使用具有两性离子固定相的hilic与质谱对甲基丙二酸和丁二酸的定量检测的制作方法

专利名称：使用具有两性离子固定相的hilic与质谱对甲基丙二酸和丁二酸的定量检测的制作方法
使用具有两性离子固定相的HILIC与质谱 对甲基丙二酸和丁二酸的定量检测
本发明涉及用于在大量样品中分析有机小分子的方法。具体而 言，本发明提供从诸如全血、血浆、血清和尿的生物基质中大规模 测定临床目标有机小分子曱基丙二酸、丁二酸并任选测定高半胱氨 酸的方法。
背景技术：
所有在本文中公开的参考文献均通过引用结合到本文中。 要求临床实验室所使用的分析技术具有快速、简单且稳定的性 能，除此之外还需具备灵敏性和选择性。大量的不同基质(即尿、血 浆、血清、全血等)中的样品需要各种各样的技术，基于这些技术可
常用的技术为酶联免疫吸附法(ELISA),该方法因易于自动化而得于 普及。然而，偶尔会由于交叉反应或缺少抗体而导致需要使用多种 ELISA试剂盒来监测样品中多种可能在临床上重要的化合物。这增 加了成本并降低了样品处理量。
因此，液相色i普(LC)并且尤其是高效液相色谱(HPLC)作为将混 合物分离为其各组分并定量测定各化合物的优异方法而倍受瞩目。 通过简单地选择流动相和固定相，HPLC能将脂溶性或水溶性物质分 离为其各组分而无需对所述物质进行任何预处理。然而，仅仅使用 例如紫外区吸收的常规参数，用于HPLC的传统纟佥测器系统对特定 化学结构不灵敏。例如，在测定UV吸收相对较低的化合物时，需要 柱前衍生步骤以获得保留时间、增强色谱分离选择性并获得对临床 相关浓缩物的足够高的灵敏度(Pastore A等，C7z'". Ozem. 44, 825-32,1998)。因此，质谱检测成为日益频繁使用的工具。US 4，298，795公 开了通过质谱法进行检测的HPLC系统。对质镨的"般性介绍以及 与液相色i普的联用可参见"Introduction to mass spectrometry(质i普介 绍)"(Watson, J. Throck, hj^zV7Co"函i ave" 尸w6fc/zer 出版4土 ， Philadelphia,第3版，1997),质谱电喷雾离子化原理描述于Ma^ S/ ec rame^720， 362-87, 2001， Nadja B. Chech和Christie G. Enke著。
含有HPLC和质谱(MS)检测联用的系统还被开发用于大量临床 样品的常规分析，可预期其将更多地用于临床实验室(Kinter M.， C7/w. CTzem., 50, 1500-2, 2004)。已将样品制备和才交正规程以及自动化程序 优化并用于HPLC-MS方法。MS技术的进步在MS仪器中产生了具 有高分辨率的高效仪器。事实上，在某些情况下，预先的色谱分离 已被省略并祐:认为不必要。
US 6,541,263描述了使用HPLC和质谱在人血浆中测定皮质类 固醇。HPLC和MS的联用使得可定量和定性地分析低浓度的结构类 似的化合物。然而，采用US 6，541，263的技术分析的所有化合物均 为非常大且疏水的物质。还需要分析在临床上重要的小的、极性的 和/或亲水的分子。
这种小的、极性的和/或亲水的分子在临床上重要的分析之典型 实例是对曱基丙二酸和丁二酸的定量分析，任选还对高半胱氨酸的 定量分析。曱基丙二酸(MMA)(以及高半胱氨酸)是B12缺乏的诊断 标记物，而常常干扰上述化合物定量分析的丁二酸是MMA在生理 学上的丰富的异构体。多年来，人们尝试了使用各种分析技术的不 同方法以达成快速、准确地定量测试MMA的目标，然而这是夂走劳 的。在这些技术中，MMA是在色语上与丁二酸良好地分离，而不是 在同 一 次分析中通过光谱数据的解巻积法(deconvolution)或使用高分 辨能力，即MS/MS检测系统来分离。
WO 03/079008公开了使用液相色谦和串联MS检测诸如MMA和丁二酸的小分子的方法。所述方法复杂、耗时，包括在测定前对 样品的衍生化以及在获得结果前的预先计算的步骤。
WO 2006/090428提供了用于分析小分子的反相方法。从其公开 的色镨图可知难以获得对MMA和丁二酸的良好分离。
因此，仍需要用于定性和/或定量地分析临床样品中的医学目标 有机小分子的改进方法。理想地，这种测定方法应快速、需要最少 量的样品预处理、易于自动化且结果应易于解释。

发明内容
本发明通过提供用于检测曱基丙二酸并任选同时检测高半胱氨 酸和丁二酸的方法解决上述对MMA快速、准确定量的问题，所述 方法涉及液相色谱分离步骤及其后续的质谱检测步骤，所述方法包 括以下步骤
a) 提供可包含曱基丙二酸和/或丁二酸并任选包含高半胱氨酸的 样品;
b) 将所述样品注入含有大量水混溶性有机溶剂的流动相；
c) 将包含所述样品的所述流动相A^液相色i普柱洗脱，所述液相 色i普柱包含共价键合至作为固定相的载体的两性离子基团；
d) 通过质谱检测可能存在的曱基丙二酸和/或丁二酸以及任选的 高半胱氨酸；以及
分子的量。
由于样品预处理规程已知，因此初始样品浓度可通过稀释因子 计算并且与临床或医学评价研究中的对象(患者)的其它观察相关。
优选水混溶性有机溶剂为乙腈。所述溶剂还可选自以下水溶性 溶剂曱醇、乙醇、丙醇、丙酮和THF或其混合物。优选乙腈。
此外，优选流动相由乙腈和水緩冲溶液(诸如盐、弱酸和弱碱的 水溶液)构成。緩冲物质优选诸如乙酸铵和曱酸铵的盐，还可使用诸如甲酸或乙酸的弱酸。在某些HILIC/MS应用中，可在水緩冲溶液中 包含氨和碳酸铵。所述水緩冲溶液具有微酸性至微碱性的pH,优选 为4.0-7.5,还优选为4.0-7.0，尤其为4.0-5.0,并且流动相的总离子 强度优选为5-60 mM。
此外，优选流动相的乙腈/水援沖溶液的组成为95/5-60/40，优 选85/15-65/35，并最优选80/20-65/35。
此外，还优选固定相的两性离子基团为CH^N^CH^-CHrCH^ CH2-SCV或-0画PO-3-CH2-CH2-N^CH2)3，优选CH2-N"(CH3)rCH2-CH2-CH2-S03-。实施本发明时可使用的固定相公开于US 2005/0064192 Al 和WO 00/27496。
已证明这些两性离子固定相对极性和亲水性化合物的分离的选 择性和适应性与固定相载体的化学或物理形式(format)无关。例如， 已显示在硅胶载体上使用两性离子固定相时，对流动相pH的改变可 用于优化对肽的分离选择性(P. J. Boersema， N. Divecha, A. J. R. Heck, S. Mohammed iVo&ome及es.， (2007),印刷中)，对于一系列聚甲基 丙烯酸酯基两性离子整体柱(zwitterionic monolith)上的苯甲酸也有类 〗以的方式(Z. Jiang, N.W. Smith, P.D. Ferguson和M.R. Taylor,爿"a/, C7z麼79, 1243-1250, 2007)。在这些研究中，影响均非来自于载体材 料，而是来自于同时影响容量因子和选择性的分析物的解离和相应 的亲水性变化。在最近的关于HILIC的综述中讨论了固定相功能基 团和载体的影响(p. Hemstr&n, K. Irgum / 6W., 29, 1784-1821, 2006)。
适合于本发明的载体的实例有多孔硅胶、锆、石墨和聚合物或 共聚物初啡+，其形状为大小为1-30 pm、优选为3.5-10 pm并且孔隙 为50-300 A的球形颗粒，或者为所述材料的整体柱结构，或者任选 为窄内径毛细管的内壁。
合成或天然来源的聚合物或共聚物载体可含有单乙烯基或低聚 乙烯基单体单元，诸如苯乙烯及其取代衍生物、丙烯酸或曱基丙烯酸、丙烯酸烷基酯和曱基丙烯酸烷基酯、丙烯酸羟烷基酯和曱基丙 烯酸羟烷基酯、丙烯酰胺和曱基丙烯酰胺、乙烯吡啶及其取代衍生 物、二乙烯基苯、二乙烯吡啶、亚烷基二丙烯酸酯、亚烷基二甲基 丙烯酸酯、最多具有5个乙二醇重复单元的寡聚乙二醇二丙烯酸酯 和寡聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、亚烷基双(丙烯酰胺)、哌啶双(丙烯 酰胺)、三曱氧基丙烷三丙烯酸酯、三甲氧基丙烷三曱基丙烯酸酯、
季戊四醇三丙烯酸酯和季戊四醇四丙烯酸酯，和它们的混合物。
在优选的实施方式中，两性离子功能配体通过接枝聚合结合至 所述载体、通过多步反应将两性离子单体或两性离子配体附着至所 述载体表面或通过将所述单体或配体和交联单体和稀释剂共聚形成
包含两性离子功能基团的整体柱载体(monolkh carrier)。
尤其有利的是应用所述方法定量或定性测定临床样品中的曱基 丙二酸、任选还测定高半胱氨酸和丁二酸。这种临床样品优选体 液，诸如尿、血、血浆、血清和脑脊液。将所述临床样品与乙腈混 合以使可包含于所述样品中的蛋白质沉淀。在去除沉淀的蛋白质 后，可将残留的上清液直接注入流动相并洗脱。


参照附图进一步描述本发明，其中
图1显示MMA、 丁二酸和高半胱氨酸的结构；
图2显示ZIC-HILIC柱的两性离子甜菜碱功能基团；
图3 a-c提供说明在氖代MMA内标的存在下，从分别掺入了 a)
50、 b) 476和c) 1000 nM MMA的人血浆样品中分离MMA的色i普
图，使用与单离子监测负离子电喷雾MS联用的fflLIC;
图4提供Ajk浆样品中MMA的校正曲线，所述人血浆样品中
掺入了 50-1000 nM中六个彼此独立浓度的MMA;
图5提供人血浆样品中MMA的校正曲线，所述人血浆样品中
掺入了 50-200,000 nM中13个4皮此独立浓度的MMA;和
8图6显示高半胱氨酸、曱基丙二酸和丁二酸的完全基线HILIC 分离的色谱图，分别采用UV (a)检测和MS (b)检测。这些实验所使 用的实验条件与用于优化的MMA定量分析的那些不同，并且例示 了获得在临床样品中定量或定性测定曱基丙二酸与高半胱氨酸和丁 二酸的可能性。
发明详述
本发明提供对反相HPLC方法和/^知的标准-HPLC和质谱的联 用的可行替代方案，即亲水性相互作用液相色谱(fflLIC)与质谱;险测 联用。HILIC是适用于极性和亲水化合物的分离技术，并且采用包含 高含量的(40-99% v/v)水混溶性有机溶剂(乙腈、丙醇、乙醇、曱醇、 THF 、丙酮)的洗脱液以提高分析物和亲水固定相间的亲水性相互作 用。通常发现fflLIC所使用的流动相良好地适用于ESI-MS检测 (Guo Y., Gaiki S., / 」，1074, 71-80, 2005),而且与反相方
法相比，常常改进检测极限，尤其是当分析亲水化合物时和当最终 流动相緩冲盐浓度可保持在合理的浓度水平，通常低于50 mM时更 是^口 jt匕(Bengtsson J., Jansson B., Hammarlund-Udenaes M.,及^^W Cowm頭.Mws 第19巻(2005), 2116-2122)。尽管有其它
市售HILIC固定相，但都不能真正媲美WO00/27496 Al和US 2005/0064192 Al所公开的固定相。这种固定相以注册商标ZIC -HILIC和ZIC -pHILIC相出售(SeQuant AB,瑞典)。包含这些高极性 两性离子固定相的色镨柱提供可显著溶剂化极性和荷电化合物的独 特环境，所述色谱柱使得高效HILIC分离成为可能。所述两性离子 固定相(图2)可通过弱静电相互作用与荷电分析物相互作用，在实践 中，这在方法开发中选择緩冲盐和离子强度时为色谱法提供更高的 自由度，因此使所述色谱柱成为用于LC-MS分析的理想选择。本专 利申请显示了当将有效的分离和灵敏的检测方法联用时的优势，并 通过可从临床样品中的丁二酸和高半胱氨酸中分辨出甲基丙二酸的
9等度HILIC分离作为例示。
ZIC -fflLIC柱(SeQuant AB，瑞典)为粒度为3.5、 5或10 pm的 硅月交基固定相，而ZIC -pfflLIC柱(SeQuant AB,瑞典)是粒度为5 lim的聚合物基固定相，但是均具有磺基甜菜碱型两性离子功能团。
实施例1
实验部分 试剂和药品
乙腈(HPLC纯)和分析纯的乙酸铵均购自默克(Darmstadt，德 国)，而曱酸(°/。， p.a.)购自JTBAKER(Deventer，荷兰)。所有的水均经 Milli-Q水纯化系统(Millipore, Bedford, MA)纯化。血浆蛋白质沉淀 (PPT)溶液通过如下方法制备加入25 mL乙腈，随后加入250 mL 浓乙酸和43 mL 196.5 mmol氘代曱基丙二酸(d3-MMA)储备液至50 mL容量瓶，再加入乙腈至刻度线。该PPT溶液包含99.5%体积乙 腈、0.5%体积乙酸和169 nM浓度的d3-MMA。
蛋白质沉淀和血浆样品净化
使用HILIC技术可实施非常有效且直接的临床样品的样品预处 理。由于乙腈在HILIC中是弱溶剂，可在乙腈中沉淀千扰血浆蛋白 质。首先将PPT溶液(0.80mL)移液至2mL玻璃自动进样瓶，然后加 入人血浆(0,20mL)并用惰性瓶帽封盖样品瓶。然后，将所有样品置 于定轨摇床上(Janke&Kunkel， Typ Vx8)(或具有类似功能的其它装置)5 分钟以达到充分的混合。在血浆蛋白质沉淀步骤之后、将样品瓶转 移至Hettich Zentrifligen Rotana 460R离心机(或具有类似功能的其它 装置)，15。C下以6200 rpm离心10分钟，随后进行分析。为测定分 冲斤回收率，在蛋白质沉淀之前和之后加入已知量的MMA和MMA-d3。
色镨系统色谱系统包含安捷仑1100(Agilent IIOO)分离模块，所述模块以 0.4 mL/min的流速输送包含乙腈和pH 4.7的100 mM乙酸铵水緩沖 液(80:20 v/v)的流动相。〗吏用安捷仑1100自动进样器将标准品、经 掺杂的样品、对照品和人类患者样品(4 iiL)进样至长100 mm、内径 2.1 mm的具有3.5 ^M颗粒的ZIC -HILIC分离柱，该柱置于设置在 30。C的安捷仑1100柱箱中。如下进行定量分析在安捷仑1100质 谱上，使用负离子模式ESI的单离子监观'J(m/z 117.2和120.2),并施 加设置为10 L/min的干燥气流，气体温度300°C,并将毛细管电压 设置为3.0 KV。所有色语图均记录于安捷仑Chemstation工作站。
在以两性离子固定相上的HILIC模式分离后，使用负离子ESI MS 检测定量分析人血浆样品中的曱基丙二酸(MMA)
使用标准溶液、经掺杂的血浆样品以及人类患者样品，获得针 对MMA的重复性、重现性、精确、线性、LOD等分析数据，这些 工作全部在它处写明。针对采用同位素标记内标的生物样品，开发 了用于样品后处理，随后进行负离子ESI-MS单离子监测的的简单、 耐用(ragged)且有效的定量分析方法。以当前的系统设置获得了优异 的灵敏度和充分的线性0*2>0.998),并且其中，MMA的LOQ约为10 nM且标准溶液的LOD小于5 nM。由于MMA的内源性水平在140-500 nM之间，我们所提出的经过稀释/蛋白质沉淀的取样步骤将稀释 样品4次，以达到目标水平。
结果
图3 a-c显示了表明将MMA从分别掺入了 a) 50、 b) 476和c) 1000 nM MMA的人血浆样品中分离的色语图。所有的样品中均添加 了氖标记的内标(MMA-d3)，参见图3a-c中下方的色谱图。在具有 3.5 ^M颗粒的100x2.1 mm ZIC-HILIC柱上进行所有的分离，在安捷 仑1100质谱仪中，使用负离子模式ESI的单离子监观'J(m/z 117.2和120.2),进行检测。
图4显示了人血浆样品中的MMA的校正曲线，所iiA血浆样 品中4參入了 50-1000 nM中6个彼此独立浓度的MMA。向所有样品 添加定量的d内标(MMA-d3)并且标绘MMA和MMA-d3之间的面 :伊、响应比。
图5显示了人血浆样品中的MMA的校正曲线，所i^A血浆样 品中掺入了 50-200,000 nM中13个彼此独立浓度的MMA。向所有 样品添加定量的d内标(MMA-d3)并且标绘MMA和MMA-d3之间 的面积响应比。
实施例2 实验条件
色谱柱
UV
柱温
流动相
流速 检测器 进样量 MS 柱温
流动相
流速 分流 检测器 毛细管电压
碎裂电压
12
ZIC -HtLIC 50 x 4.6 mm, 5 |im RT
乙腈/乙酸铵(pH 6.8,最终溶液中为30 mM); 70/30 (v/v) 1.5 mL/min
波长为206 nm (UFS 1.0 V)的UV 5pL流动相中的测试溶液
30oC
乙腈/乙酸铵(pH 6.8，最终溶液中为25 mM); 75/25 (v/v) 1,0 mL/min
100 jiL/min至MS
Agilent 1100台式MS,正离子模式ESI 3000 V 150 V(Fragmentor):
质量范围 50-200 m/z
进样量 5 (iL 0.1 mg/mL流动相溶液中的各化合
物
样品 以洗脱顺序将高半胱氨酸、曱基丙二酸
和丁二酸溶解于流动相。
方法开发通常使用UV检测器进行，因为它易于使用且耐用， 但是该方法常常缺乏允许在相关生理水平进行定量分析所需的灵敏 度。此处，显示出暂时的最佳分离条件可通过UV检测建立，图 6(a),然后筒单地转化并轻微地修改以更好的适用于MS检测而获得 灵敏度。对所有化合物的基线分离可在卯秒内完成，并且化合物以 介于1.4和3之间的k，流出。值得注意的是高半胱氨酸和曱基丙二酸 之间的基线下降。产生该现象的主要原因是低检测波长与样品和流 动相之间细微的緩冲液浓度不匹配的组合所致。通过降低流速和流 动相中水的比例(从30%体积降低至25%体积)并且稍卩微地减小离子强 度，使所述方法适应LC-MS仪器并获得充分的分离效率，如图6(b) 所示。使用暂时的MS兼容条件，可测定生物样品中的曱基丙二酸以 及高半胱氨酸和丁二酸，但它们不为临床相关浓度水平。因此，图6 显示了对高半胱氨酸、曱基丙二酸和丁二酸分离，随后分别通过UV (a)和MS (b)检测。然而，在这些实验中所使用的实验条件与用于最 佳的MM A定量的那些不同。
ZIC -fflLIC柱的确是分离曱基丙二酸和丁二酸的合适工具。与 相对便宜且简单的MS检测设备组合，可容易地以多达每小时20个 样品的处理能力对生物相关浓度进行定量分析。
权利要求
1.用于在还可包含丁二酸和/或高半胱氨酸的临床样品中定性和/或定量检测甲基丙二酸的方法，所述方法涉及液相色谱分离步骤及其后续的质谱检测步骤，所述方法包括如下步骤a)提供可包含甲基丙二酸和/或丁二酸并任选包含高半胱氨酸的样品；b)将所述样品注入含有大量水混溶性有机溶剂的流动相；c)将包含所述样品的所述流动相从液相色谱柱洗脱，所述色谱柱包含共价键合至作为固定相的载体的两性离子基团；d)通过质谱检测在所述样品中检测可能存在的甲基丙二酸和丁二酸以及任选的高半胱氨酸；以及e)使用校正数据确定所述有机分子的存在并任选确定所述有机分子的量。
2. 权利要求1的方法，其特征在于，所述水混溶性有机溶剂为 乙腈或任选选自以下的水溶性溶剂曱醇、乙醇、丙醇、丙酮和 THF或其混合物。
3. 权利要求2的方法，其特征在于，所述流动相为乙腈和水緩 冲溶液的混合物，所述水緩冲溶液具有微酸性至孩i碱性的pH,优选 为4.0-7.5,更优选为4.0-7.0,尤其为4.0-5.0,并且所述流动相的总 离子强度为5-60 mM。
4. 权利要求3的方法，其特征在于，所述水緩冲溶液是选自乙 酸铵、曱酸铵、曱酸、乙酸、氨水和碳酸铵的水溶液。
5. 权利要求3或4的方法，其特征在于，所述流动相的组成为 95/5-60/40,优选85/15-65/35,最优选80/20-65/35的乙腈/盐的水溶 液。
6. 权利要求1的方法，其特征在于，所述固定相的两性离子基 团为CH2-N^CH3)2-CHrCH2-CH2-S03-或-0-POVCH2-CH2-N""(CH2)3,优选CH2-^T(CH3)2-CH2-CH2-CH2-S03-。
7. 权利要求6的方法，其特征在于，所述两性离子基团键合至 硅胶颗粒、或聚合物颗粒、或硅胶或聚合物的整体柱结构(monolithic structure)-
8. 权利要求7的方法，其特征在于，所述颗粒的粒度为1-30 (im,优选3.5-10,。
9. 权利要求1的方法，其特征在于，所述样品为诸如血浆、全 血、血清、尿和脑脊液的临床样品，并且将所述样品与乙腈混合从 而沉淀所迷样品中的蛋白质，将所述沉淀的蛋白质从所述样品除 去，不经任何进一步的预处理而将除去所述沉淀的蛋白质后剩下的 上清液直接注射进样至流动相。
全文摘要
本发明提供用于在还可含有丁二酸和高半胱氨酸的临床样品中定性和定量地检测甲基丙二酸的方法，所述方法涉及液相色谱分离步骤及其后续的质谱检测步骤，所述方法包括如下步骤a)提供可包含甲基丙二酸和/或丁二酸并任选包含高半胱氨酸的样品；b)将所述样品注入含有大量水混溶性有机溶剂的流动相；c)将包含所述样品的所述流动相从液相色谱柱洗脱，所述色谱柱包含共价键合至作为固定相的载体的两性离子基团；d)通过质谱检测在所述样品中检测可能存在的甲基丙二酸和丁二酸以及任选的高半胱氨酸；以及e)使用校正数据确定所述有机分子的存在并任选确定所述有机分子的量。
文档编号B01D15/36GK101680904SQ200880005968
公开日2010年3月24日 申请日期2008年2月25日 优先权日2007年2月23日
发明者P·阿佩尔布拉德 申请人:默克专利股份公司