一种鉴定黄牛肉真伪的检测方法与流程

本发明属于食品健康领域，特别涉及一种鉴定黄牛肉真伪的检测方法。

背景技术：

肉是人类优质蛋白质和多种营养素的主要来源，含有丰富的必需氨基酸和多种微量元素。近年来，肉的掺假和欺诈行为越来越受到人们的关注。在“马肉风波”事件之前，国内早已爆出应用化学药物处理的“假鱼翅”、以及牛肉膏处理的猪肉或鸭肉冒充牛肉等事件。这不仅涉及到食品掺假欺诈的商业行为而且涉及到民族和宗教信仰问题。因此，基于经济和宗教方面的考虑，肉的物种鉴定具有非常重要的意义。另一方面，对加工食品而言，物种的原始可识别形态特征消失，使得物种的鉴别变得相对困难。目前关于肉的物种鉴定方法有：感官分析，解剖和组织学鉴定，显微技术，化学方法，电泳法，色谱法以及免疫学技术等方法。但是，因加工后的肉品大多已改变其原始形态，采用这些方法通常不能做出正确判断。目前迫切需要一些更灵敏和可靠的检测方法来鉴定动物食品或动物源性加工食品的物种来源。

正是在这样的背景下，发展了各种基于DNA的分子鉴定技术，如PCR,PCR-RFLP,Real-time PCR,DNA条形码技术等。尽管目前的分子技术已经用于许多肉的物种鉴定，如猪肉，鸭肉，鸡肉，鹅肉，牛肉，鹿肉，鱼肉等。

黄牛是中国固有的普通牛种。黄牛肉质鲜美，品质优良，蛋白质含量高，矿物质丰富，脂肪少，且脂肪中胡萝卜素含量丰富，是广受消费者青睐的天然绿色食品。但是，基于黄牛肉需求量大，黄牛肉的价格相对于猪肉、鱼肉更高，这样一来，为了经济利益，不法商贩利用其它肉类加工后充当黄牛肉在市场上进行销售，严重损害了消费者的权益，也带来了诸多的食品安全隐患。如何进行黄牛肉的真伪鉴定显得非常重要。目前，关于黄牛肉真伪鉴定技术方面的研究报道还不多，国内外报道的文献也只有寥寥几篇，因此，还需要不断开发新的更加快速的方法。

基于以上的分析和目前迫切的需求，本领域技术人员致力于开发一种能够简单、快速、准确鉴定黄牛肉真伪的技术。为目前市场上售卖的黄牛肉及其制品的监督提供急需的技术支持，也为消费者的利益提供技术保障，将具有良好的应用前景和推广价值。

技术实现要素：

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种鉴定黄牛肉真伪的检测方法。

本发明的第一方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒用于黄牛肉的鉴定，所述试剂盒中包括引物对：

上游引物：5’-CACACCTCCAAACAACGAAGC-3’(SEQ ID NO.1)；和

下游引物：5’-TACATTACCCCTTGCGTAGGT-3’(SEQ ID NO.2)。

进一步地，所述试剂盒还包括DNA提取试剂。

进一步的，所述DNA提取试剂选自下组的一种或多种：

TE缓冲液、约10％(w/v)的SDS溶液、约10mg/mL的蛋白酶K、约5M NaCl、CTAB/NaCl、和体积体积比约为24：1的氯仿/异戊醇溶液。

进一步地，所述试剂盒还包括用于PCR扩增的试剂。

进一步地，所述用于PCR扩增的试剂选自下组的一种或多种：

不含Mg²⁺的10×PCR缓冲液、约25mM的MgCl₂、约2.5mM的dNTPs、约5U/l的Taq DNA聚合酶、和超纯水。

本发明的第二方面，提供了一种鉴定黄牛肉真伪的检测方法，所述方法包括步骤：

1)DNA提取

提供待测样品，并自所述待测样品中提取DNA，作为后续PCR扩增的模板；

2)PCR扩增

使用如下引物对，对步骤1)获得的DNA进行扩增：

上游引物：5’-CACACCTCCAAACAACGAAGC-3’(SEQ ID NO.1)；和

下游引物：5’-TACATTACCCCTTGCGTAGGT-3’(SEQ ID NO.2)；

3)结果鉴定

对步骤2)中获得的PCR扩增产物进行电泳，观察电泳结果，黄牛肉的扩增片段大小为534bp，如有534bp大小的片段，则判定结果为阳性，所述待测样品是黄牛肉；如无534bp大小的片段，则判定结果是阴性，所述待测样品不是黄牛肉。

进一步地，所述步骤1)将提取的DNA浓度稀释至约100ng/l作为后续PCR扩增的模板。

进一步地，所述步骤1)包括步骤：

将待测样品在液氮中研磨成细粉；取1.0g细粉于15ml的离心管中，加入TE缓冲液1.8ml，放入70℃水浴10min，加入200 l的10％SDS,10uL的10mg/mL的蛋白酶K，70℃水浴15min，取出后加入200 l的5M NaCl，以及70 l的CTAB/NaCl，70℃水浴15min，-20℃放置30min，取出加入等体积的24：1的氯仿/异戊醇混匀，离心取上清；重复上述步骤一次；最后用2倍体积的冰无水乙醇混匀，-20℃静置45min，离心取上清，沉淀用70％的乙醇洗涤，干燥，沉淀溶于50l双蒸水中，使用超微量核算蛋白质测定仪，将DNA浓度稀释至100ng/l左右作为后续PCR扩增的模板。

进一步地，所述步骤2)中，PCR扩增体系包括：

不含Mg²⁺的10×PCR缓冲液2 l，浓度为25mM的MgCl2 1.6 l，浓度为2.5mM的dNTPs 1.2 l，所述上游引物和所述下游引物的10M混合物1 l，5U/l的Taq DNA聚合酶0.2 l，超纯水补充至20 l。

进一步地，所述步骤2)中，PCR扩增反应程序为：

95℃预变性5min，95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸1min；40个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存。

进一步地，所述步骤3)中，电泳条件为：取10 l PCR产物与1 l的6×上样缓冲液混合，2.0％的琼脂糖凝胶上进行点样，120V条件下电泳25min。

本发明的有益效果在于：本发明设计的引物仅针对黄牛物种的COI基因序列进行特异性扩增，其他哺乳动物不能扩增出来，并且采用普通PCR即可进行黄牛肉的鉴定，不需要进行酶切和测序。本发明操作方便，检测时间短，监测结果准确，灵敏度高，具有很好的应用前景，满足于市场监督检测。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是采集的8份不同黄牛肉样品采用该发明进行检测的凝胶电泳图。

图中1-8泳道表示是1-8份不同的黄牛肉样品；M为DNA分子标准；N为阴性对照。8份黄牛鲜肉样品均能检测出534bp的阳性条带，表明所检样品属于黄牛肉。

图2是采集的8种不同来源和物种的鲜肉样品采用该发明进行检测的凝胶电泳图。

图中1-8泳道分别为新鲜鸡肉，猪肉，鸭肉，鱼肉，黄牛肉，兔肉，冷冻黄牛肉，黄牛肉干样品；M为DNA分子标准；N为阴性对照；P为阳性对照。5种不同物种的样品中，只有5号泳道的新鲜黄牛肉样品，7号冷冻黄牛肉样品和8号的黄牛肉干样品能够扩增出534bp的阳性条带，其他样品未出现扩增条带，表明该发明具有很好的特异性。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

本发明中针对黄牛特有的基因，设计了数十对的引物进行测试，其中有些引物对虽然特异性较好，但是扩增不稳定，结果准确率较低，容易造成假阴性的结果。最终获得了特异性好，扩增稳定的黄牛肉特征引物COI-F(5’-CACACCTCCAAACAACGAAGC-3’(SEQ ID NO.1))和COI-R(5’-TACATTACCCCTTGCGTAGGT-3’(SEQ ID NO.2))，对黄牛肉样品进行监测，测试了50个批次，结果准确率100％，说明PCR扩增的稳定性极好。该引物对针对黄牛物种(Bostaurus)的特异性基因COI基因(NC_006853.1)，扩增片段长度534bp。

实施例1

为了便于直观理解本发明的技术方案，在上海市各区菜场采集新鲜黄牛样品8份，按照上述方法进行检测。

1.DNA提取：将新鲜的动物肌肉组织取下一小块，切碎后放入研钵中加入液氮，快速将组织在液氮中捣碎并研磨成细粉；取1.0g细粉于15ml的离心管中，加入TE缓冲液(10mM Tris.C1,1mM EDTA,pH8.0；CTAB/NaCl为1％CTAB,0.73M NaCl)共1.8ml，放入70℃水浴10min，加入200 l的10％SDS,10uL的10mg/mL的蛋白酶K，70℃水浴15min，取出后加入200 l的5M NaCl，以及70 l的CTAB/NaCl，70℃水浴15min，-20℃放置30min，取出加入等体积的24：1的氯仿/异戊醇混匀，离心取上清；重复上述步骤一次；最后用2倍体积的冰无水乙醇混匀，-20℃静置45min，离心取上清，沉淀用70％的乙醇洗涤，干燥，沉淀溶于50 l双蒸水中，使用超微量核算蛋白质测定仪，将DNA浓度稀释至100ng/l左右作为模板。

2.PCR:PCR扩增采用20 l的体系，DNA模板1 l，不含Mg²⁺的10×PCR缓冲液2 l，浓度为25mM的MgCl2 1.6 l，浓度为2.5mM的dNTPs 1.2 l，黄牛肉特征上游引物和下游引物的10 M混合物1 l，5U/l的Taq DNA聚合酶0.2 l，如超纯水补充至20 l；PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸1min；40个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存。

3.电泳检测：取10 L PCR产物(使用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2引物扩增)与1 L L的6×Loading buffer(上样缓冲液)混合，2.0％的琼脂糖凝胶上进行点样，120V条件下电泳40min，然后采用凝胶成像系统拍照。

4.结果鉴定：观察电泳结果，上述9份黄牛肉的扩增片段大小都为534bp，结果为阳性，8份样品证实都是黄牛肉，结果见附图1。

实施例2

为了便于直观理解本发明的技术方案，在市场上采集新鲜牛肉，鸡肉，猪肉，鸭肉，兔肉，羊肉和鱼肉，按照上述方法进行检测。

1.DNA提取：将新鲜的动物肌肉组织取下一小块，切碎后放入研钵中加入液氮，快速将组织在液氮中捣碎并研磨成细粉；取1.0g细粉于15ml的离心管中，加入TE缓冲液(10mM Tris.C1,1mM EDTA,pH8.0；CTAB/NaCl为1％CTAB,0.73M NaCl)共1.8ml，放入70℃水浴10min，加入200 l的10％SDS,10uL的10mg/mL的蛋白酶K，70℃水浴15min，取出后加入200 l的5M NaCl，以及70 l的CTAB/NaCl，70℃水浴15min，-20℃放置30min，取出加入等体积的24：1的氯仿/异戊醇混匀，离心取上清；重复上述步骤一次；最后用2倍体积的冰无水乙醇混匀，-20℃静置45min，离心取上清，沉淀用70％的乙醇洗涤，干燥，沉淀溶于50 l双蒸水中，使用超微量核算蛋白质测定仪，将DNA浓度稀释至100ng/l左右作为模板。

2.PCR:PCR扩增采用20 l的体系，DNA模板1 l，不含Mg²⁺的10×PCR缓冲液2 l，浓度为25mM的MgCl₂ 1.6 l，浓度为2.5mM的dNTPs 1.2 l，黄牛肉特征引物COI-F(5’-CACACCTCCAAACAACGAAGC-3’)和COI-R(5’-TACATTACCCCTTGCGTAGGT-3’)的10 M混合物1 l，5U/l的Taq DNA聚合酶0.2 l，如超纯水补充至20 l；PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸1min；40个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存。

3.电泳检测：取10 L PCR产物与1 L L的6×Loading buffer(上样缓冲液)混合，2.0％的琼脂糖凝胶上进行点样，120V条件下电泳40min，然后采用凝胶成像系统拍照。

4.结果鉴定：观察电泳结果，只有黄牛肉的扩增片段大小都为534bp，其他肉品均未扩增出条带，结果见附图2。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 河南省产品质量监督检验院

<120> 一种鉴定黄牛肉真伪的检测方法

<130> 0001

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cacacctcca aacaacgaag c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tacattaccc cttgcgtagg t 21