用于检测鸡源成分的内标基因及其应用的制作方法

本发明涉及生物物种鉴定和PCR检测技术领域，具体的说涉及一种用于检测鸡源成分的内标基因及其应用。

背景技术：

随着社会经济和产品技术加工的发展，很多食品被非法添加各种化学原料、添加剂、激素等，甚至很多商家为谋求高额利益进行食品掺假行为或直接以次充好，这严重危害了消费者的利益和身体健康，因此对食品种类的准确鉴定至关重要。

无论在国内还是国外，鸡肉都是日常消费的主要肉类，其重要性不言而喻。在欧洲，鸡肉占据了主要市场，超市供应着60％的鸡肉加工品，火鸡更是被普遍消费。在中国，鸡肉是传统的家禽肉，随着种类繁多的国外快餐进入中国市场，鸡肉被加工成了各种产品。然而越来越多的商家为获取高额利益，用激素和抗体喂养鸡使其加速增长，饲养过程中在鸡饲料中添加鸡成分会引发“疯鸡病”，更有不法商家用便宜的鸡肉掺假牛羊肉，以谋取暴力等。而鸡肉污染可能引发全球性食品安全问题，利用鸡的内标准基因和分子技术检测鸡肉掺假是一种有效的检测手段。

目前，内标准基因已被广泛地用于鉴别食品掺假，但如何筛选出合适的内标准基因显得尤为重要。目前国内外的肉制品掺假检测技术多是针对线粒体上的基因设计特异引物来进行实时荧光定量PCR扩增，由于线粒体基因为多拷贝基因，其检测灵敏度高，但同时在区分由于销售、运输等过程所产生的无意识交叉污染与有意识的非法添加时存在困扰。另外，高拷贝数线粒体DNA的浓度无法和基因组DNA的浓度相对应，因此无法对样品进行精确定量分析，同时由于线粒体 基因同源性极高，难以通过普通PCR实现定性检测。因此，该方法只能借助荧光定量PCR实现肉类掺假的筛选鉴别。若要鉴别低浓度的无意交叉污染和有意非法添加并明确掺假比例实现快速筛查，则要选择染色体上的低拷贝基因作为肉类内标准基因。

技术实现要素：

本发明的目的是提供用于检测鸡源成分的鸡源通用内标基因Actb。

本发明另一目的在于提供以该内标基因Actb为靶基因建立的检测方法。

一种用于检测食品及饲料中鸡源成分的基因，其为内标基因Actb，具有SEQ ID NO.1所示的序列。

本发明提供了上述内标基因Actb在检测鸡源成分中的应用。

本发明提供了上述内标基因Actb在食品或饲料中鸡成分鉴定中的应用。

本发明提供了一种用于PCR方法检测上述内标基因Actb的特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2、3所示。

本发明提供的上述特异性引物在检测鸡源成分中的应用。

本发明提供了含有上述特异性引物的试剂盒。

含有上述2条引物和1条探针的试剂盒属于本发明的保护范围，所述1条探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示或如SEQ ID NO.7所示。

进一步地，本发明还提供了含有2条引物和2条探针的试剂盒，所述2条引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2、3所示，所述2条探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4、7所示。

本发明提供的上述试剂盒在检测鸡源成分中的应用。

数字PCR方法通常用于对核酸的绝对定量分析，本发明发现数字PCR还能够用于检测基因的拷贝数。因此该发现也属于本发明的保护范围。

在本发明的一个实施例中，采用数字PCR方法方法鉴定鸡源内标基因Actb，结果与Southern blot方法检测内标基因Actb拷贝数的结果一致。所用的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、3所示，与引物配合使用的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明首次在染色体上筛选出鸡源内标准基因，且拷贝数为单拷贝。本发明用多个品种鸡验证内标准基因，证明该内标准基因稳定不存在等位基因变异。内标准基因的选择一般要求拷贝数低且稳定，一般动物内标准基因常选择在线粒体上，这样的内参基因拷贝数多，不易于定量。本发明选择染色体上的基因做为内标准基因，其拷贝数地易于定量，相比于线粒体上的基因，突变率更低。本发明采取数字PCR以及southern杂交两种方式，进行拷贝数的鉴定。结合Ensembl基因信息数据库数据，确定了Actb基因的拷贝数为单拷贝，同时确定了数字PCR在验证拷贝数上的准确性，可以推广至其他物种。

基于本发明确定的用于检测食品及饲料中鸡源成分的内标准基因Actb，本发明设计了用于检测该基因的定性PCR、定量PCR和数字PCR的引物和/或探针，建立了检测鸡源成分的相应PCR方法，这些方法费时少，特异性好，灵敏度高，操作简单，不需要专业人员操作，结果易于观察，非常适于基层食品监督检验使用。

附图说明

图1为基因同源性分析。

图2为普通家鸡、火鸡的Southern杂交结果，1,BamH1酶切普通家鸡；2,Nhe1酶切普通家鸡；3,BamH1酶切火鸡4,Nhe1酶切火鸡。

图3为Actb和Gcg扩增热点图。

图4为普通家鸡5个浓度梯度下的Actb/Gcg比值图，浓度分别为100,10,1,0.1,0.01ng/ul。

图5为Actb基因的定性PCR验证特异性，泳道1-21:1,普通家鸡；2,野鸡；3,火鸡；4,乌鸡；5,猪；6,牛；7,羊；8,马；9,驴；10,鸭；11,鹅；12, 狗；13,兔；14,鼠；15,鱼；16,牦牛；17,水牛；18,骆驼；19,貂；20,鹿；21,阴性；M:DNA Marker DL 2000。

图6为Actb基因的定量PCR验证特异性，其中1是野鸡，2是乌鸡，3是普通家鸡，4是火鸡。

图7为Actb基因的荧光定量PCR扩增曲线，其中1为100ng/ul，2为10ng/ul，3为1ng/ul，4为0.1ng/ul，5为0.01ng/ul，6为阴性。每个浓度做三个平行。

图8为Actb基因的荧光定量PCR标准曲线。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

猪(Sus scrofa),牛(Bos taurus)，羊(Ovis aries)，普通家鸡(Gallus gallus)，野鸡(Phasianuscolchicus)，火鸡(Meleagris gallopavo)，乌鸡(Gallus domesticus brisson)，鸭(Anas platyrhynchos)，鹅(Goose calicivirus),狗(Canis lupus familiaris)，兔(Oryctolagus cuniculus)，牦牛(Bos mutus)，黄鱼(Pseudosciaena polyactis)为超市购买。马(Equus caballus)，驴(Equus asinus)为北京农贸市场购买。老鼠(Mus musculus)由中国农业大学食品安全与分子生物学实验室提供。水牛(Bubalus bubalis)，貂(Martes zibellina)，骆驼(Camelus ferus)，鹿(Cervus)由天津出入境检验局的李宗梦博士提供。

实施例1鸡源通用内标基因Actb的筛选

通过搜索GenBank中关于鸡的基因信息，将目标基因组从NCBI下载，并保存为“.FASTA”格式。针对鸡的全基因组信息进行分析，利用BLAST和DNAMAN Version 4.0软件进行同源性分析，筛选出Actb基因，该基因位于染色体上，是细胞骨架肌动蛋白之一。将20种肉类(分别是普通家鸡(Gallus gallus),野鸡(Phasianuscolchicus)，火鸡(Meleagris gallopavo)，乌鸡(Gallus domesticus brisson)，猪(Sus scrofa),牛(Bos taurus),羊(Ovis aries),鸭(Anas platyrhynchos),鹅(Goose calicivirus),狗(Canis lupus familiaris),兔(Oryctolagus cuniculus),牦牛(Bos mutus),黄鱼(Pseudosciaena polyactis)，马(Equus caballus),驴(Equus asinus)，老鼠(Mus musculus)，水牛(Bubalus bubalis)，貂(Martes zibellina)，骆驼(Camelus ferus)，鹿(Cervus))的Actb基因导入DNAMAN Version 4.0，进行多序列特异性分析，序列比对结果保存为“.seq”格式。选择特异性高的片段再进行BLAST分析，查找数据库中序列同源性及特异性。最后通过对序列进行整合，确定最终的特异性目标基因β-Actin(Actb)基因可以作为内标准基因。该Actb片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2鸡源通用内标基因的验证

1、针对实施例1筛选的内部基因Actb，通过Primer Express 3.0设计软件(美国生命技术公司)针对Actb基因设计PCR及定量PCR引物和探针。

表1定性PCR、定量PCR及数字PCR所用引物和探针序列

注：FAM,TAMRA,VIC和BHQ1为4种荧光基团

2、拷贝数测定

采取数字PCR以及southern杂交两种方式，进行拷贝数的鉴定。结合Ensembl基因信息数据库数据，确定了Actb基因的拷贝数为单拷贝，同时确定了数字PCR在验证拷贝数上的准确性，可以推广至其他物种。

理想的内标准基因在相应的物种中应该拷贝数恒定并不存在等位基因变异。根据Actb基因利用引物Actb-1F/1R建立鸡源物种特异性PCR检测体系，用于分析内标准基因的中间特异性以及等位基因变异性，以保证内标准基因筛选的准确性。利用引物进行定性及定量分析后发现，Actb基因在鸡物种中不存在等位基因变异。对模板DNA进行10倍梯度稀释，利用引物Actb-1F/1R和探针Actb-1P进行荧光定量PCR对灵敏度分析，当DNA模板浓度最低至10pg时，依然能检测到荧光信号，根据标准曲线得到良好的线性方程为：y＝-3.196x+32.481，R²＝0.994。由前面拷贝数鉴定可知Actb基因在普通家鸡、火鸡、乌鸡和野鸡中均为单拷贝，由此可推测，该内参基因Actb和定量PCR体系同样也适合用于火鸡、乌鸡和野鸡的定量检测，其检测限为8个拷贝数。

为了鉴定Actb在鸡中的拷贝数，本发明设计了一对引物Actb-2F/2R扩增一段436bp DNA片段，该片段作为探针用于Southern blot。用Nhe1和BamH1分别切割鸡、火鸡的DNA，然后和436bp DNA片段杂交。由图2可知Nhe1和BamH1酶切的DNA片段中均只出现一条条带，这表明Actb基因在鸡和火鸡中为单拷贝。

此外，利用引物Actb-1F/1R和探针Actb-2P进行数字PCR做拷贝数分析。体系配置完成后，将反应体系转移至Droplet Generator Cartridge微滴生成卡的体系加样孔中，并在反应用油加样孔中加入70μL的数字PCR反应用油；加样完成后，将微滴生成卡转移至Droplet Generator微滴生成器中，启动仪器；微滴生成结束后，将生成完成后的微滴体系转移至96孔中封膜；将96孔板置于PCR仪中，PCR扩增程序为50℃热激活5min；95℃预变性5min；50个循环：95℃变性15s，60℃退火及延伸60s。扩增结束后，将96孔板取出，置于Droplet Reader微滴读取仪中进行微滴荧光读取；微滴信号采集采用FAM/VIC双通道荧光采集，荧光采集后，通过分析热点图确定荧光阈值限(2995)以确定阴性微滴和阳性微滴。

根据泊松分布，利用公式计算出每个通道的拷贝数。具体公式如下：

公式1：N(参照基因)＝-ln[(N-X)/N]×N

公式2：N(特异基因)＝-ln[(N-Y)/N]×N

其中，N(参照基因)和N(特异基因)分别表示计算出的参照基因(即单拷贝Gcg基因)和特异基因(即本实验Actb内标准基因)的拷贝数；N是总孔数，X表示参照基因对应的阳性孔数，Y表示特异基因对应的阳性孔数。

将鸡模板浓度定到100ng/ul，依次稀释5个浓度梯度，然后用数字PCR计算出Actb/Gcg的值，由图3可知，Actb/Gcg的值为1:1。Actb/Gcg的比值和误差限均由热点图自动生成。由图4可知，当模板浓度很高时，反应结果的稳定性依然很好，结果波动范围小，比值和误差限在1附近。随着浓度降低，虽然结果波动表现出较大差异，误 差限明显变宽，但Actb/Gcg的值在仍1左右。表明Actb/Gcg值的结果不受模板浓度的影响。Southern杂交结果和数字PCR结果一致，说明数字PCR是一种高效、快速、准确鉴定目标基因拷贝数的方法，可以应用数字PCR方法鉴定目标基因的拷贝数。

表2 Bio-Rad数字PCR平台反应体系

3、Actb基因的特异性鉴定及其等位基因变异的分析

利用设计的引物对Actb-1F/1R(见表1)对4种鸡物种(普通家鸡、火鸡、乌鸡、野鸡)和16种非鸡物种(猪、牛、羊、鸭、鹅、狗、兔、牦牛、马、驴、鼠、水牛、貂、骆驼、鹿、鱼)进行定性PCR扩增并用2％的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳分析，PCR扩增反应程序：95℃预变性5min；95℃30s，60℃45s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。同时进行定量PCR分析，反应程序：95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min，40个循环；60℃采集信号。结果表明，所有4种鸡物种均能扩增出113bp的片段，符合所设计引物对应的片段大小。而其它16种非鸡物种均无特异性扩增条带(图5)。用引物Actb-1F/1R和探针Actb-1P进行定量PCR对该20种物种进行检测，4种鸡物种能检测到信号而16种非鸡物种没有检测到信号(图6)。这表明该基因以及对应的引物可以用来特异性地检测鸡及鸡源性产品。

表3定性PCR反应体系

表4定量PCR反应体系

4、定量PCR灵敏度验证

为了评定荧光定量PCR的灵敏性，将家鸡的基因组DNA浓度10倍稀释7个梯度，100ng,10ng,1ng,0.1ng,10pg,1pg,0.1pg，进行荧光定量PCR，扩增曲线如图7，取5个点绘制标准曲线，得到的标准曲线如图8所示，当DNA模板浓度最低至10pg时，能检测到荧光信号。因此，该荧光定量体系的检测限是10pg DNA，也就是8个拷贝数。同时给出了关于Cq值与基因组浓度的对数之间线性方程。 线性方程为：y＝-3.196x+32.481，R²＝0.994。y代表Cq值，x代表基因组浓度的对数值，R²代表线性相关系数。根据R²值可知鸡基因组DNA的拷贝数和Ct值间具有良好的线性关系。由前面拷贝数鉴定可知Actb基因在普通家鸡、火鸡、乌鸡和野鸡中均为单拷贝，由此可推测，该基因和定量PCR体系也适合用于火鸡、乌鸡和野鸡的定量检测，其检测限为8个拷贝数。

5、鸡肉加工品检测

为验证本发明所确定的内标准基因以及建立的定量PCR检测技术在实际样品检测过程中的准确性，本研究对市售14种鸡肉加工品和6种混合肉制品进行检测，结果显示有4种食品及2种饲料存在收集不到荧光信号的现象，这与KOKA鸡肉沙爹口味方便面、合味道鸡肉味杯面、张君雅小妹妹炭烧鸡汁点心面、墨西哥辣鸡点心面配方中显示不含鸡源性成分以及鸡饲料中不含鸡源性成分实际情况相符，表明本研究建立的荧光定量PCR方法可以用于实际样品的检测。

表5鸡肉加工品和混合肉检测结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 用于检测鸡源成分的内标基因及其应用

<130> KHP161117577.3

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1380

<212> DNA

<213> 鸡Actb

<400> 1

aacaactggt cagatgcagt gtgatggtac acaacccaca cgcagccctg tggcgctccg 60

ctacctaatt cctttatcag gccttggcca aggcactcca gagtctgagc aggcttaagg 120

cacagcccta cacacagcac cctccccctc ccaccccaac tcacagccag cacttaatct 180

cattactcac atggctgagt ggctgccacc ctgcccagag cgaggccata aggctccacc 240

actaagacaa agcagtttcc atcttctgta gtagtttagc tcagcctcct ccacccactc 300

agcattaaga ggtgtgctaa gagcagccta gggctccagc ctaccttgat tttcattgtg 360

ctaggtgcca gggctgtgat ctccttctgc atcctgtcag caatgccagg gtacattgtg 420

gtaccaccag acagcactgt gttggcatac agatccttac ggatatccac atcacacttc 480

atgatggagt tgaaggtagt ttcatggata ccacaggact ccatacctgc aagcaaaaag 540

cagtgtcaag tcagtaaatg gttcagggac aaggaagaca gaggacctac tgctatggga 600

aaacaagaga atcaaacacc ccatagtggg aaacaacaca gacaaaggca tggctgacag 660

gctcagcctc ctgttctact gacctaggta cctcaatcat cctcaaactg aggaagaaaa 720

aagactgcag tggaatggga cagacctgct aagggccagc aatattgtgg ccagtctcta 780

agtcgctcta ggcagaaggg gcatggaatc tcctcaaagg agtcagactt acccaagaaa 840

gatggctgga agagggcctc ggggcacctg aacctctcat tgccaatggt gatgacctga 900

ccatcaggga gttcatagct cttctctagg gaagagctag aggcagctgt ggccatctcc 960

tgctcgaaat ccagtgcgac gtagcacagc ttctccttga tgtcacgcac aatttctctc 1020

tcggctgtgg tggtgaagct gtagcctctc tctgtcagga tcttcatgag gtagtccgtc 1080

aggtcacggc cagccagatc cagacggagg atggcatggg ggagggcgta gccttcatag 1140

atgggcacag tgtgggtaac accatcacca gagtccatca caataccagt ggtacgacca 1200

gaggcataca gggacagcac agcctggatg gctacataca tggctggggt gttgaaggtc 1260

tcaaacatga tctagaaaga taaaaaaagc actgagtcaa gcagaataaa ccaaggttct 1320

cactgcacac ctacatcggt ccatgcatgt ggtttacatt tgtccctaga taagaggctt 1380

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgacctaggt acctcaatca tc 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctagagtga cttagagact gg 22

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cagacctgct aagggccagc aata 24

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcaatttcca agcgtcattc tga 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttcttcctcg tccattcact aacc 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cagacctgct aagggccagc aata 24

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcaatttcca agcgtcattc tga 23

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttcttcctcg tccattcact aacc 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttgagagaca tgctgaaggc acct 24