本发明涉及一种鱼类神经坏死病毒纳米探针的制备方法。
背景技术：
鱼类神经坏死病毒是单链RNA病毒，属于野田村病毒科乙型野田村病毒属。该病毒是鱼类病毒性神经坏死病的病原，能够引起鱼苗的大量死亡。其分布范围广泛，在亚洲、欧洲、澳洲、北美洲等地都有该病毒流行的报道。检测鱼类神经坏死病毒已有酶联反应吸附实验法、荧光抗体法、RT-PCR法等，但这些方法样品制备复杂、检测时间长，不适合于该病毒的快速现场检测。
近年来，一种无须样品制备，可实时、原位、快速检测病原微生物和生物大分子的表面增强拉曼散射技术，在疾病诊断和生物分析领域获得越来越多的应用。其中基于纳米银颗粒的SERS纳米探针技术已被成功用于基因检测的研究和人类病毒感染的检测，其检测极限能达到0.5fM的DNA模板。但是还没有此技术用于动物及水产病原检测的报道。
技术实现要素：
本发明提出一种鱼类神经坏死病毒纳米探针的制备方法。
一种鱼类神经坏死病毒纳米探针的制备方法,包括以下步骤：
（1）选择鱼类神经坏死病毒RNA2基因序列的特异性区段，使用软件设计发夹型探针，在探针的5'端用巯基进行修饰，在探针的3'端用Cy3标记，所述探针序列为：5'-dithiol-A（5）CGCATCGTAGTCAATGGACAGCGGACGGATGCG-Cy3-3，下划线部分是探针的臂端，中间部分为鱼类神经坏死病毒的特异性序列，构成探针的环区；
（2）将10ml20mM的硝酸银溶液迅速倒入90mL含有1.67mM的盐酸羟胺和3.3mM氢氧化钠的混合液中，同时磁力搅拌；
（3）将制得的纳米银溶胶分为两组，一组置于室温下，另一组置于4℃冰箱中，均避光保存；
（4）将1μM巯基化的发夹型探针和1mM的MgCl2溶液充分混匀，室温避光条件下静置5h左右；
（5）加入等体积的纳米银溶胶，混匀，在摇床上轻微摇晃1d，加入少量NaCl溶液，使其终浓度为5mM，静置1d；
（6）重复3次加NaCl溶液；然后加入6-巯基-1-己醇使其终浓为1mM，混匀静置10min，以置换掉非特异结合的发夹型探针；
（7）以13400r/m离心15min，取沉淀用20mMTris-HCl，将pH调至8.0缓冲液重新悬浮；离心过程重复三次；
（8）取制备好的纳米探针Ag-NNV，加入巯基乙醇使其终浓度为1mM，混匀静置24h，将结合于纳米银颗粒上的NNV发夹型探针置换出，即得。
优选地，所述步骤（2）磁力搅拌速度为500rpm。
本发明所述方法制备的纳米探针生物学性能良好，可用于SERS 法检测鱼类神经坏死病毒。本研究为应用纳米探针技术检测水生动物病原做了有益的探索，基于纳米探针的检测技术有望成为一种快速检测水产病原微生物的方法。
具体实施方式
实施例1。
一种鱼类神经坏死病毒纳米探针的制备方法,包括以下步骤：
（1）选择鱼类神经坏死病毒RNA2基因序列的特异性区段，使用软件设计发夹型探针，在探针的5'端用巯基进行修饰，在探针的3'端用Cy3标记，所述探针序列为：5'-dithiol-A（5）CGCATCGTAGTCAATGGACAGCGGACGGATGCG-Cy3-3，下划线部分是探针的臂端，中间部分为鱼类神经坏死病毒的特异性序列，构成探针的环区；
（2）将10ml20mM的硝酸银溶液迅速倒入90mL含有1.67mM的盐酸羟胺和3.3mM氢氧化钠的混合液中，同时磁力搅拌；
（3）将制得的纳米银溶胶分为两组，一组置于室温下，另一组置于4℃冰箱中，均避光保存；
（4）将1μM巯基化的发夹型探针和1mM的MgCl2溶液充分混匀，室温避光条件下静置5h左右；
（5）加入等体积的纳米银溶胶，混匀，在摇床上轻微摇晃1d，加入少量NaCl溶液，使其终浓度为5mM，静置1d；
（6）重复3次加NaCl溶液；然后加入6-巯基-1-己醇使其终浓为1mM，混匀静置10min，以置换掉非特异结合的发夹型探针；
（7）以13400r/m离心15min，取沉淀用20mMTris-HCl，将pH调至8.0缓冲液重新悬浮；离心过程重复三次；
（8）取制备好的纳米探针Ag-NNV，加入巯基乙醇使其终浓度为1mM，混匀静置24h，将结合于纳米银颗粒上的NNV发夹型探针置换出，即得。
实施例2。
一种鱼类神经坏死病毒纳米探针的制备方法,包括以下步骤：
（1）选择鱼类神经坏死病毒RNA2基因序列的特异性区段，使用软件设计发夹型探针，在探针的5'端用巯基进行修饰，在探针的3'端用Cy3标记，所述探针序列为：5'-dithiol-A（5）CGCATCGTAGTCAATGGACAGCGGACGGATGCG-Cy3-3，下划线部分是探针的臂端，中间部分为鱼类神经坏死病毒的特异性序列，构成探针的环区；
（2）将10ml20mM的硝酸银溶液迅速倒入90mL含有1.67mM的盐酸羟胺和3.3mM氢氧化钠的混合液中，同时磁力搅拌；
（3）将制得的纳米银溶胶分为两组，一组置于室温下，另一组置于4℃冰箱中，均避光保存；
（4）将1μM巯基化的发夹型探针和1mM的MgCl2溶液充分混匀，室温避光条件下静置5h左右；
（5）加入等体积的纳米银溶胶，混匀，在摇床上轻微摇晃1d，加入少量NaCl溶液，使其终浓度为5mM，静置1d；
（6）重复3次加NaCl溶液；然后加入6-巯基-1-己醇使其终浓为1mM，混匀静置10min，以置换掉非特异结合的发夹型探针；
（7）以13400r/m离心15min，取沉淀用20mMTris-HCl，将pH调至8.0缓冲液重新悬浮；离心过程重复三次；
（8）取制备好的纳米探针Ag-NNV，加入巯基乙醇使其终浓度为1mM，混匀静置24h，将结合于纳米银颗粒上的NNV发夹型探针置换出，即得；
（9）所述步骤（2）磁力搅拌速度为500rpm。