一种东方伊萨酵母菌株ZT-C2结合MABR工艺及其应用的制作方法

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种具有除硫脱氮能力的东方伊萨酵母菌菌株zt-c2结合mabr(膜曝气生物膜反应器)工艺及其在污水中除氮解磷的应用。

背景技术：

随着经济的不断发展，城市化进程的不断推进，人们生活水平不断提高，污水处理厂、污水提升站、垃圾中转站、垃圾填埋场等市政处理设施距离人们的生活区越来越近，这些设施在运行过程中产生的黑臭污水已成为影响人们正常生活的一个重要因素。黑臭污水中主要是由于氨氮、总磷、总氮含量过高产生富营养化，使得水体内有机质含量增加。有机质主要包括含硫化合物、含氮化合物、卤素及其衍生物、烃类、含氧的有机、有机酸等。

因为污水中富营养化严重，氨氮含量高且产生难闻的气味，对居民生活产生影响，对地下水资源产生污染，进一步危害人的身体健康，为了人们能够有好的生活环境使得城市环境更加绿化。需对污水进行彻底的去除。

近几年，环境治理的方法中一是为传统人工增氧的物理方法，它可以增加水体中氧气的含氧量，提高河道的局部溶氧量，从而消除黑臭，但是此方法耗能大，大曝气带来气味，对周围人们带来不便。第二种是化学生物制剂法的化学方法，它可以利用一些化学试剂短时间内使水质达到标准水平，但是此方法带来的二次污染严重。第三种方法是水生态构建法，此方法适合封闭的轻度微污染的河流，对生态的完整性要求比较高。此外，还有mabr复合工艺，采用物理方法中的微曝气与生物方法中的生物功能菌加生物膜的技术，快速恢复溶解氧、消除黑臭。

mabr技术是以膜曝气生物反应器(核心为中空纤维疏水膜)为载体，将不同生物功能的微生物进行挂膜处理，提高膜生物反应器的处理能力和针对性，mabr是一种能够以较高的速度输送氧气和提高生物膜活性的技术。微生物膜附着生长在透氧中空纤维膜表面，污水在透氧膜周围流动时，水体中的污染物由于浓度梯度差的因素和微生物吸附的作用下进入生物膜内，经过微生物的代谢和增殖从而被微生物利用，使水体中的污染物同化为微生物菌体固定在生物膜上的产物和营养成分，以便微生物生长繁殖，这个过程便是水净化的过程。mabr技术是加入人的目的性的生态水处理技术，能使黑臭水体形成一个循环的具备自我修复功能的自净化水生态系统。该工艺净化过程特别适应于河道、湖泊、黑臭水体等流域治理，具有常规水处理技术无法比及的技术优势、工程优势、成本优势和运行管理优势。

技术实现要素：

本发明提供了一种东方伊萨酵母菌株zt-c2结合mabr技术的工艺及其应用，如在环境污水处理中的应用，特别是在富含氮或/和富含磷的黑臭水体中的应用。

本发明所述的东方伊萨酵母菌株zt-c2，于2018年6月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为cgmccno.16008，分类命名为：东方伊萨酵母(issatchenkiaorientalis)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

本发明所述的东方伊萨酵母菌株zt-c2结合膜曝气生物膜反应器(mabr)的工艺，是将发酵好的东方伊萨酵母菌株zt-c2挂膜到膜曝气生物膜反应器的生物膜上。

本发明所提述的工艺对污水具有净化作用。

本发明所提供的工艺，所述工艺中含有本发明所述的东方伊萨酵母菌株zt-c2。

本发明所述的工艺，其中生物膜中活菌总浓度优选为1×10⁶～1×10¹⁰cfu/ml，优选为1×10⁷～1×10⁹cfu/ml，更优选为1×10⁸cfu/ml。

本发明还提供所述工艺在环境污水处理中的应用，特别是在富含氨的黑臭污水中的应用。

还提供了东方伊萨酵母菌株zt-c2在膜曝气生物膜反应器中的应用。

进一步的，所述的应用是将发酵好的东方伊萨酵母菌株zt-c2挂膜到膜曝气生物膜反应器的生物膜上。

本发明所述的酵母菌株zt-c2既具有细菌的特点，如以单细胞形式存在，生长繁殖快，能形成较好的絮体，可适用于多种不同的生物反应器，因此，本发明所述的膜曝气生物膜反应器(mabr)可以为现有技术中常用的mabr的结构，并无特别要求，具体的条件也可以根据mabr的常规操作方法条件进行，例如微曝气等。

本发明中将发酵好的东方伊萨酵母菌株zt-c2挂膜到膜曝气生物膜反应器的生物膜上的方法可以按照本领域的常规方法，在本发明的一种实施例中，是将东方伊萨酵母菌株zt-c2振荡培养45～50小时后作发酵液，将发酵液挂膜到膜曝气生物膜反应器的生物膜上，挂膜时间为65～75小时。

同时本发明所述酵母菌株zt-c2又具有丝状真菌的特点，细胞较大，代谢旺盛：一方面，酵母菌株zt-c2以中空纤维膜为载体，使酵母菌株zt-c2吸附在中空纤维膜上，从而形成生物膜，形成生物膜的好处在于菌株不易流动，河道应用时损失较小；另一方面，mabr技术中属于微曝气，黑臭水体形成的很大原因在于水体缺氧，水中溶解氧的含量低，微曝气可以增加水体的溶解氧含量，也可以为吸附在中空纤维膜上的菌株提供充足的氧气，使酵母菌株zt-c2更好的新陈代谢，更大可能发挥其作用。

本发明通过酵母菌zt-c2结合mabr技术，能够在短时间内去除污水中超标的氨氮、降低总磷，使氨氮含量降到最低标准，总磷含量有所降低，较单独使用菌剂情况具有明显的效果。其对于现有技术的有益效果：

1、本研究从不同样本中分离、筛选到高效去除硫化氢和氨气的优势东方伊萨酵母菌种zt-c2，经过12h后就能在pda培养基上生长到最大浓度，能在25-40℃，ph5-9的条件下正常生长，说明本发明提供的东方伊萨酵母菌活力高，适应性强，可广泛用于各种污水生物处理过程中。

2、通过筛选获得的污水净化菌株，经过驯化成高效稳定的菌株，结合mabr技术。经过试验，该整体工艺从该菌株接种到污水中起，15天后对水体中的氨氮去除率为99％，进一步说明该菌种结合mabr技术后能使氨氮去除率提高到99％，比直接投加zt-c2用时少，效率高，脱氮效率高。

附图说明

图1本发明提供的除硫脱氮菌株zt-c2的菌落形态；

图2直接投加菌株zt-c2对废水总磷的去除率；

图3菌株zt-c2结合mabr技术后对废水氨氮的去除率；

图4菌株zt-c2结合mabr技术后对废水总磷的去除率；

图5工艺的膜组件与挂膜装置；

图6工艺挂膜前后菌株zt-c2的数量变化。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段，或按照制造厂商的建议条件。

本研究采用菌株氨氮、总磷的去除率作为评价标准。

实施例1除硫脱氮菌株zt-c2的筛选与鉴定

pda培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)：葡萄糖20.0g，土豆200.0g(煮熟过滤，要滤液)，琼脂粉15.0g，加蒸馏水至1000ml，自然ph，115℃下灭菌30min。

含氨富集培养基：蔗糖5.0g，蛋白胨2.0g，磷酸二氢钾(kh2po4)2.0g，硫酸镁(mgso4·7h2o)0.5g，氯化钠(nacl)2.0g，硫酸锌(znso4)0.05g，硫酸亚铁(feso4)0.04g，氨水5.0ml(过滤除菌，灭菌后加入)，涂布、纯化时加入琼脂粉15.0g，加蒸馏水至1000ml，ph＝7.0，121℃下灭菌20min。

含硫富集培养基：氯化铵(nh4cl)2.0g，氯化镁(mgcl2)0.5g，磷酸氢二钾(k2hpo4·3h2o)3.0g，硫化钠(na2s·9h2o)10.0g(过滤除菌，灭菌后加入)，氯化钙(cacl2·6h2o)0.2g，琼脂粉15.0g，加蒸馏水至1000ml，ph＝6.1±0.1，121℃下灭菌20min。

含硫纯化培养基：氯化铵(nh4cl)2.0g，氯化镁(mgcl2)0.5g，磷酸氢二钾(k2hpo4·3h2o)3.0g，硫代硫酸钠(na2s2o3·5h2o)10.0g，氯化钙(cacl2·6h2o)0.2g，琼脂粉15.0g，加蒸馏水至1000ml，ph＝6.1±0.1，121℃下灭菌20min。

柠檬酸盐培养基：磷酸氢二钾(k2hpo4·3h2o)1.0g，氯化钠(nacl)5.0g，磷酸二氢铵((nh4)h2po4)1.0g，柠檬酸钠2.0g，硫酸镁(mgso4·7h2o)0.2g，加蒸馏水至1000ml，加热搅拌溶解上述各溶质，ph＝7.0，121℃，20min。

1、脱氨功能菌的初筛

量取10ml蒸馏水于250ml三角瓶中，加入10-20颗玻璃珠，121℃灭菌20min，冷却至室温。量取10ml的自酿白葡萄酒加入无菌水中，于30℃、180r/min的恒温振荡器中打碎混匀1-2h，使菌游离，取5ml酒水混合物转移至100mlpda培养基中，在pda培养基中加入1％经过滤除菌的氨水，于30℃、180r/min的恒温振荡器中培养，观察到培养基中均匀混浊时，按5％的接种量再次转接至加入了氨水的pda培养基中，转接三次后通过稀释涂板法分离除硫脱氮菌，摇匀培养基后分三次取1ml液体于无菌ep管中，分别使用涡旋振荡器和无菌水稀释，取100μl菌也加入含有900μl无菌水的ep管中，即稀释10倍，依次稀释至10-6梯度后，取10-4、10-5、10-6三个梯度各100μl的含菌水涂布于含有0.5％氨水的pda培养基上，将平板置于30℃恒温培养箱中培养。待固体培养基上有菌落长出后，挑取不同形态的单菌落分别在相应固体培养基上三区划线进行纯化，至少转接3次后得到初步纯化的菌株。

2、脱硫功能菌的分离与初筛

与脱氨功能菌的初筛相似，采用富集法。量取25ml蒸馏水于250ml三角瓶中，加入10颗玻璃珠，121℃高压灭菌20min，冷却至室温后，加入10ml自酿白葡萄酒，将三角瓶置于28℃、180r/min的恒温摇床震荡培养，打碎混匀1-2h，使酒中的菌游离出来，再用移液枪取5ml震荡后的培养液转移至100ml含1％硫化氢(过滤除菌)的pda培养基中，再次将三角瓶置于28℃、180r/min的恒温振摇床中震荡培养，培养基出现混浊时，再用移液枪在超净工作台中取5ml，转接到相同的含硫富集的pda培养基中，转接三次后通过稀释涂板法在琼脂平板上分离功能菌，取100μl培养液加入到900μl的无菌水中，相当于稀释10倍，以此类推，分别稀释到10^-4、10^-5、10^-6，取这三个梯度浓度的稀释液100μl均匀涂布于含硫纯化培养基的琼脂平板上，将平板置于28℃恒温培养箱中培养。待菌落长出，挑取形态大小外观不同的单个菌落，再次于含硫纯化的pda培养基的琼脂平板上三区划线，待菌落长出后再将三区划线的单菌落再次在含硫纯化培养基的琼脂平板上三区划线，如此反复三次，得到的则为纯化的菌株。

3、脱氨菌株的复筛是用纳氏试剂比色法来筛选脱氨能力强的菌株

待测菌株为含氨富集培养基富集分离出的纯化菌株，从固体琼脂平板上挑各菌株的单菌落转接于pda培养基中，置于恒温摇床中过夜培养，培养条件为28℃、180r/min，以获得到新鲜种子液，再用移液枪取种子液按5％的接种量转接于pda培养基，置于恒温摇床中180r/min、28℃培养24h，间隔一定时间取菌液，于离心机12000r/min离心2min，取上清液用纳氏试剂比色法显色后，在波长420nm下使用分光光度计测定溶液中氨氮的含量，同时以不加菌的培养基(ck)作为对照至于同样条件下，测定ck中氨氮含量，将样品与ck对比计算即可得到培养基中氨氮的脱除率。

测定样品时，分别取适量菌液离心后的上清液于比色管中，加无氨水补足至标线，先加入0.2ml酒石酸钾纳溶液，并在振荡器上混匀。再加入0.3ml纳氏试剂溶液，再次在震荡器上充分混匀。静置10min后，在波长420nm处，用光程10mm比色皿测定吸光度，并以无氨水为参比。由测得的吸光度，减去零浓度空白管的吸光度后，得到校准吸光值，绘制以氨氮含量(mg)对校正吸光度的标准曲线。同时以无氨水代替水样，做空白测定，校准样品的吸光值。由测得的样品的吸光度减去空白对照的吸光度后，从标准曲线上查得氨氮量(mg)后，按取样体积计算出培养基中的氨氮量，对比各菌液和对照ck中的氨氮量，计算出培养基中氨的脱除率，从而比较各菌株的脱氨能力，从中选出脱氨效果好的菌株进行下一步实验。

4、脱硫菌株的复筛是用亚甲基蓝比色法来筛选脱硫能力强的菌株

与测定脱氨功能相似，待测菌株为含硫富集培养基富集分离出的纯化菌株，从固体琼脂平板上挑各菌株的单菌落转接于pda培养基中，置于恒温摇床中过夜培养，培养条件为28℃、180r/min，以获得到新鲜种子液，再用移液枪取种子液按5％的接种量转接于硫化氢的pda培养基中，置于恒温摇床中180r/min、28℃培养24h，间隔一定时间取菌液，于离心机12000r/min离心2min，取上清液用亚甲基蓝比色法显色后，在波长665nm下测定溶液中硫化物的含量，每个处理设置3个重复。测定培养液上清中硫化物含量，置于10ml比色管中，加无二氧化碳水至8ml，加1ml对氨基二甲基苯胺溶液，盖紧后上下颠倒一次，轻微混匀。不可以剧烈震荡，然后加入200μl硫酸铁铵溶液，立即在振荡器上震荡混匀，静置10min后，以水为参比，在665nm处测量吸光值，并以无二氧化碳水的空白管为对比进行校正。

取适量上清液于比色管中，加水稀释至8ml，按标准曲线显色方法进行显色，加1ml对氨基二甲基苯胺溶液，盖紧后上下颠倒一次，轻微混匀。不可以剧烈震荡，然后加入200μl硫酸铁铵溶液，立即在振荡器上震荡混匀，静置10min后，以水为参比，在665nm处测量吸光值，并以无二氧化碳水的空白管为对比进行校正。以标准曲线为依据，从中计算出硫化物的含量，并将实验样本和空白对照样本进行比较，去除空白对照样本的硫化物值所得的即为脱硫菌株分解代谢硫化物的量。根据去除能力的大小进行菌株的筛选比较，以获得较强脱硫率的菌株。最终得到一株脱硫脱氮能力强的菌株zt-c2。

采用伯杰氏细菌手册上的方法，测定分离菌株的生化特性，结果如表1和图1所示。

表1分离菌株zt-c2的生化特性

表1显示菌株zt-c2生理生化结果与酵母菌属相符，属东方伊萨酵母，于2018年6月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为cgmccno.16008，分类命名为：东方伊萨酵母(issatchenkiaorientalis)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

以下试验用培养基在制备过程中均在115℃灭菌30min。

pda培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)：葡萄糖20.0g，土豆200.0g，琼脂粉15.0g，加蒸馏水至1000ml，自然ph，115℃下灭菌30min。

实验例2菌株zt-c2的全过程去除污水中的总磷含量

污水样品为南京市浦口区定向河中污染的河水，由于靠近居民区，污水的主要成分为n、p、k，总磷的初始含量达到了3.06mg/l,水体中的总磷含量较高时会造成水体富营养化，水体富营养化会造成水体厌氧，鱼虾死亡，水体发黑发臭，总磷含量的超标对水体的净化具有很大的影响。正常的河水处于缓慢的流动中，因此在实验条件是在静置的污水中投加接种菌株，并在不同的时间测定污水中的总磷的含量，计算去除率。总磷的测定采用钼酸铵分光光度法。

(1)将培养12h的zt-c2(菌落形态如图1所示)菌液以1％的接菌量加入污水当中，搅拌均匀，对照组为不加菌的培养基按同样的接种量加入到污水当中。

(2)每天上午10点取污水测定其总磷的含量，并计算去除率。

结果如图2所示(ck为对照)：

(1)菌种接种到污水中在20天时对总磷的去除为40％，与对照相比，无显著性差别。

(2)20天对总磷的去除率仅为40％，去除率太低。

实验例3菌株zt-c2结合膜组件的挂膜工艺

从各自平板上挑取单菌落转接到各自对应的pda液体培养基试管中震荡培养12小时得到新鲜的种子液。按照1％的接种量接种到加有1l的培养基摇瓶中震荡培养48小时作为发酵液。每株菌株发酵2.5l的发酵液。然后膜组件进行挂膜，挂膜时间为72小时，工艺为膜组件结合微曝气装置，整个挂膜过程如图5所示。

实验例4菌株zt-c2结合mabr技术后的全过程去除高氨氮污水

由于直接往污染的河道中投加菌株造成菌剂用量大，成本高，河水流动，造成菌剂的流失浪费，另一方面，直接投加菌剂效率仅为70％左右，效率不高。本着减少用量，降低成本，高效率的降低氨氮的原则，选择菌株zt-c2结合mabr技术的工艺去除高氨氮污水，氨氮的初始含量高达21.93mg/l,高氨氮污水样品为南京市浦口区定向河中污染的河水。

(1)将发酵好的菌株zt-c2浓度约为10⁹cfu/ml挂膜到中空纳米纤维膜上，微曝气。作为实验组。

(2)中空纤维膜直接放于等体积的水中，微曝气。作为微曝气对照组。

(3)另一个处理为空白处理，不微曝气，不加菌。

(4)挂膜成功后把三组处理投加到污水中，每天上午10点取污水测定其氨氮的含量，计算去除率。

结果如图3所示(其中ck(standing)表示空白处理，即不微曝气，不加菌，ck(aeration)表示仅中空纤维膜对照，即仅)微曝气：

(1)菌株zt-c2结合mabr技术的工艺后，11天后氨氮去除率极速增加，到15天氨氮去除率已达到99％，氨氮去除效果极佳。

(2)中空纤维膜未挂菌株zt-c2的处理组在32天后氨氮的去除率仅为90％，因此，菌株zt-c2结合mabr技术的工艺后，对氨氮的去除不仅缩短了时间还提高了效率，使得氨氮去除率在15天达到了99％。

实验例5菌株zt-c2结合mabr技术后的全过程去除污水中的总磷

由于直接往污染的河道中投加菌株造成菌剂用量大，成本高，河水流动，造成菌剂的流失浪费，另一方面，直接投加菌剂效率仅为40％，效率太低。不能作为工业化生产，本着减少用量，降低成本，高效率的降低总磷的原则，选择菌株zt-c2结合mabr技术的工艺去除污水中的总磷，总磷的初始含量高达3.06mg/l,污水样品为南京市浦口区定向河中污染的河水。这个实验持续60天。

(1)将发酵好的菌株zt-c2浓度为10⁹cfu/ml挂膜到中空纳米纤维膜上，微曝气。作为实验组。

(2)中空纤维膜直接放于等体积的水中，微曝气。作为微曝气对照组。

(3)另一个处理为空白处理，不微曝气，不加菌。

(4)挂膜成功后把三组处理投加到污水中，每天上午10点取污水测定其总磷的含量，计算去除率。

结果如图4所示(其中ck(standing)表示空白处理，即不微曝气，不加菌，ck(aeration)表示仅中空纤维膜对照，即仅)微曝气：

(1)菌株zt-c2结合mabr技术的工艺后，总磷的去除呈现波段性，第一阶段出现在12-20天这个阶段，总磷的去除率在65左右，第二阶段出现在整个工艺后期50-60天，总磷的去除在75％左右。

(2)中空纤维膜未挂菌株zt-c2的处理组在整个工艺运行阶段均处于50％。

实验例6工艺运行前后膜组件上微生物含量检测

如图6所示，该图为mabr技术整个运行过程前后微生物的活菌检测，各菌株均达到了10⁶cfu以上的菌数。结合工业效率，得到结果为：在整个运行中，膜组件运行前后，zt-c2菌株在mabr系统中稳定存在，不因微曝气和水体流动而流失。