专利名称：复合过滤制品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于从包括一种或多种生物大分子溶液中特别是大规模地分离和提纯生物大分子的制品和方法。提纯的生物大分子用于治疗剂或者诊断剂。
发明内容
生物大分子是活细胞的成分或者产品，包括蛋白质，碳水化合物，脂质和核酸。这些材料的检测和量化以及分离和提纯长期以来是研究者的研究对象。检测和量化例如是各种各样的生理条件例如疾病重要的诊断指标。分离和提纯生物大分子对于治疗目，例如当给特定生物大分子缺乏的病人给药时，或者用作一些药剂的生物相容的载体，和在生物医学的研究中是重要的。生物大分子例如酶，是特殊类别的能够催化化学反应的蛋白质，同样是工业有用的；酶已经被分离，提纯，然后用于生产增甜剂，抗菌素，和各种各样的有机化合物，例如乙醇，乙酸，赖氨酸，天冬氨酸，和生物学有益的产品，例如抗体和类固醇。
在活体内它们的天然状态下，这些生物大分子的结构和相应的生物活性通常保持在相当窄范围的pH和离子强度内。因此，任何分离和提纯操作必须考虑这样的因素以使得到的处理的生物大分子具有药效。
色谱分离法是通常在生物产品混合物上实施的分离和提纯操作。它是一项基于在流动相之间溶质互换的技术，所述的流动相可以是气态或者液态相和固定相。溶液混合物各种各样的溶质的分离是基于改变每一溶质与固定相结合的相互作用实现的；与相互作用不太强的溶质相比，当经受流动相去结合效应作用时，较强的结合相互作用通常导致更长的保留时间，用这种方式，实现分离和提纯。
已经使用改进的过滤盒进行生物分离。U.S.5,155,144公开了多微孔网片，包括将典型的离子交换色谱固定相，改进的多糖颗粒状物例如二乙基氨基乙基纤维素分散在聚合物介质之内。建议这些片可以更进一步地构建为闭端过滤盒。
使用再循环流出物，评价通常作为两个不锈钢格栅之间浅柱用于分析分离D-木糖的铅离子处理的树脂(参看A.M.Wilhelm and J.P.Riba，J.Chromatog.，1989，484，211-223)。评价最终充填床层反应器体系以确定在相对高体系压力和低流速下生产液相色谱，用于柱中最后使用的粒子的水动力条件。
在分析规模上有用的相对新型色谱分离介质是整料。通过用适当的单体，溶剂和引发剂填充色谱柱制备该类型介质，在适当的位置进行聚合物形成反应。形成完全填充柱的多孔聚合物塞子，因此消除了小心填塞柱的需要。整体的介质相对于微粒介质具有改进的分离特性。然而，因为在聚合过程期间遇到放热和传热问题，升级到大柱是有问题的。
发明内容
简要地，本发明提供一种包括过滤元件的复合过滤介质，包括至少一层多孔纤维性的过滤层(例如纺织或者非纺织多孔材料层)，和至少一个能够与目标分子结合的固定相颗粒状物吸附剂层，所述固定相颗粒状物选自平均直径小于50微米的粒子，柔软的聚合物粒子和压碎的整块聚合物粒子。
尽管在整个该申请中使用术语“生物大分子”作为优选的方案，如本发明以下的描述应当理解固定相颗粒状物也能够吸附或者结合其他的目标分子。所述颗粒状物能够通过例如吸附，离子交换，疏水性结合或者亲和结合从而结合生物大分子。所述颗粒状物比使用包括常规生产规模色谱树脂颗粒状物的过滤介质所能实现的，可提供更高的结合容量和/或更高的吸收效率和处理量。
大规模的生物分离方法(例如在生物制药过程中)通常在大直径的填充柱中进行，其中可连续实施平衡，载荷，洗涤，洗脱和再生/清洗。因为蛋白质吸收的动力学限制(在色谱粒子之内蛋白质分子缓慢的粒子内部扩散)，这些柱通常仅载荷到它们静平衡能力的一部分。结果是相对缓慢的过程，处理量相当的低。
如本发明使用的“大规模的生物分离”定义为在生物制药的制造过程中下游的一个步骤，其中完成分离和/或提纯在容积为100公升或更大的生物反应器中生产的生物大分子产品。为阻止生物分子产品的降解，该生物分离应该在24小时或更少的时间内进行。假定在生物反应堆中生产的液体培养基中典型的生物大分子浓度为大约1克/升，这接近在24小时提纯至少100g产品的能力。
对于小规模分析提纯，由于小直径柱(例如，直径小于大约5厘米的柱)提供的边壁效应能够使用具有大小，形状，刚性，孔隙度等各种各样特性的色谱树脂。在小的色谱柱中，色谱法树脂的填充床被柱内壁充分支持，因此可以利用具有相对宽范围特性的树脂，能承受充分超过200psi(1.38MPa)的分压，而不引起对树脂粒子的损害。这些边壁效应当所述柱直径增加时而减少，在直径大于20厘米的情况下已无关紧要。
因此，在大规模提纯治疗蛋白质需要的大直径的柱情况下，对于色谱粒子有严格的要求以便达到经济可行的处理量。在相当低的压降情况下，这些柱必须能够获得相对快的流速。通常，希望至少150厘米/小时的表面速度(或者线性流速)，其中500-1000厘米/小时的流速是优选的，在小于200psi(1380kPa)的分压下，优选小于50psi(345kPa)以实现合理的处理量。这些压力/流动要求规定有用的色谱树脂必须是十分刚性的(例如，在所述柱中使用的流速下具有低的压缩性)，必须是相对大的平均尺寸(例如，超过大约50-150μm的粒径)，必须具有相对窄的粒度范围分布(例如，必须进行筛分以除去细微的和大的粒子使得在柱中充填容易而不产生沟流等)。
然而在实践中，在1厘米直径柱中的压力/流动试验是在大的生产规模柱中实际应用的指示。例如，在1厘米直径柱中在50psi下支持特定流速的树脂通常仅支持当填充在10厘米或者较大直径柱(在相同的床层高度下)中那些值的30-40％的流速。通常认为当树脂填充在1厘米×10厘米柱中时在50psi(0.34MPa)必须支持＞300cm/hr的流速(4ml/min)，在50psi下优选＞600cm/hr，以对于生产规模色谱生物分离具有任何的实用性。
各式各样的色谱粒子可商业获得用于提纯生物分子。许多这些树脂和它们的组合物的适当的描述提供于“Immobilized Affinity LigandTechniques”，G.T.Hermanson，A.K.Mallia，and P.K.Smith，AcademicPress，NY，1992，pp.1-41中。尽管大部分这些材料用于分析规模的分离，但仅选择的材料被认为在生产或者大规模上是有用的。例如，基于天然的聚糖琼胶糖和纤维素的支撑物具有合乎要求的亲水性，大容量，低的非特异性结合等性质。为在生产规模中有用，琼胶糖材料必须是相当高水平(例如6％或更多)交联的以达到支撑相当高流速必要的刚性。然而，交联工艺导致容量降低。聚丙烯酰胺基支撑物具有有利的优良pH稳定性，优异的化学稳定性，低非特异性结合，和对微生物侵袭耐受性的特性，但是通常是十分柔软的，通常仅有几cm/hr的流速。基于多糖右旋糖酐和合成单体复合物的聚丙烯酰胺葡聚糖支撑物，同样是优良的支撑物用于小规模提纯，但是由于它们柔软的可压缩的性质通常因低流速受困扰。
在一个实施方式中，本发明提供可以使用柔软的可压缩的固定相用于高效大规模生物分离的复合过滤介质。这样的复合过滤介质使用柔软的颗粒状物提供大容量，高吞吐量，和优良的流速。如本发明使用，“柔软的”指沿着外加力轴可能变形至少10％的粒子。对于圆球形的小珠，这样的柔软粒子将经受颗粒高径比至少10％的变化。例如，在色谱柱中在至少50psi(0.34MPa)压力下，柔软的圆球形的小珠初始的高径比为1，可能变形到0.9或者更小的高径比。
可以制备基于无机和有机聚合物的十分刚性并能承受高压的色谱树脂。然而，粒子大小和粒度分布在获得生产规模填充床柱需要的高线性流速同样是十分重要的参数。尽管小粒子(例如直径小于大约50μm的粒子)在分析规模上是有利的，但它们导致非常高的背压(例如100-1000的psi)。因为在生产规模上不能耐受这样的压力，制造这些粒子通常包括分级或者粒子筛选操作以除去“细微的”或者小的粒子。除去大的，或者特大型粒子以提供相对窄的粒度分布范围，在柱形式中实现均匀充填和流动分布。该分级处理导致产量降低，增加树脂生产成本，最后导致增加生物制药成品的成本。其他的刚性基质例如可控孔度玻璃，是十分脆性的，因此必须小心翼翼地处理以避免破碎和粒子的磨碎，这将产生细粒物料而损害大规模生产中的压力/流动性质。
本发明克服本领域中的这些问题，通过提供复合过滤介质，可以使用平均粒度小于50μm，优选小于30μm的固定相用于高效大规模的生物分离。这样的复合过滤介质使用这些颗粒状物提供大容量，料想不到的高处理量，和优良的流速，同时压降低。本发明同样允许使用未分级的树脂用于高效大规模的生物分离。
在另外的方面，本发明提供一种分离(这可以包括提纯)生物大分子的方法，包括提供包括过滤盒的分离系统的步骤，所述的过滤盒包括复合过滤介质，能够与生物大分子结合的固定相颗粒状物位于其上游表面上，以使有选择地将所述生物大分子(或者在有关生物大分子情况下，多于一种生物大分子)结合到固定相颗粒状物上，以形成生物大分子固定相颗粒状物产物。优选，所述过滤盒是闭端过滤盒。所述使用的方法可以包括储液槽，包括含至少一种生物大分子作为溶质的溶液，和机泵和相关的管道，优选形成闭合环路组件，将所述溶液泵送通过所述过滤盒，任选，将洗脱溶液泵送通过能够反转生物大分子固定相颗粒状产物结合相互作用以释放生物大分子的闭合环路组件。在另外的方面，提供含复合过滤介质的过滤盒。
在本发明的又一个方面，提供一种分离过滤器组件，包括过滤盒和过滤盒外壳，本发明的复合过滤介质的固定相颗粒状物能够结合生物大分子。更进一步地，本发明提供一种从包括其他生物大分子溶质化合物中分离，提纯或者浓缩生物大分子的方法。所述方法在相对低的压力下进行，特别适用于大规模生物分离。
更特别的，本发明的方法提供一种液体过滤盒，包括复合过滤介质，其包含在适当连接到机泵和溶液储液槽的外壳之内。所述复合过滤介质通过如下方法制备，其中包括在液体(通常水)中至少一种吸附，离子交换，亲和性和疏水固定相颗粒状物的浆料泵送以使过滤层部分载荷，因此固定相颗粒状物主要位于所述多孔过滤层的上游表面上。要分离的生物混合物溶液然后泵送通过过滤盒，以使所述的生物溶质通过与固定相结合缔合从溶液中分离。通常实施该步骤以回收分离(即，结合)的生物溶质。
在洗脱或者分离步骤期间，然后将可实现与固定相结合反转的溶液泵送通过所述过滤盒，优选溶液的体积小于生物溶液混合物的初始体积。从通过所述过滤元件的溶液中结合选择的生物大分子溶质可以通过吸附作用或者化学相互作用实现。优选结合机制包括吸附，离子交换，疏水缔合和亲和结合。在分离步骤中，所述结合可被反转以分离和提纯预先结合的生物大分子。
在本申请中
“生物大分子”是指分子量至少500的细胞组分或者产物，例如蛋白质，碳水化合物，脂质，或者核酸；“过滤层”是指可以包含一个或多个单层的片状纺织或者非纺织多孔材料，可以结合提供单片；平均孔径大于1μm，最高达50μm。
“复合过滤介质”或者“复合过滤器介质”是指包括位于其上游表面上固定相颗粒状物层的过滤层；所述介质在过滤盒压力最多0.25兆帕(MPa)可以维持至少0.01cm/min的通量率，“复合过滤介质”包括一个或多个过滤层和布置在设置为流体通道的其上游表面上的吸附剂颗粒状物层；它是完成过滤/分离/提纯操作的分离过滤组件的实际组件；“目标分子”指一种或多种化学物种，本发明描述的复合过滤制品设计成能从液体原料流或者溶液混合物原料流中分离所述的化学物种。目标分子可以包括例如药品物种，生物大分子，例如蛋白质和抗体(单克隆的或者多克隆的)，DNA，RNA，由细菌表达的物种，酵母，哺乳动物，植物，或者昆虫细胞，矿物质，和人造的化学物种，例如合成小的有机分子，缩氨酸和缩多氨酸，低聚糖，和糖改性的蛋白质。在一些实施方式中，所述目标分子可以是一种或多种杂质或者废产物，包括蛋白质，无机物种，例如金属，金属离子，或者离子，例如碳酸盐，硫酸盐，氧化物，磷酸盐，碳酸氢盐，及其他通常在工业，住宅和生物原料流中存在的离子，小的有机分子，例如包含但是不局限于染料，杀虫剂，肥料，添加剂，稳定剂，工艺副产品和污染物，DNA，RNA，磷脂，毒素，或者其他的来自生物过程的细胞碎片的那些。在又一另外的实施方式中，浸出的配位体例如来自上游亲和性分离过程的蛋白质或者其他的亲和配体同样可以是目标分子。在其他的实施方式中，本发明描述的复合过滤制品例如通过吸附或者酶促反应可用于除去各种各样的来自废水或者饮用水物流的化学或者生物学物种。
“过滤盒”是指固定相颗粒状物可以负载到其上的过滤设备；“过滤盒外壳”是指过滤盒的支承结构；“大孔的”指甚至在干燥状态也具有永久多孔结构的粒子。尽管所述树脂当与溶剂接触时可以溶胀，但通过多孔结构进入所述粒子的内部不需要溶胀。
“凝胶类型树脂”或者“凝胶”在干燥状态不具有永久的多孔结构，但必须通过适当的溶剂溶胀以进入所述粒子的内部。大孔的和凝胶粒子另外描述在Sherrington，Chem.Commun.，2275-2286(1998)中。所述大孔的离子交换树脂通常的孔大小为20-3000埃(即，使用氮吸附在各种各样的相对压力低温条件下或者通过水银侵入孔隙率测定法表征孔径大小)。
“分离过滤组件”是指包括过滤盒，优选闭端过滤盒的外壳，所述的过滤盒包括在设置固定相颗粒状物的上游表面上的复合过滤介质；“分离系统”是指包括位于储液槽中的至少一种生物大分子溶质的溶液混合物，分离过滤组件或者色谱柱，机泵和相关管道；“分离设备”是指一种容器，包括至少一种流体通过所述设备的装置和将固定相颗粒状物保留在设备之内的装置；“通量率”表示通过过滤元件的液流速度，等于流速除以过滤层的横截面表面积。如这种方法描述，可以表征液流通量率，与过滤层的尺寸无关。通量率同样成为整个滤器压降的原因之一，即增加通量率通常意谓着增加系统压力。在工业用过滤盒应用场合中，高度希望提供最小尺寸能处理最大量液流的过滤器。因此，最好通过增加流速增加通量率；“固定相颗粒状物”是指可以与溶液混合物中所关心的组分形成结合缔合的不溶性颗粒状物。特定的结合缔合包括吸附，离子交换，疏水和亲和性相互作用；“不可溶的”表示在23℃100份溶剂中溶解不超过1份颗粒状物；和“过滤盒压力”表示在分离系统中贯穿整个过滤盒单元在进口或者上游与出口或者下游之间的压力差。
本发明方法克服现有技术包括常规的用于分离生物大分子的大孔颗粒状物过滤器的问题。包括在过滤元件之内的固定相颗粒状物的现有技术过滤器存在制造难题，仅提供有限的容量。颗粒状物的较高载荷导致过滤元件孔隙度减少，伴随操作系统压力增加。本发明通过在相对低过滤盒压力下提供高载荷容量的颗粒状物克服这些现有技术过滤器的问题。
附图简述
图1是包括过滤层的复合过滤介质横截面的示意图，所述的过滤层包括位于其上游表面上的固定相颗粒状物的层；图2是在本发明复合过滤介质上压花图案的透视图；图3是本发明圆柱折叠过滤器元件的透视图；图4是本发明筒式过滤盒的支承构件的透视图；图5是本发明分离过滤组件的透视图；图6是本发明分离系统的示意图；附图的详细说明图1是复合过滤介质10的横截面示意图，包括优选的非纺织织物作为表面过滤层11，所述的表面过滤层11可以是一个或多个单层，不可溶的固定相颗粒状物12位于表面过滤层11的上游表面上。具有均匀的孔隙度和恰当限定的孔的所述非纺织过滤层11可以包含粗糙的上游预滤层13，包括多个越来越多更微细下游孔隙度的非纺织过滤层的过滤层14，和下游的非纺织覆盖层15。
图2是本发明优选方案的举例说明。显示了在用于生产过滤盒的复合过滤介质20上压花形状图样22的非折叠部分。进行压花以增加正面表面积，更完全地限定表面过滤元件。为清楚起见，在举例说明中省略不可溶的固定相颗粒状物。
图3是本发明优选方案纵向延长圆柱折叠过滤器元件30的透视图；本发明优选的复合径向折叠过滤元件30的径向褶层32；再次，为清楚起见，省略固定相颗粒状物。
图4是说明本发明优选方案的筒式过滤盒40的内部和外部辅助支承构件的透视图。外部支承结构41，例如具有许多空穴的纤维织品或者筛网，以内外流体流动模式可以提供另外的支撑以减少过滤元件破裂的可能性。类似地，由纤维织品或者筛网或者多孔外壳或者类似的结构组成的内部支承结构42可以提供支撑，以防止过滤元件(未示意)在优选外内流体流动情况高压应用场合下坍塌。在两种情况下，所述辅助的支承结构通常连接到过滤盒的末端43以提供整体部件。
图5是本发明优选方案的分离过滤组件70的透视图。过滤外壳71包含过滤盒(未示意)。在分离回路中，入口72可使溶液混合物以优选的外内模式进入所述过滤盒。所述液体通过出口73离开分离过滤组件70。在优选组件中，分离端盖74通过机械夹具75使用具有张力调节控制旋钮76的螺栓(未示意)结合到过滤外壳71上。在分离回路中，入口77可以使去结合的溶液以优选的外内模式进入过滤盒，现在包括希望的生物大分子溶质的所述产品溶液通过出口78离开分离过滤组件。
图6是本发明分离系统80的示意图。储液槽81包含固定相颗粒状物浆料水溶液82和/或生物大分子溶液混合物82，同时通过搅拌装置83提供搅拌。通过机泵85从出口管84将浆料或者溶液82泵送通入分离过滤组件86(包含位于过滤盒过滤层上游表面上的固定相颗粒状物(未显示))，并通过入口管87(箭头记号显示液体流动方向)返回所述储液槽。
详细描述本发明提供一种分离和提纯生物大分子的包括分离过滤组件的制品和方法，所述的分离过滤组件包括在过滤层上游表面上含有可以结合生物大分子的固定相颗粒状物的复合过滤介质。在另外的实施方式中，本发明提供一种使用分离设备大规模生物分离的方法，所述的分离设备包括在过滤层上游表面上可以结合生物大分子的固定相颗粒状物。所述固定相颗粒状物可以包含平均直径小于50μm的有机的或者无机的粒子，柔软的颗粒状物和压碎的多孔整块材料。
所述分离过滤组件包括液体过滤盒，所述的液体过滤盒包括上述的复合过滤介质和适当的用于将过滤元件连接到包括一种或者优选两种或多种生物大分子的溶液储液槽的盒外壳。所述过滤盒通过适当的配管连接到能够传送所述溶液的机泵，所述的溶液可以包括选择的要分离的生物大分子，通过结合到颗粒状物或者洗脱溶液可以释放结合的生物大分子，通过复合过滤介质并返回所述储液槽，因此产品溶液可以重复循环通过复合过滤介质用于更进一步捕获自由生物大分子以完成分离，或者如果希望，以洗脱结合的生物大分子。所述制品和方法在大规模生物分离中是有用的。
更特别，本发明提供一种分离或者提纯生物大分子的方法，所述方法包括如下的步骤1)提供分离系统，包括过滤盒(优选闭端过滤盒)，所述的过滤盒包括复合过滤介质，能够吸附，离子交换，疏水或者亲和性与生物大分子结合的固定相颗粒状物(如本发明描述)位于复合过滤介质上游表面上，储液槽，包括含一种或多种生物大分子溶质的溶液混合物，机泵和相关配管(优选形成闭环系统)；2)泵送所述溶液混合物通过过滤盒组件以完成选择的生物大分子与固定相颗粒状物的结合(任选再循环)，所述通过过滤元件的泵送在通量率至少0.01厘米/分钟，优选至少0.10厘米/分钟，更优选至少0.30厘米/分钟的通量率，过滤盒压力最多0.34MPa，优选最多0.25MPa下进行；3)任选，在开路或者一道工序中，用适当的液体洗涤所述生物大分子固定相颗粒状物产物以除去不希望有的生物大分子及其他未与固定相颗粒状物通过选择吸附，离子交换，疏水或者亲和性结合相互作用结合的溶质；和
4)任选泵送，优选体积减少的(与原始溶液混合物体积相比)去结合溶液，所述的去结合溶液使生物大分子固定相颗粒状物结合相互作用反转以释放分离的和提纯的生物大分子。
通过过滤液流除去颗粒状物可以通过应用以下的过滤机制的一种或多种完成，由每一机制操作的液体过滤盒现今是市场上可买到的。本发明利用这些过滤机制，由此在流动分离系统中所述过滤层保持固定相颗粒状物i)深层过滤-该方法是其中包括颗粒状物的液流迎头与过滤元件相遇的方法，所述的过滤元件具有选择尺寸的空穴或者孔分布并提供颗粒状物相当弯曲通道通过所述过滤层。在现有技术中，颗粒状物主要通过吸附和/或夹持在过滤层本身之内而除去。深层过滤，通常为应用于系统粗糙或者头道过滤步骤，设计成能除去大小从几百μm(最大直径尺寸)到大约1μm的颗粒状物，存在由于孔径大小限定不清楚而颗粒状物除去不完全，以及当过滤器载荷时过滤盒压力稳定迅速增加的问题。
ii)表面(滤饼)过滤--该方法是本发明优选的，在液流处理中通常在深部过滤之后进行。在现有技术中，通常使用多层的具有界限分明的孔径大小的玻璃或者聚合物微纤维进行，在所述过滤层之内，所述颗粒状物通常不穿透，但是保持被捕获在所述层的上游表面上。颗粒状物尺寸降至大约0.1μm可以高效率地载荷。容易实现高的通量率，相对大量的颗粒状物在相对低的系统压力下载荷直到过滤器接近完全。在本发明中，有利的是在过滤层表面上载荷，或者通过多路反向液体流重新排列过滤层表面上过滤的粒子；对于深层过滤不存在该机会。
iii)膜(滤网或者筛分)过滤--该过滤机制十分类似于表面过滤，不同之处在于存在准确限定的微细的孔，所述的微细的孔能够载荷尺寸低到0.05μm的颗粒状物。
本发明可以用于切向流动和“封端”的筒式过滤器。在切向流动或者径向膜的筒式过滤器中，所述过滤元件存在于与液流流动平行的平面内，产生两种流出物或者渗透物一个过滤(或者通过过滤元件进行处理)，另外的一个不过滤。尽管这些过滤器装置在低压下操作，理论上未处理的渗透物可以再循环，但这些体系本质上更复杂，更慢地完全处理液流，因为通过所述元件的流动相对低；同样，如果过滤元件以某种方式进行改变以保留生物大分子，那么需要在一次通过所述元件时实现完全固持。
在“闭端”过滤器中，所有的液流需要通过元件，仅产生一种渗透物。考虑作为通过与在过滤元件上或者在过滤元件之内的固定相相互作用实现分离的分离单元，闭端筒式过滤器类似于十分宽但是薄层的柱。在高流速下，生物大分子的单程固持率可能相对低，但是通过反复循环，可以保持生物大分子高的流出物百分数。
本发明的有用的表面过滤盒包括US 3,058,594中标准直立的折叠过滤器，特别优选的，U.S.4,842,739中的水平的复合径向折叠过滤器。本发明中优选水平的褶层结构(如图3所示)，因为过滤盒通常直立使用，当流动中止时更大百分数的粒子保持在水平的褶层之内，在使用之间贮藏盒。所述水平的褶层结构通常允许将更大量的过滤层表面积充填到盒中，因此比在直立折叠盒情况下导致更大的颗粒状物负载容量。同样可以使用其他的过滤盒例如缠绕线的，结合树脂的，和喷纺的深层过滤器，但通常缺乏如表面型滤油器一样有能力接受作为颗粒状物，同时保持相对低的系统压力。
可以从Ametek/US Filter(Warrendale，PA)获得具有过滤元件材料，例如，纤维素，纤维素-聚酯，玻璃-纤维素，聚酯，聚丙烯和陶瓷，以及平均标称孔径例如1，2，3，5，10，20，30，和50μm的各种尺寸的标准圆柱的，直立的折叠过滤盒。优选圆柱的，复合水平径向折叠的所有聚丙烯结构表面过滤盒可以从3M Filtration Products(St.Paul，Minn.)以各种尺寸购买，平均标称孔径为2，5，10，和20μm。用于较小规模分离的小的一次性使用的膜盒过滤器可以从Pall Corporation(East Hills，NY)以各种尺寸获得，含有过滤元件材料，例如，聚酰胺例如丙烯酸涂敷的尼龙，和聚丙烯，平均标称孔径，例如为1，3和5μm。
尽管结合(分离步骤)和洗脱或者去结合(分离步骤)相互作用可以使用从过滤盒制造商得到的过滤盒外壳进行，但这些外壳通常仅具有一套进口和出口。因此，当引入去结合溶液时，难以实现所希望的高浓度提纯的生物大分子。优选的过滤盒外壳具有另外尺寸较小的一套进口和出口。可以有利地使用该套较小的孔口通常以显著减少的溶液总体积实现所述生物大分子的去结合，因此在处理中也可在更浓缩的溶液中获得提纯的生物大分子。
优选，本发明过滤介质的构造包括在上游表面上的一个或多个非纺织层，在那个上游表面上随机布置不可溶的固定相颗粒状物。从机械学的观点和使用的溶剂而言，当进行生物分离时过滤介质的结构不是关键性的，因为几乎唯一地使用水，基本上所有上述特定的过滤层材料通常在水中表现很好。优选的材料是聚丙烯，因为其可供应性，成本和惰性。
过滤层孔径大小的选择直接依赖于在其上游表面上要保持的固定相颗粒状物的尺寸范围，通常对应于最小的颗粒状物尺寸。然而，已经确定即使颗粒状物的一部分具有小于过滤层孔径大小的尺寸，也可以获得有用的复合过滤介质。这些较小的颗粒状物将在初期的循环中通过所述过滤元件，在后来的循环中，当颗粒状物床层累积时，所述设备呈现深层过滤器的性质，本发明中也可以除去并利用这些较小的粒子。为时间效率和利用过滤盒的目的，然而在所述优选的表面过滤模式中，优选利用表面过滤盒单元，其中在首次通过所述过滤器中除去至少95％的所述固定相颗粒状物。
通常，额定名义上平均尺寸为0.1-10μm的过滤盒满足这些标准，提供高效的用于本发明使用的颗粒状物的过滤元件，以及能够在低过滤盒压力下输送相对高的流量。平均孔径小于0.1μm，例如多孔非纤维的膜的过滤层通常没有用，因为它们不仅被来自可能存在的外来粒子，而且甚至通常被在高度浓缩生物溶液混合物中遇到的悬浮生物试样堵塞。
对于本发明的目的，通过以下相互作用的一种或组合，固定相颗粒状物与在溶液混合物中所关心的生物大分子结合或者强烈缔合吸附，离子交换，疏水缔合，和亲和性结合。用于本发明的多于一种类型的活化吸附剂可以任何比例预混合。
用于本发明固定相颗粒状物的尺寸范围取决于使用的过滤盒的性质，从其中小的部分例如小于5％是亚微米(最大的平均直径)的分布到高达几个毫米压碎的整块颗粒状物，到1000μm柔软的颗粒状物，和到高达50μm的硬质无机或者有机的颗粒状物。
优选柔软的固定相颗粒状物的粒子大小直径为在亚微米到400μm范围内，更优选1-200μm，最优选5-100μm。已经发现在有些情况下使用在宽范围之内的两种或多种粒度范围的颗粒材料是有利的。任何硬质或者柔软的颗粒状物可以为球形，规则形状或者不规则的形状。压碎的整块颗粒状物具有不规则的形状。
使用本发明的复合过滤介质，可以使用尺寸小于50μm的硬质颗粒状物。在一些实施方式中，可以使用尺寸小于30，20或者10μm的粒子。在此以前，这样的“细粒物料”由于在充填和使用柱期间遇到的高压而不认为有用。本发明的复合过滤器允许通常在小于0.34MPa压力下使用这样的细粒物料用于大规模的生物分离。特别是，使用尺寸小于50μm的粒子是有利的，因为较小直径的粒子在吸附过程中具有较小的扩散阻挡层。因此，将小的粒子结合进入本发明的分离设备中可以导致在生物分离过程中快速的捕获动力学和总的处理量增加。
在一些实施方式中，用于本发明的粒子与粒子重量相比具有高的吸水能力。在此以前，由于水的可膨胀性或者缓冲液或者pH变化而经受尺寸变化的粒子认为是不太所希望的，因为它们在使用期间会引起尺寸变化。在填充色谱柱中这是特别不希望的，因为它会导致压力的急剧变化引起沟流，或者限制流动。已经发现这样的尺寸变化，典型柔软的凝胶颗粒状物的尺寸变化，在本发明的分离装置中不产生不良影响。更进一步，与此相反，已经发现这种柔软的凝胶颗粒状物比常规的色谱法粒子具有更高的容量。
本发明重要的特征是使用具有相对高浓度涉及与所关心的生物大分子相互结合作用的官能团的颗粒状物支撑体，通常可以分离更大量的选择的生物大分子。对于支撑体颗粒状物，希望相对高的表面积以提供高浓度可利用的官能团。
优选，所述颗粒状物的表面积至少为10m2/g，更优选至少为50m2/g，最优选至少为100m2/g，并且甚至最高达5000m2/g(根据气体吸附测量确定)。对于柔软的或者凝胶类型颗粒状物，官能团的浓度通常可以通过降低交联密度增加，这同样导致柔软的粒子。最佳的交联密度取决于所述颗粒材料的化学组成。例如，对于琼胶糖基支撑物，交联密度小于6％将提供支撑物高的官能团密度和同时高的生物大分子容量。对于丙烯酸和苯乙烯基颗粒状物，交联密度小于20％将允许包含更大量的适当的官能团。
在溶质和固定相颗粒状物之间的各种各样的相互作用可以包括相对弱的吸引力例如偶极-偶极，离子-偶极和离子-离子相互作用。在本发明中使分子量至少500的生物大分子有效结合的是在生物大分子和固定相之间相对大接触面积上发生的这些相互作用中的几种相互作用，导致最终强的吸引力。
利用在固定相上的极性基团和生物大分子上广泛的多种多样的极性基团的结合缔合实现吸附分离。这些结合缔合通常为偶极-偶极和离子-偶极相互作用的形式。所述提纯操作的结合或者分离阶段通常从相对低离子强度的水缓冲溶剂中进行，因此上述提到的在固定相和生物大分子溶质之间结合缔合可以达到最大值实现结合。在用低离子强度的缓冲水溶液洗涤之后，通常使用的洗脱溶液包含相对大量的溶解盐并伴随高离子强度，因此在固定相和溶解盐之间的相互作用可从固定相中置换生物大分子，所述生物大分子再溶解，可以从分离系统中以更纯的形式回收。
优选的吸附固定相颗粒状物包括羟磷灰石，氧化铝和氧化锆(公开在U.S.5,015,373)。离子交换分离利用许多生物大分子是离子带电的事实。此外，许多这些离子带电基团，例如质子化的胺和羧酸酯，可以通过改变pH使其为中性和不带电荷。这提供敏感和十分强大的基于它们等电点的分离生物大分子的技术，所述的等电点通常由pI值指示，所述的pI值是在此时存在电中和，或者在分子之内带阴电荷基团和带阳电荷基团的数目相同的pH。如果pH保持大于pI，则阴离子交换树脂可用于结合生物大分子；相反的，如果pH小于pI，则阳离子交换树脂可以实现结合从所述溶液混合物中除去生物大分子。对于该技术，生物大分子上可利用的或者表面电荷甚至小的差异能导致有效的分离。在洗涤不溶解的生物大分子固定相颗粒状物产物之后，通常通过引入相对高浓度的盐溶液从离子交换固定相颗粒状物洗脱结合的生物大分子，所述的盐溶液可与固定相颗粒状物中的生物大分子交换并替换生物大分子。做为选择，通过改变洗脱溶液的pH完成洗脱。这种硬质的无机颗粒状物的平均粒子直径小于50μm，优选小于30μm。
颗粒状物的聚合物基体可能包含多种物质，包括而不是限于交联琼胶糖，交联聚苯乙烯，亲水聚醚树脂，丙烯酸树脂和甲基丙烯酸酯基树脂。所述离子交换剂官能团组份可以包含但是不局限于选自磺丙基阳离子交换剂，羧甲基阳离子交换剂，磺酸交换剂和膦酸交换剂阳离子交换剂。在其他的实施方式中，离子交换剂组份可以为但是不局限于选自二乙氨基乙基(DEAE)，三甲基氨基乙基(TMAE)，和二甲基氨基乙基(DMAE)的阴离子交换剂。某种实施方式可以包括阳离子的，阴离子的和疏水性相互作用的组合。
有用的阴离子交换树脂特征在于琼胶糖，右旋糖酐和已经被改性为包含叔和季铵基团的纤维素聚合物。阳离子交换树脂特征在于相同的基础聚合物，但是具有羰酸酯和磺酸酯基团。
有用的离子交换树脂可以通过在Meitzner等人的U.S.4,501,826，4,382,124，4,297,220和4,224,415中描述的通用的技术制备。在一些实施方式中，使用较小量的交联剂-足以生产凝胶颗粒状物，而不是描述的大孔颗粒状物。交联剂的量可提供大于0.5的溶胀度，通常基于100份总的聚合物小于20重量份。基于丙烯酰胺类型单体有用的离子交换树脂公开在受让人共同未决专利申请U.S.S.N.10/849,700中。
疏水性相互作用和反相色谱法利用许多生物大分子的疏水性。生物大分子的疏水部分与固定相颗粒状物的疏水官能团的相互作用导致结合缔合，从所述溶液混合物中分离所述生物大分子。通常通过相对高离子强度水溶液的结合实施所述方法。在该方式中，所述生物大分子的溶解性开始有点儿不确定，几乎从溶液中“盐析”，容易与疏水载体结合。通常通过使用离子强度减少的水溶液(并增加所述生物大分子的溶剂效率)实施洗脱；做为选择，含量最高达50重量百分数的有机溶剂例如丙酮，乙腈，乙醇，甲醇，和N，N-二甲基甲酰胺，可以与作为共溶剂的水使用从含有固定相颗粒状物不可溶的复合物除去所述生物大分子。
有用的疏水性相互作用固定相颗粒状物包括但是不局限于通过夹杂例如丁基，辛基和苯基改性的琼胶糖基支撑物和丙烯酸支撑物。有用的反相颗粒状物包括但是不局限于苯乙烯-二乙烯基苯支撑物和有机硅烷改性的二氧化硅支撑物。
通常通过将配位体或者生物特性的效应物共价结合到固定相颗粒状物操作亲和色谱法。选择该配位体或者效应物，因为其具有通过“加锁和开锁”关系与生物大分子相互作用的能力。如果例如蛋白质是希望分离的生物大分子，那么通常共价结合的配位体或者效应物是与所述蛋白质活性部位(“加锁”)强烈结合的基材或者抑制剂(“开锁”分子)。该过程的高选择性可以允许从复杂混合物中一步提纯生物大分子。尽管洗脱通常通过简单改变pH实现，但对于每一生物大分子-配位体对的去结合溶液和技术是特定的，可以从厂商获得具体的指导。
有用的亲和色谱固定相颗粒状物具有多种基质，包括琼胶糖，纤维素，和(对于相应的生物大分子亲和力)具有几个配位体的乙烯基聚合物，所述的配位体包括精氨酸和苄脒(丝氨酸蛋白酶)，汽巴克隆(活性染料)蓝色(需要酶的腺嘌呤-包括协同因子，白蛋白，组织凝血活酶，干扰素)，钙调素(腺苷三磷酸酶，蛋白激酶，磷酸二酯，神经递质)，凝胶(纤维结合蛋白)，谷胱甘肽(丝氨酸转移酶，谷胱甘肽相关的蛋白质，融合附加物)，肝素(增长因子，凝结蛋白质，类固醇受体，限制性核酸内切酶，脂蛋白，脂肪酶)，蛋白质A和G(IgG和亚纲)，L-赖氨酸(纤溶酶原，血纤维蛋白溶解酶原活化剂，核糖体RNA)，普施安红颜料，(NADP+相关的酶，羧肽酶G)，刀豆素A和植物凝血素(糖蛋白，膜蛋白，糖脂，聚糖)，和DNA(DNA聚合酶，RNA聚合酶，T-4多核苷酸激酶，核酸外切酶)。
使用本发明的复合过滤介质，可以使用尺寸小于50μm的固定相粒子大小。在此以前，这样的“细粒物料”由于在充填和使用柱期间遇到的高压而不认为有用。令人惊讶地，本发明的复合过滤器允许使用这种细粒物料在压力小于大约50psi(0.34MPa)下用于大规模生物分离。更进一步地，可以使用柔软的颗粒状物。在此以前，柔软的颗粒状物不认为对于制备分离有用，由于所述胶粒变形导致高压和/或低流速。
在优选方案中，压碎或者磨碎的整块树脂可以用作吸附剂固定相颗粒状物。在传统的整块材料中，色谱柱填充有必需的单体和生孔剂，原位聚合形成固体连续的树脂填塞料。在此以前该方法仅适用于在相对小规模的柱中分离。
申请人已经发现这些整块材料可以在适当的容器中制备以产生填塞料，然后磨碎生产不规则形状的粒子。这些生产的粒子具有相对宽广的粒度分布(通常大约0.1-1000μm)，可以用于本发明的复合过滤器中。在该方式中，整块材料独特的孔隙度和动力学吸附能力可以适应大规模的生物分离。如果需要，磨碎的不规则形状的粒子可以按大小筛分，或者如刚生产的形式使用。在此以前，通过悬浮聚合生产的规则的成形(即圆球形的)粒子筛分为窄范围的粒子大小和/或除去所述细粒。这种细粒，如果不除去，将塞满在较大的粒子之间的孔隙空间，减少流动和/或显著地增加压力。未分级的磨碎的整块粒子不需要这种分级，或者除去细粒，可以用于本发明的复合过滤器，同时保持足够的流动并避免超过50psi(0.34MPa)的高压。
所述聚合物整料由存在于混合物中的单体组成，所述的混合物适于原位聚合导致形成这种多孔整块的聚合物。这种混合物例如包括单体或者单体，生孔剂和引发剂的混合物。
通常，所述聚合物整料包括聚合的单体单元，带有亲水基，亲水基的前体，可电离的基团或者其前体，疏水基或者其前体，或者它们的混合物。任选，所述聚合物整料也可以包含亲和配体。上述单体单元的任意组合意欲在本发明的范围内。
在包含聚合的带有亲水基或者亲水基前体的单体单元的所述多孔聚合物整料中，这种单体通常是丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯或者苯乙烯，其选自2-甲基丙烯酸羟乙酯，甲基丙烯酸丁酯，丙烯酸2-羟乙酯，甲基丙烯酸缩水甘油酯，丙烯酸缩水甘油酯，乙酰氧基苯乙烯，氯甲基苯乙烯，叔丁氧基羰基氧苯乙烯和其组合。
在包含带有疏水基或者疏水基前体的聚合单体单元的所述多孔聚合物整料中，这种单体通常选自丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯，丙烯酸酯酰胺，甲基丙烯酸酯酰胺，苯乙烯，苯乙烯衍生物和其组合，其中包括疏水基的所述优选的单体是丙烯酸烷基酯，甲基丙烯酸烷基酯，苯乙烯，烷基苯乙烯或者其组合。
在包含带有可电离的基团或者所述可电离基团前体的聚合单体单元的多孔聚合物整料中，这种聚合单体通常包含官能度例如氨基，羧基，磺酸基和磷酸基团(或者其盐)，其中优选可电离的单体选自丙烯酸，甲基丙烯酸，衣康酸，马来酐，苯乙烯磺酸，2-丙烯酰氨基-2-甲基-3-丙磺酸，2-(甲基丙烯酰氧基)磷酸三乙酯，氨基酸的丙烯酰胺，氨基酸的甲基丙烯酸酰胺，2-乙烯吡淀，4-乙烯吡淀，2-(二烷基氨基)丙烯酸乙酯，2-(二烷基氨基)甲基丙烯酸乙酯，2-(吗啉代)丙烯酸乙酯，2-(吗啉代)甲基丙烯酸乙酯，[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基铵氯化物，[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基铵硫酸单甲酯，和其组合物。用于制造所述整料的优选单体是丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯和其衍生物。
所述多孔聚合物整料另外包括交联单体。所述交联单体优选是多乙烯基单体，其选自二丙烯酸酯，二甲基丙烯酸酯，三丙烯酸酯，三甲基丙烯酸酯，二丙烯酰胺，二甲基丙烯酰胺，或者二乙烯基芳香单体，其中优选的多乙烯基单体是二丙烯酸乙二酯，二甲基丙烯酸乙酯，三羟甲基丙烷三丙烯酸酯，三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，或者哌嗪二丙烯酰胺，二乙烯基苯或者二乙烯基萘。
在一个优选方案中，所述多孔聚合物整料包括大约10-大约90％的一种或多种单乙烯基单体，大约5-大约90％的一种或多种多乙烯基单体和相对于所述单体大约0.01-大约2％的引发剂。
本发明多孔聚合物整料也可以任选包含大约1-大约50％的亲和配体。所述配位体在已经形成的整料之内共价固定化，或者以单体形式加入到聚合物混合物中之后聚合。所述配位体可以是生物或者合成化合物，其中所述生物亲和配体选自聚糖，抗体，酶，植物凝血素，抗原，细胞表面受体，细胞内受体，病毒外壳蛋白，DNA，和其混合物，和其中所述合成亲和配体选自活性染料，鞣酸，五倍子酸，亚氨基二乙酸，亚乙基二胺三乙酸，[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]二甲基(3-磺丙基)氢氧化铵惰性盐，和其混合物。
为实现希望的孔结构，聚合通常包括成孔材料。它们的功能首先溶解所有的单体和引发剂，然后形成均匀的溶液，第三在聚合期间控制相分离过程。
通常，所述成孔材料是水，有机溶剂或者其混合物。所述成孔有机溶剂选自烃，醇，酮，醛，有机酸酯，醚，可溶性聚合物溶液，和其混合物，例如环己醇，1-十二烷醇，甲醇，己烷，丙醇，十二烷醇，乙二醇，聚乙二醇，丁二醇，甲基-叔丁基醚，二异丙基甲酮，乙酸丁醇乙酯，醋酸丁酯，聚(甲基丙烯酸甲酯)和其混合物。所述成孔材料通常的含量为大约30vol％-大约80vol％，优选大约40vol％-大约60vol％。
本发明的整料通过原位引发聚合制造。原位聚合可以是当这种混合物沉积在模或者其他的适当容器之内，将所述聚合混合物有效聚合为整体结构的任意过程或者方法。所述原位聚合过程生产多孔质固体整料。这种过程可以通过加热，氧化还原反应或者光引发作用引发。
各种各样的整块聚合物材料在现有技术中是已知的。参见Frechetet al.，Adv.Matls.，1999，vol.11，No.14，pp.1169-1181和在其中的参考资料，及U.S.5,453,185，U.S.5,334,310，和6,887,384。一种有用的用于形成所述聚合整料的技术见U.S.申请公开2004/0166534(Roscoe et al.)中。
通常聚合为整块聚合物之后除去成孔材料。然后磨碎或者压碎聚合的整料得到粒径分布为大约0.1-1000μm不规则形状的粒子。所述孔径大小范围取决于选择的聚合混合物，特别取决于成孔材料的使用。得到的孔径大小通常小于大约200μm，优选小于100μm，更优选小于50μm。
可以使用任意适当的磨碎或者压碎技术，所述聚合物可以冷却到低于玻璃化转变温度以便于磨碎。
因此已经描述了过滤盒，过滤器外壳和固定相颗粒状物，现在详述制备所述分离系统的方法。所述方法包括如下的步骤i)提供包括过滤盒的组件，包括包含在外壳中的本发明的复合过滤介质，和能够输送流速至少0.01cm/分钟的机泵和相关配管；ii)将包括至少一种生物大分子溶质的生物溶液混合物引入到储液槽中，因此在所述分离过滤组件中经受循环实现生物大分子的分离。
所述复合过滤器包括平均粒度小于50μm的固定相颗粒状物，柔软的颗粒状物或者压碎的整块颗粒状物能够实现大规模的生物分离，即能够分离和/或提纯在体积100升或更大的生物反应堆中产生的生物大分子产物。在许多实施方式中，能够实现大规模的1000升，和10,000升或更大的分离。
用于本发明的机泵提供通过所述过滤盒的流速超过0.01厘米/分钟，优选超过0.10厘米/分钟，更优选超过0.30厘米/分钟。流动通过它们的至少一种包括多于一种生物大分子溶质的浆料和溶液混合物的所述机泵和相关的垫圈和配管/管路，优选相对地化学上不受所述溶液的影响。优选机泵包括蠕动泵，薄膜泵，齿轮泵和离心驱动泵，其中接触所述溶液的实际的机泵组件由不锈钢或者聚四氟乙烯(PTFE)建造。大多数类型的橡胶或者塑料管/管路适于在水中介质中实施填装和分离，但是如果使用有机溶剂的水溶液混合物，则优选使用聚丙烯，聚乙烯，聚四氟乙烯，不锈钢和玻璃管。优选成为过滤盒与过滤器外壳与其余分离系统连接的界面的衬垫料包括聚四氟乙烯和聚丙烯。
所述过滤盒可以通过包括如下步骤的“湿的”密封技术进行载荷i)提供包括过滤盒的组件，包括包含在外壳中的本发明的复合过滤介质，和能够输送流速至少0.01厘米/分钟的机泵和相关配管；ii)提供在适当溶剂中的颗粒状物的浆料；和iii)以循环模式将浆料泵送通过所述过滤盒，直到固定相颗粒状物已经载荷希望的量；优选所述过滤盒压力小于大约0.15MPa，更优选小于0.10MPa，最优选小于0.05MPa。
与常规的“干燥”充填制造工艺相反，将“湿的”颗粒状物通过利用液体载体充填在过滤层上可保证所述颗粒状物位于过滤元件随后可接触溶液混合物的区域内。因为不预先选定它们的位置，颗粒状物随机位于过滤层上，尽管液体载体的流动可能影响颗粒状物最后的位置。在通过上述方法充填所述过滤盒中，在每一次充填期间，希望使用在液体中相当稀浓度的颗粒状物以实现过滤元件相对均匀的部分载荷。所述颗粒状物以逐份(加入)方式加入到储液槽中(在没有溶剂的情况下，如果适当的浓，用水润湿或者预泥浆化)，在每一次配送之间目视识别储液槽中的容量。
填充操作的流速优选至少为0.01厘米/分钟，更优选至少0.10厘米/分钟，最优选至少0.30厘米/分钟。在分离阶段期间除数量和时间上高效地分离希望的生物大分子之外，在颗粒负载阶段期间，相对高的流速是希望的，特别对于优选的复合径向折叠过滤盒，因此所述颗粒状物可以更好地透过折叠过滤器元件的折层，因此接触更多的过滤元件从而有利于实现高载荷。用于淤浆化固定相颗粒状物的液体通常是溶液混合物的溶剂，通常是水，优选为缓冲的水。对于疏水性相互作用或者固定相颗粒状物反转，特别是在洗脱步骤中，有必要利用有机液体并与水结合使用。有用的有机液体包括含量最高达50重量百分数的甲醇，乙醇，异丙醇，乙腈，和N，N-二甲基甲酰胺。
将所述颗粒状物装入所述储液槽中，最后填充到过滤元件的上游表面上，直到过滤盒压力到达不超过0.15MPa，优选不超过0.10MPa，更优选不超过0.05MPa。对于满载荷的优选复合径向折叠过滤盒而言，实际的过滤盒压力极限大约为0.25MPa。作为应用过滤盒的一般规则，当过滤盒压力达到超过大约0.05MPa时，随后负载的另外的颗粒状物导致越来越高的过滤盒压力。然而，特别对于以下推荐的过滤盒压力，传送通过所述过滤盒的溶液流速保持很高，并在用于本发明目的希望的范围内。以这种方式，所述单元可以仍然响应在随后的分离和处理操作期间可能遇到的外来的颗粒状物。对于实际运转，通过保留一些微粒载荷容量，能防止由于过滤器堵塞导致的停车，可以延长过滤盒寿命。
所述装填固定相颗粒状物的过滤盒目前已准备好用作分离过滤组件从通入的溶液混合物中分离生物大分子。所述分离过滤器组件和盒在图1-5中用图解法举例说明。
在装填所述颗粒状物提供复合过滤介质之后，从所述储液槽(或者保留连接，如果所述充填储液槽同样起分离储液槽作用)移去进口和出口配管端，连接到包括生物溶液混合物的储液槽。生物溶液混合物可以包含多于一种生物大分子溶质。希望的生物大分子可以源自于发酵介质，细胞裂解液，和体液，例如血，和血成分，腹水和尿。
通常希望在最短的一段时间获得最大量的提纯生物大分子，即高生产量。高生产量通常在文献中定量为生产能力(或者生产率)，或者每一升色谱法树脂每小时提纯的产物量。Fahrner等人在Biotechnol.Appl.Biochem.，1999，30，121-128中已经报告市场上可买到的蛋白质A树脂的典型的生产量为13-23g/L/hr。使用本发明的分离系统，可以实现俘获效率和/或生产量＞25g/l/hr，＞40g/l/hr，＞70g/l/hr，和＞100g/l/hr。溶液混合物通过复合过滤介质的速度即流速，和(溶液混合物)循环已经确定认为是本发明性能重要的标准。一个十分重要的因素是本发明的分离过滤组件主要因为低压运转因此容许在给定时间处理较大量的溶液混合物。其他的有助于本发明分离过滤组件高效率的因素是1)利用具有相对高表面面积的较少固定相颗粒状物的能力，与在填充柱中较大的粒子相比减少扩散限制；2)生物大分子溶质和固定相颗粒状物在高流速下更好地切剪混合；和3)在更高流速下接触更大量的深含在过滤元件褶层或者折层之内的颗粒状物。溶液混合物通过的流速至少0.01厘米/分钟是优选的，更优选至少0.10厘米/分钟，最优选至少0.30厘米/分钟。
本发明的过滤元件在包括蛋白质，碳水化合物，脂质，核酸及其他生物试样的多种生物分离中具有实用性。分离和提纯的大分子是有用的治疗的和诊断剂。
本发明的目的和优点通过以下实施例进一步说明，但是在这些实施例中列举的特定材料和其量，及其它的条件和细节，不应该不适当地解释为对本发明的限制。
实施例这些实施例仅仅是用于说明性的目的，而不意谓着是对附加权利要求范围的限制。在实施例中和说明书其余地方所有的份数，百分数，比率等是按重量计算，除非另外注释。使用的溶剂及其他试剂从Sigma-Aldrich Chemical Company；Milwaukee，Wisconsin获得，除非另外注明。
试验方法对于溶菌酶的阳离子交换容量用1ml的离子交换树脂填充0.8×4厘米一次性使用的聚丙烯色谱柱(Poly-Prep Column，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)。通过用ml的荷载缓冲液，pH为7.5的10mM的MOPS(4-吗啉代丙烷磺酸)溶液，洗涤使柱床层平衡。所述柱床层然后装填30ml在MOPS缓冲液中浓度为12mg/ml的蛋白质溶液(鸡蛋白溶菌酶，约95％纯度，Sigma ChemicalCo.)。所有的缓冲液和蛋白质溶液用去离子水制备。用30ml的MOPS缓冲液(三个10ml份)洗去任何非结合的溶菌酶。最后，用在MOPS缓冲液中15ml的1M NaCl洗出结合的蛋白质。
通过使用Hewlett-Packard Diode Array Spectrophotometer，Model8452A测量在280nm处的紫外线吸收确定在不同部分中回收的蛋白质量。使用纯溶菌酶制备标准曲线。在NaCl洗脱物中回收的蛋白质量等于支撑体的平衡阳离子交换容量。
对于免疫球蛋白G(IgG)的阳离子交换容量通过混合小珠和水制备在去离子水中50％v/v的阳离子交换小珠的浆料，在3000相对离心力(rcf)下离心分离20分钟，然后调整水量，因此总体积数是填充的小珠床层的两倍。所述浆料充分地混合以悬浮小珠，然后400微升所述浆料样品用移液管加入5毫升0.45μm醋酸纤维素Centrex MF离心式的微过滤器中(Schleicher & Schuell，availablethrough VWR，Eagan，MN)。通过在3000rcf下离心作用5分钟除去水，用pH为4.5的包括80mM氯化钠的4mL 50mM的乙酸钠混合，再次在3000rcf下离心作用10分钟。弃去滤液。然后，向包括所述小珠的过滤器中加入在相同的乙酸酯缓冲液中4.5mL人IgG(大约7mg/ml)样品。通过翻滚混合所述混合物整夜，然后，通过在3000rcf下离心作用20分钟从小珠中除去上层清液。
通过紫外光谱学分析滤液，比较(过滤后IgG溶液)在280纳米处的吸收和所述起始IgG溶液在280纳米处的吸收；所述差用于计算所述小珠的IgG容量。进行三次试验并求平均数。
粒度测量使用Horiba LA-910 instrument(Horiba Laboratory Instruments，Irvine，CA)通过光散射测量粒度。
压力/流动表征计算机控制试验台由1cm×10cm玻璃柱，柱端接头，机泵，压力计和适当的连接到包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)储液槽的配管组成。所述柱用要测量的粒子填充。通过打开机泵开始流过所述柱，通常以2ml/min(大约150cm/hr)起始。保持以这个速度流动以确保压降稳定(通常5-15分钟)，然后通过2或者4mL/min的增量增加流速，再次监控整个柱的压降。连续该过程直到柱失效。失效定义为压力超过170psi，在该点计算机自动关闭所述系统。
通过蛋白质A亲和性捕获人IgG通过泵送小珠浆料通过所述过滤器，继之以泵送PBS缓冲液用于缓冲液交换，待试验人IgG捕获的粒子负载有蛋白质A并填充在筒式过滤器上(Pall装料机膜盒，5μm孔径大小，300cm2的过滤层面积，或者CUNO Betapure膜过滤盒，2μm孔径大小，900cm2的过滤层面积)。在从简式过滤器外壳中排空缓冲液之后，人IgG溶液(在10mM pH为7.2的PBS中1.0mg/mL，500mL总体积)装填进入所述储液槽，泵送进入过滤盒外壳并返回到所述储液槽再循环。流速为400mL/min，压降小于35psi(0.24MPa)。再循环溶液4-30分钟直到IgG俘获率达到接近于零，这可通过280纳米波长处紫外线吸收在线监控IgG浓度确定。从所述过滤器外壳通过入口管排出所述溶液，通过洗涤洗脱俘获的IgG以及缓冲液交换再生所述过滤盒中的小珠。在所述筒式过滤器中再生的小珠用于捕获所述溶液中剩余的IgG。该循环重复5次以捕获所述溶液中大部分的IgG(93-99％)。记录每一循环中的捕获性能和总的俘获率。
缩写词表
制备实施例1如U.S.专利5,403,902中描述的通过反相悬浮聚合制备按重量计算35∶65的AMPS/MBA共聚物。聚合物稳定剂(0.28克)，甲苯(132mL)和庚烷(243mL)加入到配备有机械搅拌器(搅拌速度450rpm)，氮气进口，温度计，有温度控制器的加热罩和冷凝器的烧瓶中。所述聚合稳定剂是按重量计算91.8∶8.2的丙烯酸异辛酯和2-丙烯酰氨基异丁酰胺的共聚物(如Rasmussen等人，Makromol.Chem.，Macromol.Symp.，54/55，535-550(1992)中描述的制备)。在所述烧瓶中的非水溶液搅拌下加热到35℃，用氮气鼓泡15分钟。
制备的水溶液包含MBA(9.10克)，AMPS(9.80克的按重量计50％的水溶液)，甲醇(50mL)和去离子水(45.1mL)。搅拌该第二溶液，在30-35℃加热溶解MBA。向第二溶液中加入过硫酸钠(0.5克)，进一步搅拌溶解所述过硫酸盐。水溶液加入到包括非水溶液的反应烧瓶中。搅拌得到的混合物并氮气鼓泡5分钟。加入TMEDA(0.5mL)引发聚合。所述反应温度迅速上升到42.5℃，然后缓慢降低。从添加TMEDA时刻起搅拌所述反应混合物总共2.5小时，使用烧结玻璃漏斗过滤，用丙酮(5×250mL)洗涤，在室温真空下干燥得到15.7克无色粒子。
制备实施例2-3遵循制备实施例1中描述的相同的反相聚合过程，其中调节试剂含量得到按重量计算65∶35的AMPS/MBA共聚物(制备实施例2)和按重量计算40∶60的AMPS/MBA共聚物(制备实施例3)。
实施例1通过如制备实施例2描述的反相悬浮聚合制备按重量计算65∶35的AMPS/MBA共聚物。测量溶菌酶平衡阳离子交换容量为160mg/mL。显微镜观察显示球状颗粒直径为大约10-200μm。试图度量压力/流动性质导致在最低的流速下柱过度加压。分级这些粒子样品提供大约45-110μm的粒度范围。该分级的样品的压力/流动表征在2mL/min(150cm/hr)下产生20psi的压降(～0.14MPa)，但是在3mL/min(大约230cm/hr)下失效(＞170psi＝1.17MPa)。
评价在以下系统中未分级的小珠样品过滤盒Pall Versapor盒，3μm孔径大小，1480cm2的过滤层面积小珠AMPS/MBA(65/35)；5mL水合床体积负载溶菌酶溶液在10mM，pH＝7.5，1000mL MOPS中2mg/mL缓冲液10mM MOPS pH＝7.5
系统体积(外壳和配管的)450ml流速1120mL/minmL/min，压降＜5psi步骤通过填充，排空和测量体积三次并平均结果确定系统体积。对于具体的机泵设值用秒表和量筒测量流速(同样平均三次试验的结果)。通过用50mL缓冲液制造小珠的浆料，然后将小珠填充在过滤器上。
该浆料分为两份加入到一定体积(大约1000mL)的缓冲液中，然后泵送通过所述过滤器，使所述缓冲液在加入部分之间澄清。通过两次漂洗原始的容器使残余的小珠载荷，在漂洗澄清之后允许再循环所述缓冲液另外15分钟。关闭机泵，将管线转换到溶菌酶溶液，起动机泵开始再循环。再循环溶液90分钟，将样品定期移开度量(紫外线吸收)在载荷溶液中剩余溶菌酶的量。这些结果显示于表1中。
对比例1通过如制备实施例3描述的反相悬浮聚合制备按重量计算40∶60的AMPS/MBA共聚物。分级形成的小珠以提供大约40-110μm的粒度范围。溶菌酶的平衡容量的测量结果为113mg/mL。该筛分样品的压力/流动表征在10mL/min(760cm/hr)下产生稳定的50psi(0.34MPa)的压降，然后在较高流速下压降略微增加，最后在＞1000cm/hr时失效。同样在实施例1描述的系统中评价该小珠，所述结果显示于表1中。
表1
NM＝未测量对比例2如制备实施例2描述的，从AMPS(36.4的50％的水溶液)，MBA(9.8g)，去离子水(31.8mL)和异丙醇100mL)通过反相悬浮聚合制备按重量计算65∶35的AMPS/MBA共聚物。测量的溶菌酶平衡阳离子交换容量为25mg/mL，测量的IgG的平衡阳离子交换容量是7mg/mL。
实施例2制备具有与比较实施例2含水相相同组成的整块的介质。混合MBA(0.993g)，50wt％的AMPS水溶液(3.649)，去离子水(2.88mL)和异丙醇(10mL)，在玻璃容器中温和加热并搅拌。在所述混合物完全溶解之后，将它输送到聚乙烯小袋(大约10cm×7cm×0.15mm壁厚)中，过硫酸钠(0.0512g)的水(0.3mL)溶液和TMEDA(0.05mL)一起加入。立即热密封小袋，然后在室温下定轨振荡器上轻轻摇动。切开小袋，将聚合物物质输送到过滤器漏斗，其中用水然后用丙酮充分洗涤它，在真空下干燥过夜。所述干燥样品用研钵和研棒轻轻地磨碎。粒子大小测量表明具有十分宽广的分布，其中粒子尺寸为1μm-700μm。
当在实施例1中描述的盒系统中评价时，磨碎的整料十分迅速地结合溶菌酶，在15分钟之内实现容量＞46mg/mL。相对于比较例2的动力学和容量，该材料迅速吸收的动力学和增加的容量可能通过在整块的介质中改进的质量传递和孔隙度进行解释。
实施例3如实施例1描述的制备按重量计算65∶35的AMPS/MBA共聚物，不同之处为聚合时间从2.5小时延长到5小时。通过洗脱将该样品分级为三种粒度范围-小的下料，中等的下料和大的下料。弃去中等的下料，所述小的和大的下料的平均粒度确定为37.6μm(小珠)和160.0μm(大珠)。然后在实施例1描述的所述盒中评价这两个样品。所述溶菌酶捕获结果列于表2。
表2
NM＝未测量实施例4对于小规模蛋白质提纯，CM-Sephadex C50是有用的离子交换树脂。制造商推荐的最大流速为45cm/hr，表明该树脂对于大规模柱使用太柔软。样品通过在40℃，10mM的磷酸钠缓冲液中混合过夜水合。10mL沉降的树脂装填到实施例1中描述的分离系统中，通过以1134mL/min的流速循环兔子IgG(在10mM磷酸盐中0.17mg/mL，pH 7.2)的溶液通过装填的过滤器膜盒评价IgG吸附。随着时间的推移取出样品进行紫外线分析表明IgG迅速吸附，在6分钟树脂吸附3.9mg/mL，在25分钟之内达到吸附平衡4.5mg/mL。制造商声称的有效容量(饱和容量)是7mg/mL。在试验期间没有观察到流速变化或者压力增加。
实施例5根据制备实施例1中描述的一般方法制备按重量计算95∶5的MBA/VDM共聚物珠。所述有机相由庚烷(348ml)，稳定剂(0.13g)，和VDM(0.72g)组成。所述含水相由异丙醇(90ml)，水(55ml)，MBA(13.33g)，过硫酸钠(0.55g)，和TMEDA(0.55ml)组成。如描述于P.R.Johnson，et al.，J.Chromatogr.A，1994，667，1-9中的方法，在去离子水中评价该珠(5A)的水合体积和肌红蛋白结合容量。结果显示于表3中。使用相同的成分和量制备第二MBA/VDM共聚物，不同之处为异丙醇体积增加到125mL，水增加到75ml。同样评价该珠(5B)的水合体积和肌红蛋白结合容量，结果列于表3中。
表3
实施例6-8根据在实施例5A中描述的方法制备按重量计算95∶5的MBA/VDM共聚物珠，不同之处为甲苯(188mL)加入到有机相中，总水体积增加到60毫升。对于实施例6，使用的聚合物稳定剂是丙烯酸异辛酯和丙烯酸按重量计算92.5∶7.5的共聚物(0.27g)，搅拌速度增加到600rpm；对于实施例7，使用的聚合物稳定剂是丙烯酸异辛酯和丙烯酸按重量计算90∶10的共聚物，向含水相中加入氢氧化钠(3.7mL 0.1M溶液)以中和丙烯酸；和对于实施例8，聚合物稳定剂是丙烯酸异辛酯和丙烯酸按重量计算95∶5的共聚物(1.06g)，向含水相中加入氢氧化钠(0.74mL 1M溶液)中和所述丙烯酸，向含水相中加入十二烷基磺酸钠(3mL的按重量计算10％的水溶液)，搅拌速度增加到750rpm。干燥之后，干燥分级所述珠获得下料，送入32μm筛子中。
根据US 5,907,016的教导，蛋白质A结合到实施例6-8的珠上。蛋白质A结合方法反应之前，所有的溶液在25℃水浴中平衡。在圆底烧瓶中，通过在40mL去离子水中溶解797.2mg重组蛋白质A(Repligen Corp.，Waltham，MA)制备溶液。向该溶液中加入112mL的缓冲液A。用高架的搅拌器搅拌混合物，加入11.44g干燥珠。连续搅拌15分钟，然后加入304mL缓冲液B，连续搅拌1小时。使用烧结玻璃漏斗过滤小珠。所述小珠返回到反应烧瓶中，加入pH为9.5的560mL的3.0M乙醇胺，搅拌所述混合物1小时。然后过滤所述珠，用pH 7.5的265mL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤3次，用pH 10.5的265mL 0.1M的碳酸钠缓冲液洗涤6次，用200mL PBS洗涤2次，用在2％乙酸中的160mL 2M胍洗涤3次，用200mL PBS洗涤3次，用265mL去离子水洗涤6次，然后贮藏在160mL 20％乙醇/去离子水中直到使用。
在另外的分级之后，获得包括每一mL水合珠体积有大约6.5-7.5mg结合蛋白质A的珠样品，尺寸注明在表4中。使用上面描述的方法试验装填蛋白质A的珠对于人IgG的捕获，结果见表5(实施例6)，表6(实施例7)和表7(实施例8)。总的俘获率(或者捕获生产量)是实施例6为40g/l/hr；对于实施例7为72g/l/hr，对于实施例8为125g/l/hr。通过对比，在该系统中使用60μm直径的蛋白质A粒子导致大约20g/l/hr的俘获率，十分类似于在标准大型色谱法柱中实现的生产能力。
表4
表5实施例6
表6实施例7
表7实施例8
实施例9通过在氮气清洗的密封小玻璃管中聚合所述单体制备与实施例2组成相同的整料。所述小瓶被放入33℃的水浴中过夜。破碎所述小瓶；所述整块填塞料用水和丙酮洗涤，用研钵和研棒轻轻磨碎，然后在真空下干燥。在去离子水中制造这些压碎粒子的浆料，填充到Bio-RadPoly-Prep柱中到1mL的床层深度。通过改造溶菌酶方法适应IgG，测量IgG的平衡阳离子交换容量，测得为35mg/ml。
这些压碎粒子的浆料填充到具有0.25μm玻璃料的0.35mL，3×50mm Omnifit柱中，使用AKTA Explorer色谱系统(GE Healthcare)测量人IgG的动力学结合容量。所述IgG荷载缓冲液是在50mM乙酸钠中的3.5mg/mL的IgG，80mM的氯化钠，pH 4.5。在300cm/hr和500cm/hr下，确定在10％穿透时的动力学载荷容量分别测得为20.8和15.3mg/mL。
实施例10与实施例9的整料组成相同的整料，不同之处用1.5mL的PEG 400取代1.5mL的异丙醇。所述过程和操作与实施例9相同。以实施例9描述的方式测量IgG的平衡阳离子交换容量，测得为23mg/mL。
实施例11与实施例9整料组成相同的的整料，不同之处用1.68mL的1-辛醇取代1.68mL的异丙醇作为成孔剂。所述过程和操作与实施例9相同。以实施例9描述的方式测量IgG的平衡阳离子交换容量，测得为30mg/mL。
实施例12通过在氮气清洗的Bio-Rad Poly-Prep柱中在室温下聚合1mL的单体混合物过夜，制备与实施例10整料组成相同的整料。向所述整块填塞料的顶部加入去离子水(10mL)，然而不流过所述柱。向所述柱顶部施加微小的氮气压力，但是仍然不发生流动。切掉包括玻璃料的柱的底部，但是仍然不发生流动。最后，以实施例9描述的方式压碎，洗涤和干燥所述整料。以实施例9描述的方式测量IgG的平衡阳离子交换容量，测得为31mg/mL。
实施例13-15
制备与实施例10整料组成相同的整料，不同之处为用等重量的丙烯酸正丁基酯代替5wt％的AMPS单体(实施例13)，用等重量的丙烯酸正丁基酯代替10wt％的AMPS单体(实施例14)，用等重量的丙烯酸正丁基酯代替15wt％的AMPS单体(实施例15)。所述过程和操作与实施例9相同。以实施例9描述的方式测量IgG的平衡阳离子交换容量，测得为24mg/mL(实施例13)，16mg/mL(实施例14)和5mg/mL(实施例15)。
权利要求
1.一种包括过滤元件的复合过滤介质，其包括至少一层多孔纤维性的过滤层，和至少一个能够与目标分子结合的固定相颗粒状物的层，所述固定颗粒状物选自平均直径小于50微米的粒子，柔软的聚合物粒子，和压碎的整块聚合物粒子。
2.权利要求1的复合过滤介质，其中所述的多孔纤维性的过滤层是平均标称孔径范围为1-50微米的纺织或者非纺织多孔材料。
3.权利要求1的复合过滤介质，其中所述的固定相颗粒状物选自能够通过吸附、离子交换、疏水性结合和亲和性结合进行结合的颗粒状物。
4.权利要求3的复合过滤介质，其中所述的离子交换颗粒状物选自阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。
5.权利要求3的复合过滤介质，其中所述的亲和色谱法固定相颗粒状物包含琼胶糖、纤维素、右旋糖酐和含有与目标分子有亲和性的配位体的乙烯基聚合物。
6.权利要求1的复合过滤介质，其中所述的固定相颗粒状物是平均粒子直径小于50微米的有机的或者无机的颗粒状物。
7.权利要求6的复合过滤介质，其中所述的固定相颗粒状物的平均粒度小于30微米。
8.权利要求6的复合过滤介质，其中所述粒子的尺寸的偏离系数大于30％。
9.权利要求1的复合过滤介质，其中所述的过滤元件包括上游表面和下游表面，所述的颗粒状物层布置在所述的上游表面上。
10.权利要求1的复合过滤介质，其中所述过滤元件的所述过滤介质是表面过滤介质。
11.权利要求1的复合过滤介质，其中所述过滤元件的所述过滤介质是深层过滤介质。
12.权利要求1的复合过滤介质，其中所述的压碎的整块颗粒状物的粒径分布为0.1-1000微米。
13.权利要求1的复合过滤介质，其中所述柔软的颗粒状物在施加50psi压力下经受至少10％的颗粒高径比变化。
14.权利要求13的复合过滤介质，其中所述柔软的颗粒状物的平均直径小于50微米。
15.权利要求14的复合过滤介质，其中所述柔软的颗粒状物的平均直径小于30微米。
16.一种包括过滤元件的过滤盒，包括权利要求1-15任一项的复合过滤介质。
17.一种用于大规模分离生物大分子的分离系统，包括权利要求16的过滤盒，含有包括至少一种目标生物大分子作为溶质的溶液混合物的储液槽，用于泵送所述溶液混合物通过所述过滤盒的机泵和相关配管，以将所述的至少一种生物大分子结合到所述固定相颗粒状物上从而形成目标分子固定相颗粒状物产物。
18.权利要求17的分离系统，其中所述系统能够在24小时内提纯至少100g目标生物大分子。
19.权利要求17的分离系统，其中所述的过滤盒是闭端过滤盒。
20.权利要求17的分离系统，其中所述的机泵和相关配管形成闭合环路组件，所述闭合环路组件提供循环泵送所述溶液混合物。
21.权利要求20的分离系统，进一步包括用于泵送洗脱溶液通过所述闭合环路组件的装置，所述的洗脱溶液能够使生物大分子固定相颗粒状物产物结合相互作用反转以便释放所述目标分子。
22.一种从溶液混合物中分离目标分子的方法，包括如下的步骤a)提供分离系统，包含包括权利要求1-15任一项的能够与目标分子结合的复合过滤介质的过滤盒，含有包括至少一种目标分子作为溶质的溶液混合物的储液槽，和机泵和相关配管，和b)在压力最多为50psi下将所述溶液混合物泵送通过所述过滤盒，以使所述的至少一种生物大分子与所述固定相颗粒状物结合以便形成目标分子固定相颗粒状物产物。
23.权利要求18的方法，其中所述的目标分子选自蛋白质、碳水化合物、脂质和核酸。
全文摘要
一种包括过滤元件的复合过滤介质，所述的过滤元件包括至少一个多孔纤维性的过滤层，和至少一个吸附固定相颗粒状物的层，所述的固定相颗粒状物选自平均直径小于50μm的有机的或者无机颗粒状物，柔软的颗粒状物和压碎的整块颗粒状物。所述颗粒状物能够与目标分子例如通过吸附，离子交换，疏水性结合和亲和性结合实现结合。与使用包含常规的生产规模色谱树脂颗粒状物的过滤介质实现的结合容量相比较，本发明的颗粒状物提供较高的结合容量。
文档编号B01J47/02GK101060924SQ200580039391
公开日2007年10月24日 申请日期2005年9月29日 优先权日2004年10月1日
发明者杰拉尔德·K·拉斯穆森, 安德鲁·W·拉宾斯, 詹姆斯·I·亨布里, 凯南·塞沙德里, 凯利·J·吉本斯, 中村雅之, 小罗伯特·T·菲茨西蒙斯, 西蒙·K·香农, 史蒂芬·B·罗斯科, 拉里·J·卡森 申请人:3M创新有限公司