用于同时检测多种突变类型的序列组合和探针的制作方法

本发明属于基因检测领域，更具体而言本发明涉及人基因突变的检测，特别是用于同时检测多种突变类型的技术。
背景技术：
：癌症是危害公众健康的一大难题。在中国，癌症是疾病死亡的第一杀手，并且其发病率和死亡率仍呈增长的趋势。仅在2015年，我国共有429.2万新发癌症病例和281.4万癌症死亡病例，其中以肺癌的发病率最高，并且肺癌的死亡率也排在各种癌症类型之首。另外，胃癌、食管癌和肝癌也是常见诊断的癌症类型，排在高发癌症类型的行列(Chen,W.,etal.,CancerstatisticsinChina,2015.CACancerJClin,2016.66(2):p.115-32)。癌症是基因病，肿瘤基因学研究揭示了近140个驱动基因，这些驱动基因分布于12条信号通路中，分别调节细胞命运、细胞生存和基因组稳定(Vogelstein,B.,etal.,Cancergenomelandscapes.Science,2013.339(6127):p.1546-58)。驱动基因的发现推动了靶向药物的开发。截至2016年6月，美国食品药品监督管理局(FDA，U.S.FoodandDrugAdministration)已经批准了72个靶向抗肿瘤药物。多项研究证实，肺癌的驱动基因主要包括EGFR、KRAS、EML4-ALK、BRAF、PI3KCA、AKT1、MEK1、MET、HER2、RET、NRAS、NTRK1等。EGFR是目前肺癌研究中研究最充分的分子靶点。PIONEER研究显示，肺腺癌患者EGFR基因突变率在亚裔和中国人中分别为51.4％和50.2％(Shi,Y.,etal.,Aprospective,molecularepidemiologystudyofEGFRmutationsinAsianpatientswithadvancednon-small-celllungcancerofadenocarcinomahistology(PIONEER).JThoracOncol,2014.9(2):p.154-62；Shi,Y.,etal.,MolecularEpidemiologyofEGFRMutationsinAsianPatientswithAdvancedNon-Small-CellLungCancerofAdenocarcinomaHistology-MainlandChinaSubsetAnalysisofthePIONEERstudy.PLoSOne,2015.10(11):p.e0143515)。而KRAS和EML4-ALK的驱动突变率约占肺腺癌患者的15-25％和3-7％(Lovly,C.,L.Horn,W.Pao.2016.MolecularProfilingofLungCancer.MyCancerGenome(UpdatedMarch28))。《美国国立癌症综合网络(NCCN，NationalComprehensiveCancerNetwork)临床实践指南》已经明确对于晚期非小细胞肺癌患者，应该先实施EGFR和ALK基因检测。研究表明，对于存在驱动基因突变且接受对应的靶向治疗的患者，相对于未根据基因检测结果进行治疗的患者，可获得更好的治疗效果和更长的生存期(KrisMG,JohnsonBE,BerryLD,etal.Usingmultiplexedassaysofoncogenicdriversinlungcancerstoselecttargeteddrugs.JAMA2014；311:1998-2006)。对于非小细胞肺癌，除了FDA批准的EGFR抑制剂和ALK抑制剂，NCCN指南还推荐威罗菲尼和达拉非尼，达拉非尼联合曲美替尼适用于BRAFV600E突变患者；克唑替尼适用于MET高水平扩增或14号外显子跳跃突变以及ROS1重排患者；卡博替尼适用于RET重排患者；曲妥珠单抗和阿法替尼适用于HER2突变患者。NCCN指南强烈支持更广泛的基因检测，以最大限度的确定现有药物获准临床试验期药物相关的驱动突变。靶向药物是精准治疗的先锋，其诠释了标准化治疗为基础的个体化治疗原则。而个体化治疗的前提条件是存在个体差异而进行分子靶点检测，但对于肿瘤分子靶点的检测却并非易事。一方面分子靶点涉及的类型复杂，包括点突变、短片断插入缺失、拷贝数变异、融合基因等。另一方面，晚期肿瘤患者的组织样本往往获取困难，而ctDNA(Cell-freeCirculatingTumorDNA)检测虽然无创，但是体液中除了ctDNA，也存在正常组织游离DNA，ctDNA通常占比非常少，属于超低频突变。目前对于靶点基因的检测，现有的ddPCR(微滴式数字PCR)等技术虽然可实现绝对定量，且灵敏度高，但是这类技术只能检测已知的突变位点，无法检测基因融合；RT-PCR(反转录PCR)技术虽然检测的突变类型较为全面，但是也只能检测已知的突变位点，并且存在灵敏度低、通量低等局限性。因此，本领域中需要一种高灵敏度、高特异性的可以同时检测多个肿瘤基因的多种突变类型的新技术。技术实现要素：本发明的目的在于提供肿瘤用药以及疗效预测的指导方案。经过反复试验，发明人实现了对与FDA批准靶向药物或NCCN指南推荐靶向药物或临床试验靶向药物正在开展的57个肿瘤驱动基因的敏感突变和耐药突变的同时检测。具体而言，本发明提供了用于高灵敏度、高特异性同时检测57个肿瘤驱动基因的点突变、短片段插入缺失、拷贝数变异和融合基因的序列组合；针对所述序列组合的探针；用于检测所述57个肿瘤驱动基因的点突变、短片段插入缺失、拷贝数变异和融合基因的方法、基因芯片和试剂盒。因此，在第一方面，本发明提供了一种用于同时检测多种突变类型的序列组合，所述序列组合包括：1)如下肿瘤驱动基因的所有CDS区域：FGFR1、NTRK1、ALK、FGFR2、APC、PIK3CA、AR、PMS2、ATM、PTCH1、PTEN、BRAF、BRCA1、BRCA2、KIT、RB1、CCND1、KRAS、RET、CDK4、MAP2K1、ROS1、CDK6、SMARCA4、CDKN2A、MET、SMO、MLH1、DDR2、MSH2、STK11、EGFR、MSH6、TP53、ERBB2、TSC1、NF1、TSC2、FBXW7、NRAS；2)以下区域：AKT1外显子3；ESR1外显子4-8；CTNNB1外显子3；FGFR3外显子7,9,14-18；FLT3外显子14,15,20；HRAS外显子2,3；MAP2K2外显子2-4,6,7；MTOR外显子19,30,39,40,43-45,47,48,53,56；IDH1外显子4；IDH2外显子4；JAK2外显子14；PDGFRA外显子12-18；PTPN11外显子3,13；RAF1外显子3,4,6,7,10,14,15,17；SRC外显子14；VHL外显子1-3；序列SEQIDNO.8。在优选的实施方案中，本发明第一方面的序列组合还包括其中6个肿瘤驱动基因(ALK、FGFR3、NTRK1、PDGFRA、RET和ROS1)的融合基因断点以及肿瘤驱动基因MET外显子14跳跃突变相关的区域，即3)SEQIDNO.9-SEQIDNO.20。在更优选的实施方案中，本发明第一方面的序列组合还包括EGFR基因19号外显子缺失突变的序列，即4)SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。在第二方面中，本发明提供了用于同时检测多种突变类型的探针，所述探针包括：针对本发明第一方面的序列组合1)-3)项中序列的探针；SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。优选地，所述探针覆盖所述序列组合1)-3)项中全部序列。在一个实施方案中，所述探针长度为100nt-140nt，优选110nt-130n，最优选120nt。在一个实施方案中，所述探针包括针对本发明第一方面的序列组合第1)-3)项中除序列区间SEQIDNO.21-SEQIDNO.27之外的序列的探针；序列SEQIDNO.28-SEQIDNO.40。优选地，所述探针覆盖所述序列组合1)-3)项中除序列区间SEQIDNO.21-SEQIDNO.27之外的全部序列。在优选的实施方案中，所述探针还包括：针对如下序列的探针：本发明的第一方面的序列组合中的1)-3)项中序列在染色体上前后小于150nt，优选小于120nt，更优选小于80nt的序列。在第三方面中，本发明提供了用于同时检测多种突变类型的基因芯片，所述基因芯片上有根据本发明第二方面的探针。在第四方面中，本发明提供了用于同时检测多种突变类型的试剂盒，所述试剂盒包括根据本发明第二方面的探针或者根据本发明第三方面的基因芯片。在一个实施方案中，所述试剂盒还包括文库构建试剂、探针杂交洗脱试剂、引物和接头以及核酸纯化试剂。在第五方面中，本发明提供一种用于同时检测多种突变类型的方法，所述方法包括以下步骤：1)探针设计，根据本发明第一方面涉及的序列组合成探针，例如提交IDT(IntegratedDeviceTechnology)或罗氏(Roche)合成探针；2)DNA提取，提取待检测样本中gDNA和/或cfDNA，例如石蜡包埋组织或石蜡切片、新鲜病理组织、血浆、胸水、腹水、脑脊液等体液样本的DNA；3)文库构建，将提取的DNA构建样本文库；4)杂交捕获，将所述样本文库采用步骤1)中合成的探针进行杂交捕获；5)上机测序，将步骤4)得到的捕获序列测序产生测序数据，例如在Illumina测序平台或BGI-seq500测序仪上机测序；6)信息分析，进行变异检测和注释，例如采用发明人自主开发的血浆ctDNA低频突变富集测序技术——ER-seq(Enrichment&RaralleleSequence)(中国专利公开号CN105063208A，公开日2015年11月18日)的信息分析流程(RealSeqPipeline)统计质控参数如目标区域覆盖大小、平均测序深度、正反链互配率、低频突变率等，并进行变异检测和注释。在优选的实施方案中，所述方法还包括以下步骤：7)结果解读，根据检测出来的变异判断其与靶向药物疗效和预后的关系，例如通过与公共数据库(如COSMIC)或建立的数据库比对和文献检索，根据数据库记载和文献报道，判断其与靶向药物疗效和预后的关系。本发明的序列组合、探针、基因芯片、试剂盒和方法可以用于同时检测57个肿瘤驱动基因的点突变、短片段插入缺失和拷贝数变异的序列组合。本发明的有益效果是：本发明可以特异性地一次性检测出多种肿瘤驱动基因的不同变异类型。本发明的探针可以对EGFR、KRAS、BRAF、EML4-ALK等57种驱动突变实现多重全方位检测。本发明可以实现一次性同时检测57种基因的多种变异类型，包括点突变、短片段插入缺失、拷贝数变异和基因融合。本发明可以检测探针覆盖区域的已知突变，并同时可以发现新的未知变异。本发明检测突变的灵敏度高，本发明可以实现0.5％以上变异的准确检出。本发明可以精确识别融合基因的断点。本发明适用于石蜡包埋组织或石蜡切片、新鲜病理组织、血浆、胸水、腹水、脑脊液等多种体液样本。本发明检测突变的通量高：能够在短时间内同时进行多例样本检测，从而压缩成本，有利于临床的推广。本发明对于融合基因的检测可以准确识别断点(精确到1bp)，并且可以发现与ALK、FGFR3、NTRK1、PDGFRA、RET和ROS1相关的新的融合基因。附图说明通过以下附图对本发明进行说明：图1为本发明的实施流程图；图2为实施例2的ALK基因c.3806G>C读段图，序列见SEQIDNO.3；图3为实施例2的TP53基因c.455C>T(p.P152L)读段图，序列见SEQIDNO.4；图4为实施例3的EGFR基因的c.2235_2249del15(p.E746_A750del)读段图的部分截图，序列见SEQIDNO:5；图5为实施例3的TP53基因的c.578A>C(p.H193P)读段图的部分截图，序列见SEQIDNO.6；图6为实施例4的MET基因的14号外显子跳跃突变c.3028_3028+17del18读段图的部分截图，序列见SEQIDNO.7。具体实施方式本发明利用发明人自主开发的血浆ctDNA低频突变富集测序技术——ER-seq(Enrichment&RaralleleSequence)(中国专利申请公开号CN105063208A，公开日2015年11月18日)，提供了一种高灵敏度、高特异性的可以同时检测多个基因的点突变、短片段插入缺失、拷贝数变异和融合基因的方法及试剂盒。在本发明中，采用本领域通用表示法表示基因突变和蛋白质突变。例如，c.3140A>G(p.H1047R)表示错义突变，表示编码区第3140位的A碱基改变为G碱基，从而导致1047位的氨基酸由组氨酸H突变为精氨酸R；c.464+1G>T表示剪切突变，表示编码区第464位所在外显子3端紧连内含子的第一个碱基由G改变为T；c.2240_2254del15(p.L747_T751del)表示小片段缺失，表示编码区第2240位到2254位的15bp碱基缺失，从而导致第747位到751位的5个氨基酸缺失；c.548C>A(p.S183*)表示无义突变，编码区第548位的C碱基改变为A碱基，从而导致第183位的丝氨酸S变为终止密码子；c.3028_3028+17del18表示涉及到剪切区域的小片段缺失，表示表示编码区第3028位到其所在外显子3端紧连内含子的第17个碱基(共18个碱基)缺失。本领域技术人员根据上述示例可以解读本发明中的其他突变的含义。不希望拘囿于理论，但发明人考虑，对基因序列进行捕获进行检测中使用的探针的效率受到多种因素的影响，例如探针之间的相似度、探针序列的复杂程度和GC含量差异、探针自身形成二级结构的倾向性、探针之间形成二级结构的可能性。因此，想要对多个基因的多个位点进行同时检测，存在很大挑战。需要检测的基因越多、位点越多越分散，需要设计的探针越多，有可能遇到的问题越多，检测的难度就越大。把多个基因的多个位点进行分开检测，人工费用、仪器费用、试剂费用基本上与试验份数成正比，如果不能做到高通量的批量检测，那么势必造成资源的巨大浪费，靶向药物是精准治疗的成本会居高不下，限制其在普通患者中的推广和应用。在本发明中，对57个肿瘤驱动基因(表1)、突变位点或相关区域的选择经过了发明人的反复论证，对这些区域进行探针设计可以很好地实现相关突变的高通量检测，有效地减少探针自身、探针之间的干扰。在本发明中，突变位点或相关区域的选择考虑了检测的全面性与检测的效率、灵敏度和特异性的平衡，既尽可能多地检测多种类型的突变，又保证了高灵敏度、高效率的精确检测。本发明的目的在于提供一种同时检测点突变、短片段插入缺失、拷贝数变异和融合基因的探针，该探针包括57个肿瘤驱动基因(表1)。#号标记的基因探针设计区域除表1中指定的区域以外，另增加其中6个肿瘤驱动基因(ALK、FGFR3、NTRK1、PDGFRA、RET和ROS1)的融合基因断点和MET基因外显子14跳跃突变相关的区域如下：chr1:156843751-156844362，chr2:29446394-29448326，chr4:1808661-1808842，chr4:55140698-55141007，chr6:117650609-117658334，chr6:117647577-117650491,chr6:117645578-117647386，chr6:117642557-117645494，chr6:117641193-117642421，chr7:116411702-116411902，chr7:116412043-116412283，chr10:43610184-43612031。另外，为了很好的捕获EGFR基因常见的19号外显子缺失突变，增加基于突变序列的探针：E1:TGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGG(SEQIDNO.1)；E2:ATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACACTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGGCTCTGAACCTCAGGCCCACC(SEQIDNO.2)。表1本发明的探针所覆盖的肿瘤驱动基因及其范围注：allCDSs：所有编码区；Exon和Exons：外显子。在本发明中，基因名称均采用NCBI-Gene(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)里的官方命名(OfficialSymbol)。染色体序列的参考序列为GRCh37/hg19(http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/chromosomes/)。本领域技术人员应理解，本发明并不限于具体公开的参考染色体序列，本领域技术人员简单地通过对应，可以将本发明涉及的染色体序列在其他类型的基因组数据版本上确定。因此，本发明适用于其他类型的基因组数据版本，例如以后发布的版本。在本发明中，提及基因序列(包括DNA序列、RNA序列)意味着包括提及的序列本身，以及如果在生物学的角度理解合理的情况下也包括提及序列的互补序列。这是因为基因序列在染色体上是双链形式存在的，提及一条链上的序列，另外一条链上的序列也必然存在，突变通常在两条序列上对应出现。基于表1中列出的序列，通过对比待测样品与基因组数据库中的标准序列，本领域技术人员可以确定待测样品是否含有点突变、短片段插入缺失、拷贝数变异。本发明检测的变异类型包括所有57个肿瘤驱动基因所覆盖区域的已知或未知的点突变、短片段插入缺失和拷贝数变异；6个肿瘤驱动基因(ALK、FGFR3、NTRK1、PDGFRA、RET和ROS1)所覆盖区域的融合变异。需要说明的是，本发明也可以检测MET基因的14号外显子跳跃突变。以下是本发明的染色体区域用于检测的突变情况：chr1:156843751-156844362(SEQIDNO.9，在NTRK1基因9号内含子发生的融合)，chr2:29446394-29448326(SEQIDNO.10，在ALK基因19号内含子发生的融合)，chr4:1808661-1808842(SEQIDNO.11，在FGFR3基因17号内含子发生的融合)，chr4:55140698-55141007(SEQIDNO.12，在PDGFRA基因11号内含子发生的融合)，chr6:117650609-117658334(SEQIDNO.13，在ROS1基因31号内含子发生的融合)，chr6:117647577-117650491(SEQIDNO.14，在ROS1基因32号内含子发生的融合),chr6:117645578-117647386(SEQIDNO.15，在ROS1基因33号内含子发生的融合)，chr6:117642557-117645494(SEQIDNO.16，在ROS1基因34号内含子发生的融合)，chr6:117641193-117642421(SEQIDNO.17，在ROS1基因35号内含子发生的融合)，chr7:116411702-116411902(SEQIDNO.18，MET基因14号外显子跳跃突变)，chr7:116412043-116412283(SEQIDNO.19，MET基因14号外显子跳跃突变)，chr10:43610184-43612031(SEQIDNO.20，在RET基因11号内含子发生的融合)。在本发明中，融合变异是指两个基因的编码区首尾相连置于同一套调控序列(包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等)控制之下，构成的嵌合基因。外显子跳跃，实际上就是涉及到剪切区域的突变，包括点突变、缺失等，突变后会引起剪切错误，导致外显子丢失。在另一实施方案中，本发明的用于检测肿瘤驱动基因突变的试剂盒包括用于检测EGFR、KRAS、BRAF和EML4-ALK突变的试剂，特别是包括DNA提取试剂、文库构建试剂、探针杂交洗脱试剂、引物和接头试剂、核酸纯化试剂。在一个示例性实施方案中，所述试剂盒包括的试剂的组成如下：表2根据本发明一个实施方案的试剂盒的组成注：上述序号1-22的试剂中，有些未对应具体的厂商来源，但本领域技术人员根据其中提供的试剂名称就可以自行获知很多厂商提供用于实现所述环节的试剂，本领域技术人员也可以根据有关手册配制实现所述环节的试剂。对于本发明中特别选择的序列组合，可以选择常规的方法对其设计探针。例如对于长度120nt的探针，(1)设定窗口在所述序列组合中的序列上滑动，得到覆盖所有序列组合的探针；(2)为了避免探针的GC含量过低(低GC探针会导致覆盖深度不佳)，在确保目标序列完全覆盖的情况下，部分探针在GC正常的区域允许重叠。本领域技术人员已知，在基因探针检测领域，随着基因探针数量增多，在同一个反应体系中进行检测会出现探针的相互影响或干扰。本发明中突变位点或相关区域的选择考虑了探针覆盖的全面性与检测的效率、灵敏度和特异性的平衡，既尽可能多地检测所需类型的突变，又保证了高灵敏度、高效率的精确检测。在本发明中，用于同时检测多种突变类型的探针符合探针设计规范。例如，探针自身不能形成二级结构、探针之间互补序列不宜过长。这样的探针设计规范是本领域技术人员可以确定的，探针设计软件或者探针设计提供商也可以提供本领域通常的探针设计规范。在本发明的一个实施方案中，用于同时检测57个肿瘤驱动基因的点突变、短片段插入缺失、拷贝数变异和融合基因的方法包括以下步骤：1)探针设计，根据NCCN指南、COSMIC、TCGA、ICGC数据库和相关文献确定基因集、突变位点或相关区域，确定探针的目标区域，设计并提交IDT或罗氏(Roche)合成探针；2)DNA提取，提取检测样本中gDNA和cfDNA，包括石蜡包埋组织或石蜡切片、新鲜病理组织、血浆、胸水、腹水、脑脊液等体液样本的DNA；3)文库构建，将步骤2)中提取的DNA按文库构建试剂盒说明书构建样本文库；4)杂交捕获，将所述样本文库采用步骤1)中合成的探针，参照探针制造商(例如IDT或罗氏)提供的说明书进行杂交捕获；5)上机测序，将步骤4)中捕获的样品进入Illumina测序平台或BGI-seq500测序仪上机测序，产生原始测序数据；6)信息分析，采用发明人自主开发的血浆ctDNA低频突变富集测序技术——ER-seq(Enrichment&RaralleleSequence)(中国专利公开号CN105063208A，公开日2015年11月18日)的信息分析流程(RealSeqPipeline)对所述原始测序数据统计质控参数如目标区域覆盖大小、平均测序深度、正反链互配率、低频突变率等，并进行变异检测和注释；7)结果解读，对于检测出来的变异，进行公共数据库(COSMIC)和已建立的数据库比对和文献检索，根据数据库记载和文献报道，判断其与靶向药物疗效和预后的关系。本发明的方法可通过检测血液、胸水、腹水等体液以及肿瘤冰冻组织或石蜡切片获得全面的肿瘤驱动基因突变信息，提高了肿瘤基因检测的灵敏度和准确率，从而实现辅助临床医生制定个体化用药方案，使精准治疗达到最好效果。实施例下面通过具体的实施例，对本发明进行说明，需要说明的是这些实施例仅仅是为了说明目的，而不能以任何方式解释成对本发明的限制。除非另有定义或说明，本专利所述的科学技术术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。本发明实施例中肿瘤基因的探针设计策略如下：探针设计的方法概括为根据NCCN指南、COSMIC、TCGA、ICGC数据库和相关文献确定基因集、突变位点或相关区域，确定探针的目标区域，设计并提交IDT(IntegratedDeviceTechnology)合成探针。(1)对于非复杂区域发生的变异，直接按照探针提供商的常规的设计方法即可。(2)融合基因检测的探针设计：融合基因的断点通常发生于内含子(intron)区域，本发明对于融合基因的检测是基于DNA水平，并且可以精确到具体的断点，因此探针需要覆盖相关的内含子。根据NCCN指南确定本发明需要检测的融合基因为ALK、FGFR3、NTRK1、PDGFRA、RET和ROS1，然后根据COSMIC、TCGA数据库和文献记录的融合变异类型和断点位置确定本发明探针需要覆盖的区域。将预定的区域和全基因组参考序列进行比对，对于存在断点的重复区域，再增加覆盖配对基因的探针序列；(3)短片段插入缺失的探针设计：大于15bp碱基的缺失可能会在探针捕获时存在缺口，因此针对热点该类型变异(EGFR19号外显子缺失)，再增加基于突变后的序列设计探针。经过发明人反复测试，对于本发明的用于同时检测多种突变类型的序列组合1)-3)项中序列除序列区间SEQIDNO.21-SEQIDNO.27之外，以105-135nt的窗口长度平铺获得的探针均可有效用于本发明的检测中，序列区间SEQIDNO.21-SEQIDNO.27的探针可以是下表中的SEQIDNO.28-SEQIDNO.40。在本发明实施例中，在序列组合1)-3)项中序列除以下表中的序列区间SEQIDNO.21-SEQIDNO.27之外，使用的是以120nt的窗口长度平铺获得的探针；序列区间SEQIDNO.21-SEQIDNO.27的探针是下表中的SEQIDNO.28-SEQIDNO.40；短片段插入缺失的探针是SEQIDNO.9-SEQIDNO.20。实施例1：本实施例以涵盖点突变、短片断插入缺失、拷贝数变异和融合基因变异类型的3个Horizon标准品(HD-C755、HD200和HD664)、1个细胞系RT112和8个已知变异的临床样本为例来阐述本发明。本实施例的实施流程如图1。1.DNA提取：本发明的样品适用范围包括手术切除的新鲜病理组织、甲醛固定石蜡包埋病例组织、石蜡切片、全血、血浆、胸腔积液标本等。本实施例采用血细胞的gDNA的测序结果作为对照用于排除胚系突变。对于全血需要首先进行血浆/血细胞分离：采集10mL外周血，及时进行血浆/血细胞分离(EDTA抗凝管，4h内；Streck管72h内)。分离步骤如下：第1步：在4℃条件下1600g离心10min，离心后将上层血浆分装到多个1.5mL或者2.0mL的离心管中，在吸取血浆过程中注意不要吸到中间层的白细胞。注意：在分离血浆后，中间层+底层血细胞留取备用，作为正常对照。第2步：在4℃条件下以16000g离心10min去除残余细胞，将上清转入新的1.5mL或者2.0mL离心管中(注意不要吸到管底的白细胞)，即得到所需的血浆。DNA提取：血浆、胸腔积液等体液按照QIAampCirculatingNucleicAcidKit(Qiagen)提取试剂说明书，进行血浆cfDNA的提取。血细胞和组织等样本按照QIAampDNAMiniKit提取试剂说明书，进行gDNA的提取。然后采用Qubit定量，要求血浆cfDNA大于30ng；血细胞gDNA大于300ng；组织DNA大于100ng。2.文库构建：体液中提取的cfDNA按照NEBNextUltraII文库构建试剂盒说明书构建样本文库，引物和接头来自于Invitrogen。对于组织或者用于对照的血细胞提取的基因组DNA，应先打断成200-250bp的片段，然后按照文库构建试剂盒构建样本文库。2.1末端修复及加“A”：按照下表配置末端修复以及加“A”反应：组分单反应体积(μl)EndPrepReactionBuffer7EndPrepEnzymeMix3cfDNA或片段化的DNA50μl总体积60μl将以上混合物充分振荡混匀并离心，然后按照以下步骤在恒温混匀仪上孵育：首先20℃，孵育30min；然后65℃，孵育30min。孵育完成后，降至室温，高速离心机短暂离心。2.2接头连接：按照下表配置接头连接反应Premix：组分单反应体积(μl)LigationMasterMix30LigationEnhancer1总体积31接头加入量随DNA起始量变化而变化，对应关系见下表：依次向反应管中加入31μl接头连接反应Premix及对应体积的接头，并用ddH2O补充体积至95μl，充分振荡混匀后离心。恒温混匀仪20℃孵育15min。孵育完成后，微量高速离心机短暂离心。连接反应结束后，使用磁珠对接头连接产物进行纯化，最后回溶至25μLTE(pH8.0)中。2.3捕获前PCR(Non-C-PCR)引入标签(index)按照下表顺序在PCR管中加入反应组分，振荡混匀并离心，并设置阴/阳性对照：2.3.1PCR上机样本循环数对应关系见下表：2.3.2PCR上机程序见下表：对Non-C-PCR产物进行纯化，最终溶解在31μlTE(pH8.0)中。纯化产物进行Qubit-BR定量和2100质控。3.靶序列富集与上机测序3.1扩增后文库质控合格后并采用本发明实施例设计的探针，参照芯片制造商(IDT)提供的说明书进行杂交捕获。最后洗脱回溶21μLddH2O带杂交洗脱磁珠。3.2杂交捕获产物的扩增。3.3先除去上一步磁珠，然后进行磁珠纯化，最后回溶25μLddH2O，进行QC及上机。3.4采用Illumina测序平台或BGI-seq500测序仪进行上机测序，测序实验操作按照制造商提供的操作说明书进行上机测序操作。4.信息分析正反双链纠错低频信息分析(RealSeqPipeline)具体方法为：4.1基于插入片段两端的序列碱基作为标签，所述插入片段是文库中与接头引物相连接的DNA片段，经双末端测序，每个片段形成一对成对测序序列；将成对测序序列的测序序列1的前12bp碱基和测序序列2的前12bp碱基作为标签，字母序排列以较小的标签在前连接成24bp的一条索引，并且以这24bp作为成对测序序列的索引，测序序列1的标签在前就标记成正链；测序序列2的标签在前就标记为反链；4.2对索引进行外部排序，以达到将同一个DNA模板的所有测序重复测序序列聚集到一起的目的；4.3对聚集起来的拥有相同索引的测序序列进行中心聚类，根据其序列之间的汉明距离(Hammingdistance)，将每个有相同索引的大簇聚集成若干个小簇，每个小簇中任意两对成对测序序列的汉明距离不超过10，以达到区分开拥有相同索引却来自不同DNA模板的测序序列的目的；4.4对步骤4.3中获得的同一个DNA模板的重复簇进行筛选，若正链和反链的测序序列数都达到2对以上，则进行后续分析；4.5对满足4.4中条件的簇进行纠错，并产生一对无错的新测序序列。对于DNA模板的每一个测序碱基，若某种碱基型在正链的测序序列中的一致率达到80％，且在反链测序序列中的一致率也达到80％，则记新测序序列的这个碱基为此碱基型，否则记为N，这样便得到了代表原始DNA模板序列的新测序序列；4.6将新测序序列用bwamem算法重新比对到基因组上，筛除比对质量小于30的测序序列；4.7根据4.6中得到的测序序列进行统计，得到捕获区域内每个位点的碱基型分布，统计目标区域覆盖大小、平均测序深度、正反链互配率、低频突变率；4.8CallSNV/InDel/SV/CNV：根据患者样品与对照样品信息的比对，用mutect流程callsomaticSNV变异；用gatk流程callsomaticInDel变异；用contra.py流程callCNV；用somVar流程callSV；所使用的筛选参数为：对照位点变异率≤2％；纠错后变异测序序列条数≥2；突变预测p值≤0.05；4.9变异注释：注释变异的功能、变异测序序列支持数、变异频率、氨基酸变异及已有变异数据库中的该变异的情况。5.检测结果：5.1探针性能：以下将结合覆盖度和目标区域序列占比说明本发明的探针的性能。A.覆盖度：在样本的平均测序深度为～1000X(去除重复读段(reads))的情况下；目标区域覆盖深度大于500X的比例大于90％，表明覆盖情况很好。B.目标区域序列占比：本发明目标区域序列占比均值是53％，说明本发明捕获效率较高(表3)。表3本发明的探针的测试样本覆盖度和目标区域占比分布5.2变异检测结果本发明的方法检测结果与已知的变异类型和频率结果完全一致。对于点突变，本发明的方法可以准确识别0.5％以上的突变(表4)。表4实施例1变异检测结果5.3融合基因灵敏度分析：将含有融合基因变异FGFR3-TACC3的细胞系DNA按照2％、1％、0.5％进行稀释，并设置一个平行重复，然后进行检测。结果表明本发明的灵敏度高，0.5％的融合基因变异即可检出，检测频率与理论频率相比，具有高度的一致性和重复性(表5)。表5融合基因灵敏度分析检测结果实施例2：取待检测的临床肺癌血液样本1例。受检者既往接受克唑替尼治疗，治疗10个月后，效果不明显，疾病继续发展。按照实施例1所述检测之试剂盒和方法对血液样本进行血浆/血细胞分析，DNA提取，提取步骤按照试剂盒说明书操作步骤进行操作。参考实施例1进行文库构建，杂交捕获，上机测序及信息分析。结果表明所检测的基因中，存在以下基因变异，其他基因为野生型。EML4-ALK融合基因的断点分别为chr2:42503274和chr2:29447354；前者位于EML4基因6号内含子(NM_019063)，后者位于ALK基因19号内含子(NM_004304)。图2为ALK基因c.3806G>C读段图；图3为TP53基因c.455C>T(p.P152L)读段图。在图2中，参考序列的C碱基突变成了G碱基(由于ALK基因的编码链为负链，因此编码序列的改变为G突变为C)。在图3中，参考序列的G碱基突变成了A碱基(由于TP53基因的编码链为负链，因此编码序列的改变为C突变为T)。检测结果解读：尽管受检者依然存在ALK基因融合，但是ALK基因激酶区的G1269A突变会导致克唑替尼发生耐药。目前FDA批准的ALK抑制色瑞替尼和艾乐替尼均能解决G1269A突变导致的耐药问题。TP53基因的c.455C>T(p.P152L)与肿瘤的发生发展和预后相关，目前尚无相关的靶向药物。基于上述基因突变的检测结果，该肺癌患者选择第二代ALK抑制剂色瑞替尼或艾乐替尼为宜。实施例3：取待检测的临床肺癌石蜡切片组织样本1例。按照实施例1所述检测之试剂盒和方法进行DNA提取，提取步骤按照试剂盒说明书操作步骤进行操作。参考实施例1进行文库构建，杂交捕获，上机测序及信息分析。结果表明所检测的基因中，存在以下基因变异，其他基因为野生型。图4为的EGFR基因的c.2235_2249del15(p.E746_A750del)读段图的部分截图；图5为TP53基因的c.578A>C(p.H193P)读段图的部分截图。在图4中，参考序列的15个碱基GGAATTAAGAGAAGC存在缺失。在图5中参考序列的T碱基突变成了G碱基(由于TP53基因的编码链为负链，因此编码序列的改变为A突变为C)。检测结果解读：受检者存在EGFR基因的c.2235_2249del15(p.E746_A750del)突变，宜采用EGFR抑制剂，如易瑞沙或特罗凯进行治疗为宜。TP53基因的c.455C>T(p.P152L)与肿瘤的发生发展和预后相关，目前尚无相关的靶向药物。实施例4：取待检测的临床肺癌胸水1例，同步采集外周血，以血细胞提取的基因组DNA作为对照。受检者为肺腺癌IV期患者，发生骨转移。按照实施例1所述检测之试剂盒和方法对胸水样本进行DNA提取，提取步骤按照试剂盒说明书操作步骤进行操作。参考实施例1进行文库构建，杂交捕获，上机测序及信息分析。结果表明所检测的基因中，存在以下基因变异，其他基因为野生型。图6为MET基因的14号外显子跳跃突变c.3028_3028+17del18读段图的部分截图。在图6中，参考序列的18个碱基GGTATATTTCAGTTTATT存在缺失。检测结果解读：受检者同时存在MET基因扩增和14号外显子跳跃突变。因此该肺癌患者宜选择MET抑制剂，如克唑替尼和卡博替尼，进行治疗为宜。序列表<110>北京吉因加科技有限公司苏州吉因加生物医学工程有限公司<120>用于同时检测多种突变类型的序列组合和探针<130>CP20160435<160>40<170>PatentInversion3.3<210>1<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>1tgtcatagggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaattcccgtcgctatcaagg60cgaaagccaacaaggaaatcctcgatgtgagtttctgctttgctgtgtgggggtccatgg120<210>2<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>2atcccagaaggtgagaaagttaaaattcccgtcgctatcaaggaattaagagaagcaaca60ctcgatgtgagtttctgctttgctgtgtgggggtccatggctctgaacctcaggcccacc120<210>3<211>79<212>DNA<213>Homosapiens<400>3ctgtagatgtctcgggccatcccgaagtctccaatcttggccactcttccagggcctgga60caggtcaagaggcagtttc79<210>4<211>79<212>DNA<213>homosapiens<400>4gatggccatggcgcggacgcgggtgccgggcgggggtgtggaatcaacccacagctgcac60agggcaggtcttggccagt79<210>5<211>80<212>DNA<213>homosapiens<400>5gtgagaaagttaaaattcccgtcgctatcaaggaattaagagaagcaacatctccgaaag60ccaacaaggaaatcctcgat80<210>6<211>81<212>DNA<213>homosapiens<400>6cacacgcaaatttccttccactcggataagatggctgaggaggggccagacctaagagca60atcagtgaggaatcagaggcc81<210>7<211>80<212>DNA<213>homosapiens<400>7atctgtagactaccgagctacttttccagaaggtatatttcagtttattgttctgagaaa60tacctatacatatacctcag80<210>8<211>5177<212>DNA<213>homosapiens<400>8ggccttcaaccactatctcagtgcaatgggtaagcaatgcctgggtaagaggcagttgac60gtgtggatggttgaatctgcttgaaggctgtgtgtggcatttaaaatccccttttaaaac120cccgtaactgatttattccatctttagatgggaatggaggatgtgtcaaactatcaaacc180aacttttttttttttttttgagatgagtcttgctctgtcgcccaggctggagtgcagtgg240tgcaatctcagctcaccgcaagctccacctcccgggttcaagcaattctcctacctcagc300ctccagagtagctgggactacaggcgcgtgccaccacgcccagctaattttttctatttt360tggtagagatggggtttcaccgtgttagccaggatggtctcaatctcctgaccttgtaat420ctgcctgtctcagcctcccaaagtgctgggattacaggcgtgagccaccgcgcatggccc480acatcaacatttttacaaagttactaacttttgtggcagtgatgagttgaggtccaaaca540ttagctttcaggtctgtcttcattaagctaaagtgtgttttaaccaccaggctttacata600gtaatgacattttgcttgaaagggaactgatcatttacagaaaatagcttaataatcaaa660agtgtaaagaaagatgacaatcatttttgaaaataacacttttaaaaaaatgaactagtt720catgaaagcagtaccaacatagaaccatgaaaatggtttgttttctgcctaaattcctct780ttgtgcttattgctcagagggtttggacatagtactaatcagattaggttgtaggttttt840atttcagggattaaaggcagtagtagggtttgaaccaagagtggctaacataaataccac900agaggcccacagcaaaatcatggaaggaactgacctggtggagactggtaaattggagag960tatttgccccttctatgtttgggccacacctaattgtggctgtgagggcatgtggtctca1020gggtgggttttcctatattgcaagataacctaggaatgcaaaattgatgccagataccct1080gtttcaacattgacagctgattcagattttgaaaacattgtacaagctgaaaagaaacat1140ctgcagacttgatttggcccttgaacctacagcatgtgactttgggtacatactttgggt1200aaccttggtgaggggctgagtctgtgttgatcgacttgctgttccccaccaatggaaaag1260gttcatgtcttgatcagtagtcaatcacattgaccatttgtccagattagcttgccatac1320atgaacaagatagaagtaagttggtagagttatcaattaggaaacccagtacagagtcta1380ttataatttagattgtacctcatgatgaaggctaactcaacaaacccatcagaacagaca1440ctggaacaaaatgacatttctaaataccatccagctctgtcttcataggcttcagtgagg1500taaatcaggcaggcctttgcccatgttatagaattggaaagaacctcagagtggtggtca1560cttgtcagaggttgggcacacctgtgaggtggtggggagaaatgacagacatcccagcag1620ctacacatgctggctgcacgtctcttgccaaatgccaggaggtaattttttagggtccct1680ccttagggaaaggggctggaagttttattattgctgttactactgctcgtgaactcattt1740cagccttagaagttcttggcttgtagtttttgttgtactcatgaaaatgctcccccatat1800atatgatcattctcgcttactataacatccttgcttactaaatgagttaacagggcttta1860tggtgtgtatcgtgaaacacacgtgcattaaagaccctctggaaggtattagcttttcac1920actttcacaacaaaagcttcacacttgtggttattaagctattttctctaaccagttccc1980tttcaagcaaaatgcatacattggtctctgtaggtgatgggttaatgcatggaaatagtt2040tctccttccctggaactgggaatagtgggtgagatagtgtattttttaatgtaaagacag2100gcacaaatgctttttttgttgataaatactattttacaagctaattataagttaagcact2160gttacttgagatgaaatatacagggcttcaaagatcataatctaaataattatgcacagc2220taatggttatacctgtgaagtaaagtagtggatcctgaggtgtaattttatagtattagc2280tgcatttcagtagatggtgtgatgaagagtttaatgcataggattaaatgagaagttacg2340aggagtttgtttaaagttaatgtaccgaggtaagttttcagtgttaagtttttgggagat2400ttgttttgggagaggatgagttggggttgggggaggaaaggacttagccagatgtgagtt2460tcttaaattgaagcataaaatttacaatttatgtagtccataattttctctggacattct2520acagtcttagttcatgcctgaagaccactgaaataatgctgagttgataagtggttctct2580tgactttgtttagtattctttactcaaccctatccatgaagttcttcaatgaagcttttg2640ataatttattgcaaaatacattttccacaaagaagtcattatgattggtttgaactagtg2700gaacacaaatgtgaggttataaagaggttcgccttagccaggggctcctttagctgcaaa2760gcagttttttgctcagcaacttggggtagagatcagtgtgtcttgaagttttgttttgca2820aaactttgttctaatgagaaagtcaagtcttaggaggaatgtatagtagttgagtgtttg2880tattaacactgttttcatattttccttttatgtctctgatttttctgaagacaagttcaa2940ggaatatatttctctgtggggcaacagatacagttttttcacttttcctcaattttagtc3000tccttacactctgggaggattaacttgacaaatgataccttagtgaataactgattattt3060ttatcaaaatcactcacatgtgttggtttactgagtgcctttttggatgagtgttttatg3120ccatatgtgtttttaatggaaattaaagtgtagtcagtacactaaagtgtagtcagtaca3180attggaaataagagttgagaaaagtcaggatatggaggaatgctccctagtgtcatgtta3240gtaaatgtcttaaattttatacttgttccctggcacattggaattcacagatgggagtta3300atggctttctttttttttttttttttttcctcagcgtcttgtgggtacttctcttatagc3360tggtacttgtctgacccctcctttagtttgtgagctccctgggcggggaataatggcctg3420cagatgctagcgagtgcctgacaaagaggagaagcccaggagatgttgagagtcagtcca3480gctctgcctgttagcctttcagacaaataaagttgaagaaggcaggtagcaagaaaaaga3540tcctgacctctgctctgccaaagtgtttttaattacctggatctagctgtaaggtttgcc3600acgtagtggtgacagctgaggtctagctcagcactactcagcagggaagccacacatgca3660ttaagcacttgacataggactagtctgaactgagttgtgctgtcattattgatacacact3720ggattttgaggagacaaaaaagaatgcaaaatagtttaatt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