本发明涉及分子遗传学领域，特别涉及一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法。
背景技术：
端粒(Telomeres)位于染色体的末端是存在于真核细胞线状染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体，长约5-15kb，由一串5’-3’方向的“TTAGGG”短片段重复序列和与之结合的蛋白组成，产生一个称为端粒体的特殊结构来保护染色体的稳定性，防止其末端发生融合和降解。它除了提供非转录DNA的缓冲物外，还能保护染色体末端免于融合和退化，在染色体定位、复制、保护和控制细胞生长及寿命方面具有重要作用，并与细胞凋亡、细胞转化和永生化密切相关。
人端粒蛋白包括端粒结合蛋白与端粒相关蛋白，端粒结合蛋白包括TRF1、TRF2、hPOT1；端粒相关蛋白包括TIN2、TERT、Ku70、TPP1、RAP1、TANK1、TANK2、Pinx1、hRap1等。电镜观察发现，正常端粒在染色体末端形成一个稳定的T环(T-loop)结构，3’的DNA单链回转伸入DNA双链使部分双链解螺旋，与互补链配对结合后形成一个稳定的G4联体结构，这样的结构使得染色体的末端被包裹保护起来而防止降解和末端融合。
随着细胞有丝分裂中染色体的周期性复制，端粒长度会逐渐缩短，环境因素如吸烟、氧化应激、饮食和肥胖都会加速端粒的缩短，从而影响染色体的稳定性。研究发现，端粒长度随年龄增大而逐渐缩短，青年时期的端粒长度耗损较快，处于一个平台期，在30-50岁、50-80岁这两个年龄段的端粒长度耗损变慢，端粒长度变短。端粒长度也存在性别差异，女性端粒长度要长于男性，并且随着后天雌激素影响，女性的端粒损耗比男性缓慢，但是女性在绝经之后的端粒耗损相较之前变快。
大量研究表明，缩短的端粒与多种肿瘤，如前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌的发病风险以及死亡率有关，也与年龄相关性疾病和代谢疾病有所关联，如阿尔兹海默综合症、心梗、II型糖尿病、血管性痴呆、动脉粥样硬化和早衰综合征等。因此，端粒长度被认为是一种恒量人体机能的重要指标，建立一种通用有效的端粒长度测定方法对预防人体衰老和肿瘤等方便具有重要意义。
科学家们从上世纪80年代就开始研究端粒长度的测定，并陆续建立了一系列检测端粒长度的方法，如FISH、Southern Blot、Flow-FISH等，在这些方法中Southern Blot比较直观，但要求的基因组较大(＞1ug)，同时其操作比较繁琐，耗时长。而利用FISH平台的一系列检测方法尽管快速便捷，但对样品的要求较高。不利于技术的推广应用。
技术实现要素：
为了解决以上技术问题，本发明提供一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法，采用定量聚合酶链式反应(q-PCR)进行高通量的白细胞端粒长度(LTL)的检测，该方法对样本和基因组DNA浓度要求不高，实验操作流程简单可行，结果可信度高，适用于科研和临床的推广使用，对于衰老、癌症和疾病的预防有重要作用。
本发明的一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法，包括如下步骤：
1)提取不同组织的基因组DNA，稀释DNA样本浓度至5ng/ul，取各组织样本5ul合并混合后制成全基因组DNA模板；
2)进行第一次实时定量PCR检测，检测端粒重复序列的端粒引物为：
SEQ ID NO.1：CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT；
SEQ ID NO.2：GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT；
3)进行第二次实时定量PCR检测，转录RNase P酶的单拷贝参照RNase P基因；
4)计算相对端粒长度T/S。
进一步的，所述步骤1)的基因组DNA提取自血液、组织、唾液、精子或卵子的组织细胞。
进一步的，所述步骤1)的提取方法包括酚/氯仿法、自动提取仪提取法或过柱离心试剂盒法。
进一步的，所述步骤2)的第一次实时定量PCR检测和步骤3)的第二次实时定量PCR检测采用的染料均为SYBR Green I。
进一步的，所述步骤2)的第一次实时定量PCR检测和步骤3)的第二次实时定量PCR检测均为检测样本设置三个平行孔，并设置模板DNA的五个梯度浓度，比例为1、0.5、0.25、1.25、0.625，每个梯度设置三个平行孔，制作标准曲线。
进一步的，所述步骤2)的端粒重复序列检测的PCR反应体系为一定配比的SuperReal Premix Plus，SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，DNA混合物；总反应体积为10ul；反应条件为：98℃，10min一个循环；95℃30s，60℃1min，共45个循环。
进一步的，所述步骤3)的转录RNase P酶的单拷贝参照RNase P基因的PCR反应体系为一定配比的Taqman Expression Master Mix，RNase P，DNA混合物，总反应体积为10ul；反应条件为：98℃，10min一个循环；95℃30s，60℃1min，共45个循环。
本发明提供了一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法，提供了检测端粒长度的引物和单基因拷贝参照。端粒重复序列拷贝数(Telomere repeat copy number，T)与单拷贝基因拷贝数(Single-gene copy number，S)的比值(T/S ratio)和端粒长度成正比关系，本发明的相对平均端粒长度通过计算T/S的比例得到。计算公式为：LTL＝mean Quantity(LTL组)/mean Quantity(RNase P组)。
本发明一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法具有的有益效果有：对样本和基因组DNA浓度要求不高，实验操作流程简单可行，结果可信度高，适用于科研和临床的推广使用，对于衰老、癌症和疾病的预防有重要作用。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例的一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法，包括如下步骤：
1)提取不同组织的基因组DNA，稀释DNA样本浓度至5ng/ul，取各组织样本5ul合并混合后制成全基因组DNA模板；
提取全基因组DNA：基因组DNA来自血液、组织、唾液、精子或卵子，采用酚/氯仿法提取全基因组DNA的具体步骤如下：
(1)将冻存的抗凝血在室温解冻、混匀；
(2)取200ul新鲜血液放入1.5ml离心管中；
(3)加入200ul细胞裂解液，30ul Proteinase K，vortex 15s混匀，55℃中水浴10min；
(4)加入等体积苯酚，约500ul，vortex 15s，12000rpm离心5min；
(5)取上清，加入等体积酚/氯仿/异戊醇，约500ul，vortex 15s，12000rpm离心5min；
(6)取上清，加入等体积氯仿，约500ul，vortex 15s，12000rpm离心5min；
(7)取上清，加入2倍体积的无水乙醇，约800ul，vortex 15s，12000rpm离心8min；
(8)去上清，加入1ml 75％乙醇，悬浮沉淀，12000rpm离心5min；
(9)去上清，放置10min晾干；
(10)加入100ul ddH2O，室温放置5min，吹打混匀即为提好的DNA液；
2)以染料法进行第一次实时定量PCR检测，在PCR反应过程中，每形成一个DNA双链就有一定量的染料结合上去而产生荧光信号，SYBR Green I结合到DNA双螺旋小沟区域，信号强度和DNA分子总数成正比关系，本发明所用端粒长度检测引物如下：
SEQ ID NO.1：CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT
SEQ ID NO.2：GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT
反应体系为：4.3ul 2×SuperReal Premix Plus，0.3ul SEQ ID NO.1(10uM)，0.3ul SEQ ID NO.2(10uM)，5ul DNA(1-5ng/ul)，总反应体积为10ul，反应条件为：98℃10min一个循环；95℃30s，60℃1min，共45个循环；
检测时，每个检测样本设置三个平行孔，并设置模板DNA的五个梯度浓度，比例为(1、0.5、0.25、1.25、0.625)，每个梯度设置三个平行孔，制作标准曲线。
3)以染料法进行第二次实时定量PCR检测，转录RNase P酶的单拷贝参照RNase P基因；反应体系为：4.7ul 2×Taqman Expression Master Mix，0.3ul RNase P，5ul DNA(5ng/ul)。总反应体积为10ul；反应条件为：98℃10min一个循环；95℃30s，60℃1min，共45个循环；检测时，每个检测样本设置三个平行孔，并设置模板DNA的五个梯度浓度，比例为(1、0.5、0.25、1.25、0.625)，每个梯度设置三个平行孔，制作标准曲线；
4)计算相对端粒长度T/S；相对平均端粒长度通过计算T/S的比例得到，计算公式为：LTL＝mean Quantity(LTL组)/mean Quantity(RNase P组)。
本实施例一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法具有的有益效果有：对样本和基因组DNA浓度要求不高，实验操作流程简单可行，结果可信度高，适用于科研和临床的推广使用，对于衰老、癌症和疾病的预防有重要作用。
实施例2
本实施例的一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法，包括如下步骤：
1)提取不同组织的基因组DNA，稀释DNA样本浓度至5ng/ul，取各组织样本5ul合并混合后制成全基因组DNA模板；
提取全基因组DNA：基因组DNA来自血液、组织、唾液、精子或卵子，采用QuickGene610L自动提取仪提取全基因组DNA的具体步骤如下：
1)将冻存的抗凝血在室温解冻、混匀；
2)取新的15ml离心管，依次加入300ml EDB溶液、2ml全血、2.5ml LDB溶液；
3)上下颠倒混匀，vortex 15s，55℃中水浴10min；
4)加入2.5ml无水乙醇，混匀，vortex 15s；
5)将处理过的全血倒入QuickGene 610L带膜的套管内；
6)上机，第一次抽提选择模式“DNA WHOLE BLOOD”，按start开始；
7)第二次抽提选择模式“INSOLUTION A”；
8)结束后得到样本DNA溶液；
2)以染料法进行第一次实时定量PCR检测，在PCR反应过程中，每形成一个DNA双链就有一定量的染料结合上去而产生荧光信号，SYBR Green I结合到DNA双螺旋小沟区域，信号强度和DNA分子总数成正比关系，本发明所用端粒长度检测引物如下：
SEQ ID NO.1：CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT
SEQ ID NO.2：GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT
反应体系为：4.3ul 2×SuperReal Premix Plus，0.3ul SEQ ID NO.1(10uM)，0.3ul SEQ ID NO.2(10uM)，5ul DNA(1-5ng/ul)，总反应体积为10ul，反应条件为：98℃10min一个循环；95℃30s，60℃1min，共45个循环；
检测时，每个检测样本设置三个平行孔，并设置模板DNA的五个梯度浓度，比例为(1、0.5、0.25、1.25、0.625)，每个梯度设置三个平行孔，制作标准曲线。
3)以染料法进行第二次实时定量PCR检测，转录RNase P酶的单拷贝参照RNase P基因；反应体系为：4.7ul 2×Taqman Expression Master Mix，0.3ul RNase P，5ul DNA(5ng/ul)。总反应体积为10ul；反应条件为：98℃10min一个循环；95℃30s，60℃1min，共45个循环；检测时，每个检测样本设置三个平行孔，并设置模板DNA的五个梯度浓度，比例为(1、0.5、0.25、1.25、0.625)，每个梯度设置三个平行孔，制作标准曲线；
4)计算相对端粒长度T/S；相对平均端粒长度通过计算T/S的比例得到，计算公式为：LTL＝mean Quantity(LTL组)/mean Quantity(RNase P组)。
本实施例一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法具有的有益效果有：对样本和基因组DNA浓度要求不高，实验操作流程简单可行，结果可信度高，适用于科研和临床的推广使用，对于衰老、癌症和疾病的预防有重要作用。
实施例3
本实施例的一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法，包括如下步骤：
1)提取不同组织的基因组DNA，稀释DNA样本浓度至5ng/ul，取各组织样本5ul合并混合后制成全基因组DNA模板；
提取全基因组DNA：基因组DNA来自血液、组织、唾液、精子或卵子，采用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒提取全基因组DNA的具体步骤如下：
1)取200ul新鲜血液置于1.5ml离心管中；
2)加入200ul细胞裂解液，30ul Proteinase K，vortex 15s混匀，55℃中水浴10min；
3)往离心管内加入200ul无水乙醇，vortex 15s混匀；
4)将离心管内液体转移至新的QIAamp Mini spin column中；
5)8000rpm离心1min，弃液体，加入500ul Buffer AW1；
6)8000rpm离心1min，弃液体，加入500ul Buffer AW2；
7)13000rpm离心3min，弃液体；
8)13000rpm离心3min，弃液体；
9)将spin管转移至新的干净的1.5ml离心管中，加入200ul Buffer AE，室温放置5-10min；
10)8000rpm离心1min，离下的液体即为组织DNA溶液；
2)以染料法进行第一次实时定量PCR检测，在PCR反应过程中，每形成一个DNA双链就有一定量的染料结合上去而产生荧光信号，SYBR Green I结合到DNA双螺旋小沟区域，信号强度和DNA分子总数成正比关系，本发明所用端粒长度检测引物如下：
SEQ ID NO.1：CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT
SEQ ID NO.2：GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT
反应体系为：4.3ul 2×SuperReal Premix Plus，0.3ul SEQ ID NO.1(10uM)，0.3ul SEQ ID NO.2(10uM)，5ul DNA(1-5ng/ul)，总反应体积为10ul，反应条件为：98℃10min一个循环；95℃30s，60℃1min，共45个循环；
检测时，每个检测样本设置三个平行孔，并设置模板DNA的五个梯度浓度，比例为(1、0.5、0.25、1.25、0.625)，每个梯度设置三个平行孔，制作标准曲线。
3)以染料法进行第二次实时定量PCR检测，转录RNase P酶的单拷贝参照RNase P基因；反应体系为：4.7ul 2×Taqman Expression Master Mix，0.3ul RNase P，5ul DNA(5ng/ul)。总反应体积为10ul；反应条件为：98℃10min一个循环；95℃30s，60℃1min，共45个循环；检测时，每个检测样本设置三个平行孔，并设置模板DNA的五个梯度浓度，比例为(1、0.5、0.25、1.25、0.625)，每个梯度设置三个平行孔，制作标准曲线；
4)计算相对端粒长度T/S；相对平均端粒长度通过计算T/S的比例得到，计算公式为：LTL＝mean Quantity(LTL组)/mean Quantity(RNase P组)。
本实施例一种基于qPCR法检测白细胞端粒长度的方法具有的有益效果有：对样本和基因组DNA浓度要求不高，实验操作流程简单可行，结果可信度高，适用于科研和临床的推广使用，对于衰老、癌症和疾病的预防有重要作用。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。