酵母粉0.05～0.1g/l，硫粉0.5～1g/l，硫酸亚铁2.50～4.47g/l；此外，在培养基中加入-20目的镉污染土样进行适应性培养，土样中镉含量范围为10～30mg/kg，以5wt％为一个浓度梯度，加入土壤含量从10wt％增加至60wt％，；每个浓度梯度至少连续培养3代。

作为进一步的改进，对复合菌剂进行适应性培养，恒温培养箱转速为170～175rpm，培养温度为25～30℃，初始ph值为2.5-3.0，每代培养时间为3～7天，当菌液ph值达到2.0以下，微生物菌体密度达到4×10⁸-10⁹个/ml时，进行传代培养，每次传代接种的微生物浓度为1-4×10⁷个/ml。

本发明的菌剂用于处理某处镉污染土壤时，该菌剂用于驯化和适应性培养时所用土样就取自于该处镉污染土壤。

本发明针对污染土壤中镉形态的微生物转化机理及微生物生理生化特征，采用多种微生物复配成一种可高效治理镉污染土壤的功能菌群，不但解决了功能菌群在加入到镉污染土壤中适应性差，生长速度慢的问题，而且保证了污染土壤中不溶态镉转化为离子态镉所需的微生物和化学反应多样性，该功能菌群在高固液比体系中也能有较高的镉去除率。

附图说明

图1为在逐步提高土壤含量(固液比)体系下复合菌剂对污染土壤的镉去除率的影响；

图2为不同复合群落修复污染土壤时镉的去除率的变化。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步阐述，但不作为对本发明的限定。

本实施例所用镉污染土样取自于湖南省湘潭县湘江入口4公里处，此地区土壤镉污染由工业废水的随意排放所致，污染时间长达十余年，污染程度严重，治理难度大。经测定，土样中镉含量为21mg/kg，其他重金属离子含量低于国家标准规定gb15618－1995《土壤环境质量标准》。

制备复合菌剂的微生物由隐性嗜酸杆菌atcc33463、皱褶假丝酵母菌cctccay93026、固氮醋酸杆菌cgmccno.5455、粘红酵母菌atcc96365、铜绿假单胞菌cctccab2013184、嗜酸氧化硫硫杆菌atcc19377和嗜酸氧化亚铁硫杆菌atcc23270混合组成。各微生物单独培养的培养基成分为：(nh4)2so4，0.3g/l；kcl，0.01g/l；k2hpo4，0.05g/l；mgso4·7h2o，0.05g/l和ca(no3)2，0.001g/l，其中单独培养隐性嗜酸杆菌atcc33463、皱褶假丝酵母菌cctccay93026、固氮醋酸杆菌cgmccno.5455、粘红酵母菌atcc96365和铜绿假单胞菌cctccab2013184时，培养基中加入葡萄糖1g/l，酵母粉0.1g/l；单独培养嗜酸氧化硫硫杆菌atcc19377和嗜酸氧化亚铁硫杆菌atcc23270时，在培养基中加入硫粉1g/l，硫酸亚铁4.47g/l；各种微生物的培养温度为30℃，恒温培养箱转速为175rpm，初始ph值为2.8。

当各微生物达到对数生长期时，离心收菌并利用显微镜计数，根据微生物数量比例混合获得两种复合群落，其中隐性嗜酸杆菌atcc33463、皱褶假丝酵母菌cctccay93026、固氮醋酸杆菌cgmccno.5455、粘红酵母菌atcc96365和铜绿假单胞菌cctccab2013184按照1:1:1:1:1的比例混合得到复合群落a；嗜酸氧化硫硫杆菌atcc19377和嗜酸氧化亚铁硫杆菌atcc23270按照1:1.2的比例混合得到复合群落b。

将得到的复合群落a和b分别在驯化培养基中进行驯化，驯化培养基成分为：(nh4)2so4，0.3g/l；kcl，0.01g/l；k2hpo4，0.05g/l；mgso4·7h2o，0.05g/l和ca(no3)2，0.001g/l；培养复合群落a时，在培养基中加入葡萄糖1g/l，酵母粉0.1g/l；培养复合群落b时在培养基中加入硫粉1g/l，硫酸亚铁4.47g/l；此外，在培养基中均加入-20目的5wt％镉污染土样，土壤中镉含量为21mg/kg；每次传代接种的微生物浓度为4×10⁷个/ml，培养后微生物的浓度至少达到4×10⁹个/ml；培养过程在250ml的锥形瓶中进行，培养温度为30℃，恒温培养箱转速为175rpm，ph值为3.0，分别培养5代后，将复合菌群a和b按照菌浓度等数量比例混合得到复合群落c。

得到的复合群落c对高固液比体系的适应性培养过程在250ml的锥形瓶中进行，基本培养基成分为：(nh4)2so4，0.3g/l；kcl，0.01g/l；k2hpo4，0.05g/l；mgso4·7h2o，0.05g/l和ca(no3)2，0.001g/l；另外，培养基加入葡萄糖1g/l，酵母粉0.1g/l，硫粉1g/l，硫酸亚铁4.47g/l；此外，在培养基中加入-20目的镉污染土样(镉含量范围为21mg/kg)进行适应性培养，以5wt％为一个浓度梯度，加入土壤含量从10wt％增加至60wt％，；每个浓度梯度连续培养3代。对复合群落c进行适应性培养时，培养温度为30℃，恒温培养箱转速为175rpm，ph值为3.0，每代培养时间为7天，当菌液ph值达到2.0以下，微生物菌体密度达到4×10⁹个/ml时，进行传代培养，每次接种的微生物浓度为4×10⁷个/ml。

在250ml锥形瓶中加入100ml基本培养基，成分为：(nh4)2so4，0.3g/l；kcl，0.01g/l；k2hpo4，0.05g/l；mgso4·7h2o，0.05g/l；ca(no3)2，0.001g/l；葡萄糖1g/l；酵母粉0.1g/l；硫粉1g/l和硫酸亚铁4.47g/l；此外，在此体系中加入60wt％的粒径小于20目镉含量为21mg/kg的镉污染土壤(即之前进行驯化和适应性培养用的镉污染土样)；将驯化后的复合群落a和复合群落b、未适应性培养的复合群落c(驯化后的复合群落a+b)以及本发明适应性培养(进行了驯化和适应性培养)得到的复合菌剂分别加入到锥形瓶中，在初始加入的微生物浓度为4×10⁷个/ml，恒温培养箱转速为175rpm，温度为30℃条件下进行比较试验。

如图1所示，在以5wt％镉污染土样为浓度梯度，在每个梯度进行7天的适应性培养的体系下，随着土壤含量的增加，镉的去除率虽然逐渐降低，但在60wt％浓度下，镉的去除率仍达到60.3％；然而，如图2所示，与利用本发明适应性培养得到的复合菌剂治理镉污染土样的结果相比，利用未适应性培养的复合群落c(复合群落a+b)、驯化后的复合群落a和复合群落b治理污染土壤的镉去除率仅为13.2％、5.3％和8.6％。