本发明涉及分子生物学
技术领域：
，具体涉及水稻镉低积累基因OsHMA3的SNP分子标记、以及检测水稻镉低积累基因OsHMA3的方法。
背景技术：
：传统系谱法育种是近年来最为普遍的水稻育种方法，也因此诞生了大量的高产量优质水稻品种。但是传统的杂交结合表型的选育方法往往因为宏观上表型把握不准而需要加大回交群体，这极大的增加了育种工作量与成本。分子标记辅助育种可以从遗传基础上跟踪目标性状，选择含有目标基因的单株进行杂交(回交)，这样不但能准确的进行目标性状方向的育种，而且能减小回交群体的大小，节省成本。SNP是singlenucleotidepolymorphism的缩写，是指在基因组上单个核苷酸的变异，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。SNP包括单个碱基的转换或颠换，也包括插入或缺失，在整个基因组上具有高密度性，因此比较容易找到目标基因的SNP。利用目标基因的SNP标记可以在育种过程中进行相关性状的精准选育，也可以将相关的SNP锚定进芯片，在进行全基因组标记选择的同时选择含有此目标基因的个体(单株)。水稻籽粒镉含量是由数量性状(QTL)控制的，目前通过遗传群体定位并被克隆的主效基因只有OsHMA3，因此此基因在水稻籽粒低镉含量育种上具有重要作用。使用含有此基因的水稻供体材料与大面积推广的高镉品种(常规稻)杂交，并通过连续的回交使目标基因进入要改良的品种中，这样就可以在水稻籽粒镉含量性状上达到低镉的要求。同时待改良的杂交稻双亲中如果导入此基因，则含有此基因的杂交稻籽粒中镉含量会大大降低。在水稻的改良和育种中，通过开发目标基因的分子标记来追踪目标基因。而SNP分子标记在基因组上的密度大，也最容易找到，所以开发低镉SNP分子标记并以此辅助低镉育种具有重要意义。以检测水稻相关基因的SNP来预测其基因的存在已经广泛的应用在水稻育种上。在品种选育或是目标性状的改良过程中，使用基因芯片技术，Taqman技术，分子信标技术和焦磷酸测序法、变相高效液相色谱等手段来测定每一个实验单株，选择含有目标基因的SNP单株再进行实验。这样就可以改变传统育种的盲目性，而且极大的减小了群体大小，节省成本。由于水稻籽粒镉含量性状是由数量性状控制，表型值又不易准确测定，因此目前克隆的主效基因非常少，而真正针对主效基因设计的SNP标记也比较少。现有技术中关于水稻籽粒镉含量这一性状的SNP分子标记基本都是根据QTL来设计的，因此这样的SNP标记在实际育种中价值较小。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供一种检测水稻镉低积累基因OsHMA3的SNP标记及其应用。本发明的另一个目的是提供用于检测水稻镉低积累基因OsHMA3的SNP标记的引物及含有该引物的试剂盒。本发明的再一目的在于提供鉴定或辅助鉴定低积累镉水稻品种的方法。为了实现本发明的目的，本发明提供了一种用于检测水稻镉低积累基因OsHMA3的SNP分子标记，该分子标记检测水稻第7号染色体第7431781bp处SNP变异，该SNP分子标记的多态性为A/G。本发明提供了用于检测水稻镉低积累基因OsHMA3的SNP分子标记的引物组合，包括：(1)两条特异性引物：引物X：5’-ATGCCTGTTAGAGACAAAACTG-3’；引物Y：5’-ATAATGCCTGTTAGAGACAAAACTA-3’。(2)一条通用引物：引物C：5’-GGTTGACCTTCACTCCATTC-3’本发明提供了上述SNP分子标记或引物组合在水稻育种中的应用。本发明提供了上述SNP分子标记或引物组合在鉴定镉低积累水稻品种中的应用。本发明提供了上述SNP分子标记或引物组合在鉴定镉低积累水稻基因型中的应用。本发明提供一种检测镉低积累水稻的方法，包括以下步骤：(1)提取待测水稻基因组DNA，以其为模板，利用本发明的上述引物组合进行KASP反应检测；(2)检测扩增产物片段的第22bp处的碱基种类，若碱基种类为A，则待测水稻为镉低积累水稻，若碱基种类为G，则判定待测水稻不是镉低积累水稻。所述扩增产物序列如SEQIDNO.1所示。步骤(1)中PCR扩增反应使用的扩增体系以3μl计为：20ng模板DNA，烘干后加入100UM的引物X和Y各0.0050μL，100UM的通用引物0.0125μL，2×KASPMasterMix1.4792μl，余量为超纯水。步骤(1)中PCR扩增反应的条件为：骤(1)PCR扩增在水浴热循环仪中完成，TouchdownPCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。反应完成后利用扫描仪Pherastar对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。含有本发明上述特异性引物的辅助鉴定水稻籽粒镉低积累基因OsHMA3的试剂盒属于本发明的保护范围。本发明提供了上述试剂盒在水稻种质资源改良中的应用。本发明提供了上述试剂盒在水稻育种中的应用。本发明提供了上述试剂盒在检测水稻籽粒镉低积累的水稻品种中的应用。本发明提供了上述试剂盒在鉴定镉低积累水稻基因型中的应用。由于水稻籽粒镉含量这个性状是由数量性状控制，表型值又不易准确测定，因此目前克隆的主效基因非常少，而真正针对主效基因设计的SNP标记也比较少。关于水稻籽粒镉含量这一性状的SNP分子标记基本都是根据QTL来设计的，因此这样的SNP标记在实际育种中价值可能较小。本发明是针对目前根据遗传群体定位并克隆的唯一一个低镉基因OsHMA3设计的，含有OsHMA3基因并且正常表达的水稻品种基本都为低镉品种。因此根据此基因开发出的低镉SNP标记可以比较准确的预测水稻镉含量情况，在低镉水稻育种或是定向改良中实际应用价值强。本发明的开发的水稻镉低积累基因OsHMA3的SNP标记及其应用具有如下优点：(1)本发明所选择的SNP位点是独特的，而且此位点所代表的基因OsHMA3水稻籽粒镉含量这一性状的主效基因，具有很高的广义遗传力，能比较准确的预测水稻籽粒镉含量。(2)本发明的SNP分子标记可用于水稻未结实之前预测水稻籽粒镉含量高低，可进行准确地筛选，显著促进水稻低镉含量品种的培育。(3)检测方法准确可靠，操作简便，水稻OsHMA3基因的SNP位点的检出，能够预测水稻籽粒镉含量，从而更好的服务水稻低镉品种的选育或是改良，在分子辅助育种领域，为水稻籽粒低镉含量品种选育或改良提供了科学依据。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例1水稻镉低积累基因OsHMA3的SNP分子标记的开发根据文献资料将水稻水稻OsHMA3基因定位在第7染色体上物理位置：7405745-7409553区间内。以基因区间为中心向两侧各扩大了50kb，根据国际水稻所3000份水稻重测序数据进行SNP位点提取，并根据PIC值及SNP位点周边50bp是否有其他SNP位点等进行挑选。挑选出的SNP位点，利用BatchPrimer3对其进行引物设计。针对这些SNP标记，对含有OsHMA3基因的水稻品种Nipponabre和Sasanishiki两份基因供体材料和确定不具有OsHMA3基因功能的Chokokoku和Habataki两个水稻品种，以及其他高镉低镉材料19份进行KASP反应验证，挑选出与抗性供体材料共分离及扩增效果好的的SNP标记。测试材料与标记分型情况如下表1。表1测试材料与分型结果结果显示有7个SNP在几乎所有的高镉材料和低镉材料中具有多态性，因此初步确定此7个SNP为候选的低镉SNP，见表2。根据OsHMA3克隆的文章(UenoD,YamajiN,KonoI,etal.Genelimitingcadmiumaccumulationinrice[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2010,107(38):16500-16505；MiyadateH,AdachiS,HiraizumiA,etal.OsHMA3,aP1BtypeofATPaseaffectsroottoshootcadmiumtranslocationinricebymediatingeffluxintovacuoles[J].NewPhytologist,2011,189(1):190-199.)以及基因分型结果，本发明选择了在这7个SNP上有差异的两对亲本材料(日本晴、9311以及日本晴、Cho-Ko-Koku)进行杂交，选择阳性的F1单株，每个组合混收500粒左右的种子，F2种植于典型的低镉表型鉴定基地，进行表型值测定，采用完全随机实验种植。同时取F2叶片抽提DNA，进行基因分型，结合表型值对以上初步确定的7个SNP进行再次验证，以期得到通用的低镉SNP分子标记。同时，还采用200份具有丰富遗传基础的自然群体材料来验证这7个初步标记，200份自然群体材料分别种植于2个典型低镉鉴定基地，采用随机区组实验，三个重复，每个重复内种植7×2＝12个单株，收种子时排除边际效应，收取中间的5×2＝10株成熟种子，用于测定籽粒镉含量。取200份自然群体材料苗期叶片CTAB法抽提DNA后进行基因分型，基因分型结果结合表型结果对初步的7个SNP进行验证，得到的结果与两个F2分离群体验证结果相结合，得到最终的低镉SNP标记，TagSNP-K_070520，扩增其的通用引物和特异性引物见表3、表4的黑色加粗文字。表2候选标记及其有利等位基因编号位置等位基因X等位基因Y有利等位基因K_070505chr7.7366438TCCK_070511chr7.7421206TCTK_070515chr7.7427330GAAK_070517chr7.7430053TCTK_070520chr7.7431781GAAK_070523chr7.7435781GAAK_070151chr7.7401091GAA表3候选标记的通用引物编号位置通用引物K_070505chr7.7366438CCTGATCTCTTCCCCAAAGK_070511chr7.7421206CTTGTAGGAGCACGTCCTTTK_070515chr7.7427330TGGGGTTTTCTATAAAATGAGAK_070517chr7.7430053CCCCATCATCTTCATCAGAK_070520chr7.7431781GGTTGACCTTCACTCCATTCK_070523chr7.7435781CATATTTTTGATGATTGGCTTCK_070151chr7.7401091CTGAATGCTTACATCCAGTTAGATACATTA表4候选标记的特异引物实施例2水稻镉低积累基因OsHMA3的SNP分子标记的应用1、提取待测水稻品种的基因组DNA2、扩增含SNP位点的核苷酸片段针对实施例1中筛选到的SNP位点，根据TagSNP-K_070520的引物(见表2)，以基因组DNA为模板，扩增出待测SNP所在的核苷酸片段，如SEQIDNO.1所示。该SNP位点位于PCR扩增片段的22bp处，此处碱基多态性为A或G。KASP反应测试在LGCSNPline基因分型平台上进行。在微孔反应板中加入20ngDNA样品，烘干后加入KASP反应混合液，反应体系见表5。表5KASP检测的反应体系终浓度体积(μL)100UM引物C0.42UM0.0125100UM引物X0.17UM0.0050100UM引物Y0.17UM0.00502xKASPMasterMix1x1.4792超纯水1.4983总体积33、检测PCR扩增片段，获得SNP分子标记PCR扩增在水浴热循环仪中完成，TouchdownPCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。反应完成后利用扫描仪Pherastar对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形，根据结果分析如果扩增的第22位碱基为A，则待测水稻为镉低积累水稻，若碱基种类为G，则判定待测水稻不是镉低积累水稻。本发明中使用的LGCSNPline基因分型平台与其配套试剂耗材均购于英国LGC公司。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。<110>华智水稻生物技术有限公司<120>水稻镉低积累基因OsHMA3的SNP分子标记及其应用<130>KHP161117620.2<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>54<212>DNA<213>水稻<220><221>misc_feature<222>(22)..(22)<223>nisa,org<400>1atgcctgttagagacaaaactncttgggcgaagatgaatggagtgaaggtcaac54<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2atgcctgttagagacaaaactg22<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>3ataatgcctgttagagacaaaacta25<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4ggttgaccttcactccattc20当前第1页1 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