用于dna提取、扩增和分析的微流体设备和方法

专利名称：用于dna提取、扩增和分析的微流体设备和方法
技术领域：
本发明涉及微流体样品处理装置、方法和系统。更特别地，本发明涉及具有带被凝胶支持的样品和试剂的微通道的微流体样品处理装置，以及使用微流体样品处理装置的完全集成的便携式DNA分析器。现有技术的微流体装置有时也被称为“芯片实验室(lab-on-chip) ”或“微全分析系统”，通常包括基底以及诸如微通道和口的微结构。这样的微流体装置的使用允许使用专用的微通道，专用的微通道的特征是多层例如硅、玻璃和聚合物的材料，因此允许缩小标准尺寸的设备，使其可以被容易携带。与标准尺寸的相同类型的装置相比，这样的微流体装置具有各种优点，包括以下事实仅需要十分少量的样品和试剂，所需要的分析时间更短，并且在其中进行的测试的灵敏度高于在它们的标准尺寸的同类产品中进行的测试。此外，更易于可能减少潜在的污染以及可携带性更强以便到达进行现场分析的现场。诸如DNA指纹识别的方法通常会耗费约一天或在某些情况下长达一周，并且使用许多不同的装置来完成程序。因此，难以在犯罪发生后不久就利用DNA迅速得到如犯罪嫌疑犯的候选名单。然而，存在可以在这样的现有技术微流体装置中进行的各种操作，例如化学反应、合成、纯化、提取、制作和/或分析。因此，这些操作可以在许多分析领域和诊断领域中获得广泛应用，例如DNA指纹识别、基因分析、临床诊断、药物筛选和环境监测。与微流体装置相关的制造方法提供了开发新颖的研究工具的吸引人的途径，因为它们引入了将不同的过程集成到一个装置中的可能性，这进而可以导致提高分析测量的可靠性的自动化系统。然而，在某些情况下，由于与不需要将装置耦合于诸如泵的辅助设备而将不连续量的样品从装置的一个区域成功输送至另一个区域相关的高度复杂性，因而已经证明难以进行集成。现有技术的微流体装置或利用了这些微流体装置的系统通常全部需要外部的流体动力泵送，除了电泳分离以外，这可能是一种操作数微升流体的非常低效的方法，因为其需要过度的死体积。此外，现有技术装置通常包括基于溶液的技术，并且因此难以按照将提供对样品的稳定的电动力控制的方式来在微流体装置内制备和储存试剂，尤其是如果例如气泡进入系统或溶液干燥的话。特别地，已经证明使用实际的输送机构来组合在单一芯片模块上以便从组织进行 DNA提取和纯化、DNA扩增、样品分离和检测，使得各步骤可以由微流体连通的部件以连续方式施行的实际装置难以有效地制造和操作。有效且一致地定位不同的试剂，有效地设置用于接收实际的溶解的组织样品的界面以及用于将所提取的样品恒定地输送通过芯片的有效的输送机构都具有特定的困难。例如，WO 99/64848描述了部分集成的微流体装置。通过电动力迁移率(电渗透) 来在液体中进行运动并且特征是以电动力方式注入到进行电泳分离的凝胶中。检测通过荧光进行并且基于顺序的施用。然而，DNA提取和纯化仍然在芯片外进行。US2003/190608描述了其中具有优良的DNA/RNA序列的珠被容纳在凝胶中并且以流体动力方式将样品泵送通过凝胶的系统。描述了包括热扩增的混合过程，但是使用泵经由储器来添加试剂，而不是将试剂定位在装置内。荧光检测在芯片上进行，但是未描述分离或对于此特定应用来说不需要分离。此外，DNA提取又是在芯片外进行。US2005/161327是基于介电泳泵送而不是电动力泵送的装置。样品制备在装置外进行，试剂加入也在装置外进行，并且整个过程是基于溶液的。没有描述分离过程。W02007/133710描述了基于塞或微滴的溶液处理，并且主要集中于微滴操作过程， 例如混合和分离。试剂并未被保持在装置上。与将提取、扩增以及分离和检测集成在单一装置内相关的其中一个主要问题是集成损害了单个过程的已知的操作条件。重新优化操作条件是难以实现的，这是因为系统必须作为独立的复杂过程进行操作，在该过程中，单个过程之间的相互作用应是协调的。由于这些原因和其他原因，已经证明难以获得在单一的芯片上进行提取和纯化、 扩增、样品分离和检测的有效的微流体装置。发明概述根据本发明，提供了基于凝胶的整体式微流体样品处理装置，包括基底，基底具有多个微通道，以形成至少一个DNA提取室，所述至少一个DNA提取室与扩增室流体配合，扩增室进而与分离和检测通道流体配合；所述微通道容纳DNA提取材料和对于处理所述样品来说所必需的基于凝胶的试剂；装置还包括电接触(electrical contact)，电接触用于耦合至外部电源并且能够引起对整个装置中的所述基于凝胶的试剂和从所述样品提取的DNA 的电动力操作。对于术语“基于凝胶的试剂”，其意指用于纯化和洗脱所提取的DNA样品以及支持 PCR反应的试剂被支持在微流体装置内的凝胶基质中。用于微流体装置的基底优选由惰性不导电的且优选光学透明的材料形成，所述材料例如玻璃或其他相似的物质或材料。基底通常被盖密封以用于包封界定在其内的内部微通道。盖可以通过任何合适的方式被附接或结合于基底。该装置可以具有由被放置入其中的分析器决定的尺寸。可选择地，尺寸在120mm 乘60mm的区域中，但是高至120mm或更高乘高至60mm或更高的其他尺寸也可以是合适的。 优选具有小尺度的装置，使得装置适合于在便携式系统中使用。此外，这样的装置可以被容易地制造。DNA提取室可以包括用于将溶解的样品引入DNA提取室中的工具，例如包括入口。 便利地，所述工具包括样品接收工具或与样品接收工具流体连通。样品接收工具可以适合于提供将溶解的样品直接引入到DNA提取室中。在优选的实施方案中，样品可以被接收在包括与溶解剂混合的DNA材料的DNA提取室中。因此，样品接收工具可以适合于提供未溶解的组织样品的接收、未溶解的组织样品的溶解以及溶解的样品引入到DNA提取室中。例如， 样品接收工具可以包括吸收性构件，吸收性构件用于在使用中接收组织样品，预装载溶解剂以及在使用中适合于被放置为与DNA提取室引入口流体连通，以在被如此放置时向DNA 提取室引入口中接收、溶解和引入溶解的样品。合适的溶解剂是离液盐溶液。合适的离液盐是盐酸胍，正如除了溶解组织样品外，这样的盐促进DNA随后结合至DNA提取材料(如下文讨论的)并且使脱氧核糖核酸酶(DNase)失活，否则脱氧核糖核酸酶(DNase)将继续酶促消化所提取的DNA。
DNA提取材料可以能够截留DNA，允许溶解的样品的剩余的体积经过材料，或其可以能够截留溶解的样品的主要体积，允许DNA经过材料。优选地，DNA提取材料被加装以允许在其中截留DNA，并且位于DNA提取室中。更优选地，DNA提取材料是多孔固相提取材料。 固相提取(SPE)能够预浓缩样品并除去可能干扰下游的应用，例如聚合酶链反应(PCR)，的潜在污染物。此外，SPE还允许DNA的预浓缩，这在处理有限的样品时是重要的。还更优选地，DNA提取材料是基于二氧化硅的提取材料并且例如二氧化硅珠，或更优选地是基于二氧化硅的单块。基于二氧化硅的提取材料，例如基于二氧化硅的单块，是优选的，因为其不仅从溶解的样品提取DNA而且作为用于电渗透流动(EOF)的泵，由此提高了提取步骤的效率，如下文更详细讨论的。如果DNA提取材料是带负电荷的，如在基于二氧化硅的单块中，那么离液剂 (chaotropic agent)，例如离液盐溶液的存在，无论是在芯片上进行溶解时作为溶解剂，或在芯片外进行溶解时被预装载入装置的有关通道中，都促进溶解的样品中存在的DNA结合至DNA提取材料。这是因为离液剂具有高离子强度并且因此能够减少提取材料的表面处的负电势。这允许DNA和提取材料表面的脱水以及在DNA/提取材料接触层内的分子内氢键的形成成为占优势的，由此增强DNA结合至提取材料。此外，离液剂通过螯合水分子形成水合离子，减轻DNA和提取材料表面的溶剂化。此外，离液剂使DNA变性，允许单链(SS)DNA 分子的暴露碱基与提取材料的表面以氢键键合。在本发明的优选的实施方案中，如果组织样品的溶解在装置上进行，那么溶解剂还可以包括载体分子，例如核糖核酸(RNA)。这样的载体RNA的使用具有对提高DNA提取效率的更大的影响，特别是在样品中存在较低量的DNA时。认为在提取材料例如基于二氧化硅的单块上，总是有某些部位将不可逆地结合核酸。通过在溶解剂中包括载体RNA，其可以牺牲性地与这些部位结合，以使重要DNA的损失最少，这导致更大的回收率。基于二氧化硅的单块优选被热活化或光引发。二氧化硅单块的热活化相比于光引发是优选的，因为其提供特别的优点，例如容易使用、生产的速度、可重复性以及在所制造的微流体装置上的精确定位。单块通常是多孔的并且能够经过单块内或毗邻单块的引入口接受溶解的样品。优选地，DNA提取室还包括洗涤入口和与洗涤入口流体连接的洗涤出口。在优选的实施方案中，DNA提取室还包括通道，通道容纳被支持在凝胶中的洗脱剂，一旦DNA被洗涤后，洗脱剂能够将DNA从DNA提取材料洗脱。优选地，洗脱凝胶含有低离子强度的缓冲剂， 例如水。装置还包括多个另外的通道、入口和出口，多个另外的通道、入口和出口被设置用于引入到装置周围或在装置周围运动或除去试剂或废物。优选地，至少一个DNA提取室、扩增室以及分离和检测通道中的每个中的基于凝胶的试剂与在其中发生的过程的性质有关。这样的基于凝胶的试剂可以，如果期望的话，根据它们在装置中原位形成基质的能力被选择。适合于基于凝胶的电泳并且特别地适合于它们在装置中原位形成基质的能力的已知凝胶包括基于线性多糖的那些凝胶。凝胶优选包含至少一种线性多糖，所述线性多糖可以任选地与其他线性多糖和/或至少一种非线性多糖混合。基于琼脂糖的凝胶是特别合适的。因此，至少一种线性多糖优选包括琼脂糖，并且在某些实施方案中琼脂糖可以是占大部分的或仅存在形成凝胶的材料。
优选的用于电泳分离的凝胶可以是基于聚环氧乙烷(PEO)或线性聚丙烯酰胺 (LPA)。这样的凝胶中存在的聚合物的程度允许实现受控的流动，使得凝胶在被注入分离通道中之后被定位在分离通道中。优选地，聚合物的程度是分离凝胶媒介物的3wt%至 7wt%，因为这些聚合物水平能够形成聚合物基质，以使PCR扩增产物阻滞并且允许成功的分离。因此，基于凝胶的试剂的使用能够使不同的过程试剂以精确的定位固定在根据本发明制造的微流体装置上。所有阶段，即从溶解的样品提取DNA、DNA扩增(例如使用聚合酶链反应(PCR))、分离和检测可以通过与根据本发明的微流体装置微流体连通的部件以连续定位的方式被进行。具体来说，通过从溶解的样品提取DNA的提取室为其中提取、扩增、 分离和检测的所有阶段都可以在单一的装置上以连续定位的方式进行的微流体装置提供更有效的实际界面。基于凝胶的试剂还可以含有光学探针，光学探针可以附接于被选择的DNA片段， 因此它们可以在分离过程期间被检测到。光学探针可以能够反射或吸收照射至它们所附接于的DNA片段的光，或它们可以能够发射光。优选地，光学探针是荧光染料或化学发光染料。更优选地，光学探针是附接于DNA片段的5'端的荧光染料并且在扩增期间被结合入 PCR产物中。合适的探针包括以下荧光染料中的一种或多种5-羧基荧光素(FAM)、5' -二氯-二甲氧基-荧光素(JOE)、四甲基若丹明(TAMRA)和羧基-X-若丹明(R0X)。如本文所使用的，分离应当因此被宽泛地解释为包括可选择性地区分扩增产物的 DNA片段以便进行检测的所有机理，包括光学分离，例如通过光致发光技术，例如使用荧光染料或化学发光染料的那些，无论是否通过DNA片段的空间和/或时间的物理分离和/或通过与多重试剂一起使用来平行地多次分离DNA片段进行补充。发生这样的光学分离是因为所采用的荧光染料以不同的特征波长发射。因此，即使荧光染料同时存在，即在分离和检测通道中的相同位置中时，标准分光计也可以区分所存在的单独的探针并且因此检测被引入到装置中的DNA样品的特征曲线。装置包括多个电极，以电动力操作装置中所有基于凝胶的试剂和从样品提取的 DNA和PCR产物；所述电极在一端可密封地连接于装置，另一端可连接于电源。术语“电动力地”包括电泳、电渗透流动以及将对于本领域的技术人员来说明显的任何其他电操作的方式。在优选的操作模式中，所提取的DNA在后续的阶段中被操作，直到其通过电渗透到达扩增室。然后，电泳是通常优选的。根据本发明的进一步的方面，提供了用于分析生物样品中的DNA的的便携的整体式系统，包括用于对从所述样品产生的DNA片段进行提取、纯化、扩增、分离和分析的电动力驱动系统，所述系统还包括基于凝胶的微流体样品处理装置，基于凝胶的微流体样品处理装置包括基底，基底具有多个微通道，以形成至少一个DNA提取室，所述至少一个DNA提取室与扩增室流体配合，扩增室进而与分离和检测通道流体配合，多个电极被定位在微流体装置内并且耦合于电源，多个电极被配置为电动力操作微流体装置周围的基于凝胶的试剂以及DNA和DNA片段，其中微流体装置适于经过DNA提取室接收样品；系统还包括耦合于或毗邻微流体样品处理装置的加热元件；被定位为通过可检测信号检测DNA片段的检测器；以及被配置为容纳微流体装置、电动力驱动系统、检测器和电源的便携的壳体。
加热元件可以包括用于实现DNA片段的热循环的任何合适的工具并且可以包括特定的冷却元件。加热元件可以是接触式或非接触式加热元件。普遍使用的接触式加热元件包括块加热器，例如珀尔帖加热器，或沉积在微流体装置外部上的薄膜电阻加热器，例如钼。虽然珀尔帖加热器由于产生可靠的热而被广泛地用于实现DNA扩增的热循环，但是它们存在相对慢的温度上升速率的不足。被描述用于在微流体系统中进行DNA扩增的非接触式加热方法包括使用红外线灯以及卤素灯、感应加热以及被交流电诱导的焦耳加热。在优选的情况下，加热元件包括微波辐射的源。本发明的本方面的整体式系统典型地利用本发明的第一方面的微流体样品处理装置，并且系统的优选的特征将通过类比被理解。在本发明的又一个方面，提供了分析DNA的方法，包括a)将样品引入位于分析器系统中的基于凝胶的微流体样品处理装置的DNA提取
室中； b)在DNA提取室内对样品进行电动力操作，以洗涤和纯化DNA ；c)将DNA提取室中的DNA洗脱至扩增室；d)在扩增室中扩增DNA片段，以在凝胶内形成扩增产物(DNA片段)；e)将所述扩增产物电动力注入分离通道中；以及f)对所述扩增产物进行电动力分离，以形成DNA特征曲线(DNA profile)。优选地，样品在被引入装置的DNA提取室中之前被溶解。在方法的一个实施方案中，样品在被引入装置中之前被溶解。可以引入包括与离液盐混合的DNA的溶解的样品，例如作为溶液。例如，离液盐溶液中的溶解的样品被手动地装载至垂直于洗涤和洗脱溶液的后续的流的提取材料结构例如二氧化硅单块上。在方法的另一个实施方案中，样品溶解步骤在装置旁或在装置上进行。例如，样品可以通过以下的步骤被引入提供装载有溶解剂的吸收性构件；向吸收性构件上施用未溶解的生物样品；将吸收性构件施用在和/或保留在与DNA提取室流体连通的样品接收部位处，以向DNA提取室中引入溶解的样品。DNA提取室容纳DNA提取材料。当DNA提取材料能够截留溶解的样品的剩余的体积且允许DNA片段经过材料时，DNA的提取和洗脱可以在一个步骤中进行。可选择地，如果 DNA提取材料能够截留DNA片段，那么DNA片段的洗脱将在与提取分开的步骤中进行。DNA提取材料的优选的特征在上文提出。特别地，DNA提取材料优选是带电的。更优选地，DNA提取材料是固相提取材料。还更优选地，DNA提取材料是基于二氧化硅的提取材料，并且，例如，包含至少一个二氧化硅珠或更优选地包含基于二氧化硅的单块。溶解的样品可以通过电动力操作试剂从DNA提取室的洗涤入口至DNA提取室的洗涤出口被洗涤。在本发明的优选的实施方案中，在装置的DNA提取室内电动力操作洗涤试剂通过电渗透操作来进行。如上文所述的，基于二氧化硅的提取材料的使用是优选的，因为其可以作为用于电渗透流动(EOF)的泵，由此增强来自溶解的样品的DNA的提取和洗涤步骤。这适用于任何带负电荷的提取材料，并且是基于二氧化硅的提取材料的与例如仅通道的表面积相比的更大的表面积的结果。EOF是表面效应，并且因此增加的表面积提供增加的泵支持。此外， 这样的提取材料作为约束样品的由于在材料内的具有对水力压力流的高毛细血管阻力的小气孔的存在导致的水力阻力的水力回流的单向阀。对回流的防止是非常重要的，因为如果没有回流控制，那么样品的运动迅速减弱，因为由于水力压力不同，回流迅速抵消向前的 EOF。在本发明的一个优选的实施方案中，将DNA提取室中的DNA洗脱至扩增室通过电动力操作来进行。电渗透操作在步骤b)和c)中是优选的，因为其将影响样品经过凝胶和DNA提取材料以从溶解的样品提取DNA并且将DNA传递至扩增室的整体运动。本发明的本方面的方法典型地利用本发明的第一方面或第二方面的微流体样品处理装置或整体式系统，并且系统的优选的特征将通过类比被理解。优选地，从样品提取的DNA的为了形成DNA片段的扩增通过聚合酶链反应(PCR) 进行。扩增产物的为了形成DNA特征曲线的电动力注入和分离可以通过电泳进行。电泳分离是优选的方法，因为其涉及离子在电场中的位移，由此影响DNA片段的为了得到DNA特征曲线的分离(典型地基于片段的尺寸)。方法可以还包括检测由电动力分离产生的DNA特征曲线的步骤。然后，通过检测 DNA特征曲线产生的检测信号可以被传递至输出工具，使得特征曲线可以被图形地察看。此外，方法可以包括以下步骤将所产生的特征曲线与已知的特征曲线，例如在英国国家法医科学服务处(UK National Forensics Science Service)内保存的DNA数据库或相似的数据库中保存的那些比较。虽然本发明意在具有在法医领域中的特别的应用，例如用于在犯罪现场使用，但是也设想其他的应用，例如与食品可靠性相关联的遗传特性的测定、亲子案件、细菌/病毒感染以及菌种识别以及基于DNA的安全标记。根据本发明的完全整体式的便携式DNA分析器允许在例如“犯罪现场”取得的DNA 样品的处理就地地在约一个小时内经受DNA指纹识别，并且有减少的或没有污染问题。通过其诊断和分析过程的流程，这是可能的。诊断和分析过程的速度也使这样的装置适合于在许多其他的“现场分析”是关键的情况下使用，例如在拘留室中以及在机场安全保卫设施中。特别地，使用这样的分析器的DNA分析是成功的，因为细胞收集在微流体装置的外部， 而DNA提取、DNA片段的扩增以及扩增产物的分离，以及在可选择的情况下还有样品溶解阶段的至少一部分，全部在微流体装置中进行。分析器系统的特别的紧凑性质允许每个过程步骤之间的协调，并且很大地加快了其中DNA片段被可选择地加热和冷却的扩增程序。因此，整体式分析器系统可以在约1小时内完成从DNA提取至分析的整个过程(即通常的特征描绘)。本发明的DNA分析器系统利用基于凝胶的微流体样品处理装置并且因此利用试剂，DNA和PCR产物在微流体装置内的电动力流体运动实现DNA分析。此外，以DNA提取材料的方式的被支持材料和基于凝胶的试剂的在基于凝胶的微流体样品处理中的结合为市场上的使用仅在液体/溶液相中的试剂和样品的的那些现有技术装置提供了优良的结果。凝胶或凝胶基质在微流体装置中的形成能够在长时期内支持在其中的试剂并且提供对溶解的样品和DNA和扩增的DNA片段的更稳定的电动力控制，即使在系统中可能存在气泡时。此外，这样的装置允许溶解的样品向装置的引入，然后借助于相继的提取和/或纯化、扩增和分离在装置内经历多重处理，这样的处理主要通过与在其中的基于凝胶的试剂的相继的相互作用对溶解的样品和/或DNA的电动力操作来实现。这与在某种程度上是 “单一步骤”装置的现有技术装置形成对比。虽然已经在分析生物样品中的DNA片段的方面描述了本发明，但是技术人员将理解，本发明可以同样地应用于任何核酸材料例如RNA的分析，其中过程将涉及逆转录，以形成适合于在PCR中使用的DNA。因此，方法可以涉及进行逆转录，并且设备可以因此包括用于进行该步骤的合适的试剂。现在将仅以实例的方式参照附图描述本发明的实施方案，在附图中

图1示出了本发明的系统的容纳第一部件，即硬件，的容纳工具；图2示出了本发明的系统的具有原位的微流体装置的容纳工具；图3示出了根据本发明的微流体装置的关键部分；图4示出了根据本发明的微流体装置的示意图；图5示出了根据本发明的第二实施方案的微流体装置，包括可选择的样品引入装置；图6是80%乙醇洗涤溶液(ν/ν)和在凝胶中的80%乙醇洗涤溶液(ν/ν)通过电渗透流动穿过根据本发明的微流体装置中的基于二氧化硅的单块的运动的图解图示；图7示出了通过本发明的方法且尤其是通过DNA向PCR试剂中的电动力运动获得的PCR产物的UV透照仪图像，其中稳定性测试1由在室温下静置30分钟的凝胶组成并且稳定性测试2由在室温下静置1小时的凝胶组成。图示出了在凝胶浓缩物的稳定性测试中获得的PCR产物的UV透照仪图像；以及图8b示出了通过本发明的方法由在4°C下储存了 4周的凝胶的稳定性测试获得的 PCR产物的UV透照仪图像；图9示出了从与表2中看到的几何构型相关联的由外加电压得到的电动力运动的可视化图形，其中A和B分别表现了两个最有效的几何构型且根据本发明的方法；图10示意性地阐释了根据本发明的微流体装置，以及来自由琼脂糖凝胶填充的 T形截面的样品电动力注入到由聚氧化乙烯分离介质填充的毛细管电泳分离通道中，其中 A-D表示钼电极的位置；图11示出了根据本发明方法的在琼脂糖凝胶基质中的不成功的电动力注入的可视化图形；图12a图示了根据本发明方法的从TE溶液中的EK注入获得的特征曲线；以及图12b图示了根据本发明方法的从1.5%琼脂糖凝胶中的EK注入获得的特征曲线；图13图示了根据本发明方法的从1. 5%琼脂糖凝胶中的优化的EK注入获得的特征曲线的实施例；图14示出了根据本发明方法的在(a)存在气泡和(b)不存在气泡的琼脂糖凝胶基质中的成功的电动力注入的可视化图形，并且用于图14的工作电压和时间在表1中给出；图15示出了微流体装置的示意图，该示意图示出了整体式的DNA提取室和扩增室以及用于电渗透泵送的电极的位置；图16图示了在洗脱步骤期间从单块回收的DNA的量与先加入到图15的装置中的 DNA的量的比较；图17a示出了琼脂糖凝胶的可视化图形，示出了由图15的系统生成的PCR产物；图17b图示了由图15的系统生成的Amelogenin PCR产物，其通过毛细管电泳被分析以进行精确的分级；图18是穿过适合于将热循环施加于根据本发明的微流体装置的微波加热器的横截面；图19是来自网络分析器的图形输出，显示了反射功率的下降，这表明微流体装置的精确的共振频率以便确定图18的加热器的操作参数；以及图20是从图18的加热器获得的热循环。提供了具有微通道的微流体样品处理装置。微通道被蚀刻入基底中，基底优选是玻璃，但是也可以是塑料或其他合适的物质。基底测得为120mm乘60mm的区域，或可以具有其他合适的尺寸，取决于使用其的应用或系统。基底可以另外包括在其微通道内的基于凝胶的分离介质和试剂；以及将基底耦合于电源和/或在DNA分析器系统内起作用所必需要求的电接触。基于凝胶的分离介质和试剂以流体动力泵送的方式被预加载入装置的微通道中，以流体静力方式，例如通过吸力或压力控制注入。然后玻璃基底被结合于玻璃基底的盖密封，以包封被界定在其中的内部微通道。其他附接盖的方式也可以是合适的，并且不排除通过除了结合之外的方式附接盖。优选的用于微流体装置的基底材料是玻璃，因为玻璃技术已经非常成熟并且已经良好地表征了其对大多数反应的化学响应。微流体装置(300)包括三个主要部件，即DNA提取室(302)、PCR室(303)以及分离和检测通道(304)，所有这些都可以在图3和4中看到并且所有这些彼此流体连接/彼此流体配合。如上文提到的，与现有技术不同，本发明的微流体装置(300)在使用在例如DNA分析器系统中期间不需要外部泵送。相反地，多个电极被用于通过电渗流或电泳以电动力方式操作流体，以搅动微通道内基于凝胶的试剂结构内的带电的化学物质的总体流动或者不连续运动。本申请示出了使用七个电极，但是更多的或更少的也是可能的。本发明的微流体装置(300)被专门设计成通过将所有硬件要求保持在微流体装置的外部来使其制造成本低。这允许微流体装置保持经济性，并且因此对于单次使用分析来说是理想的，这在其中可能需要使用过的微流体装置形成证据基础的法医或犯罪现场勘查的领域中当然是特别有利的。已经发现，与基于溶液(现有技术)的方法相比，在本发明的微流体装置(300) 中，用于支持过程试剂和样品DNA的由凝胶填充的通道或毛细管的使用提供在对样品DNA 的电动力控制方面增强的稳定性，即使在系统中存在气泡时也是这样。凝胶可以呈基质的形式，但是无论其以什么形式存在，凝胶都应当能够在长时期内将不同的过程试剂以精确的定位固定在微流体装置中。在包括微通道的微流体装置(300)可以被使用之前，其必须被按照下文详细描述的方式制备，并且特别参照图4的微流体装置的示意图微流体装置制备单块制备在微流体装置(300)的六边形提取室(30 中通过将10 1比的硅酸钾和甲酰胺的溶液压力注入到样品引入口(301)中来形成基于二氧化硅的提取单块。周围的通道被3%甘油羟基乙基纤维素(HEC)凝胶填充，确保二氧化硅溶液在95°C下固化12小时期间保持在六边形提取室(30 中。在固化过程之后，使用水洗涤来自通道的HEC凝胶。 基于二氧化硅的单块由硅酸钾(9% Κ20,21% SiO2)和甲酰胺(98% )制造。通道A的制备通过将低熔点琼脂糖凝胶溶解在去离子水中以得到3% (w/v)的浓度(100 μ 1去离子水中0. 0030g琼脂糖)并且加热至75°C来制备琼脂糖洗涤递送凝胶。 当凝胶已经形成但是仍然呈熔融形式时，将80%乙醇和20% IM氯化钠溶液加入、混合并且压力注入口 A中，以填充从口 A处的入口至被定位在提取室(302)中的单块的通道长度。通道B的制备将低熔点琼脂糖溶解在不含DNA/RNA的水中，并且加热至75°C，保持lOmin，将凝胶的浓度保持在低水平，使得大容量的水自由地运动经过凝胶。当凝胶已经形成但是仍然呈熔融形式时，将凝胶压力注入口 B中，以填充从口 B处的入口至被定位在提取室(302)中的单块的通道长度。通道C的制备将低熔点琼脂糖溶解在不含DNA/RNA的水中，并且加热至75°C，保持lOmin。在仍然呈熔融形式时，将凝胶压力注入口 C中。分离通道(304)的制备通过长时期搅动的方法，将聚环氧乙烷(PEO)凝胶制备成IXTris-EDTA缓冲剂中高达2. 5%的浓度；然后，通过压力注入口 G中，将聚环氧乙烷 (PEO)凝胶引入装置中。凝胶的粘性使对流速的控制能够被实现，使得注入仅被朝向通道 D-F的交叉处进行。在可选择的实施方案中，具有合适粘性的其他凝胶可以在分离通道中采用，例如具有IXTris TAPS EDTA(TTE)缓冲剂中6M尿素的线型聚丙烯酰胺(LPA)。PCR室(303)的制备将低熔点琼脂糖溶解在不含DNA/RNA的水中，并且加热至 75°C，保持lOmin。当凝胶已经形成并且仍然呈熔融形式时，将PCR试剂加入(NH4缓冲剂、 BSA、正向引物和反向引物、dNTP、MgCl2* Taq聚合酶)并且混合。在“PCR凝胶”仍然呈熔融形式时，将“PCR凝胶”通过压力注入口 D中来注入到PCR室(303)中，填充通道D-F并且至口 E。然后用导电聚合物塞闭合口 A-G，将导电聚合物塞连接于电极并由电源供电，电源可以位于整体式分析器系统的第一部件中。整个分析方法的各阶段(至少在细胞溶解之后)发生在上述类型的密封的微流体装置(300)内。在用于分析器系统中之前，微流体装置(300)必须用具有对于所需阶段中的每一阶段来说合适的化学性质的试剂进行预加载，并且装置优选被在4°C下储存。在一种操作模式中，一旦使用者“就位”，那么溶解的样品随后就可以被手动加载到微流体装置(300) 上。在另一种操作模式中，样品的溶解也可以在装置上或装置处进行。这些替代形式在下文更详细地讨论。控制溶解的样品和DNA向毛细管通道中的注入对于获得可重复的分离和可靠的检测分辨率来说是非常重要的。向微流体装置中的注入可以通过吸力、压力或重力以流体静力方式进行控制，或以电动力方式进行控制，电动力方式固有地比流体动力系统更适于精确且准确地控制样品引入，同时不再需要外部的泵、致动器、阀门等。在本实施方案中，样品的装载经由样品引入口(301)进行，例如通过将几微升的溶解的样品用滴管移入样品引入口(301)中，或通过将样品施用于被溶解剂浸泡过的海绵(501)并且将海绵(501)施用或保持在样品引入口(如图5所示)。从样品引入口处，样品渗入DNA提取室(502)中的二氧化硅多孔单块中。然后用帽状物密封引入口，并且通过向被定位在A-G处的并且如图 4中所示的电极施加电场来在室和通道内操作样品。系统自身包括完全集成的便携式DNA分析器系统，该系统包括容纳装置(如图1 和2所示)，容纳装置具有两个分立的但是互相配合的部件。第一部件是控制单元，控制单元容纳所有为控制诸如热循环和检测的过程所必需的硬件和软件。第二部件或另外的部件是微流体装置，微流体装置容纳样品和有关的处理试剂。细胞溶解之后的整个分析方法在上述类型的密封微流体装置(300)内发生。在优选的情况下，细胞溶解在装载有溶解剂的海绵(501)中进行，并且该阶段也可以在装置 (500)上发生。容纳装置的第一部件包括所有用于控制样品运动、PCR扩增和分析的硬件， 容纳装置的第一部件在微流体装置(300、500)的外部。系统的包括第一部件，即硬件的容纳装置可以在图1中看到，而微流体装置可以原位地在图2中的系统的容纳装置内看到。本发明的分析器系统通过触摸屏控制面板控制并且是完全自动化的，使得一旦盖被闭合，分析过程将运行直至完成，产生所需要的DNA特征曲线。一旦微流体装置(300、 500)装载有样品/溶解的样品，那么将微流体装置(300、500)放置在系统内，并且在电极 A和C之间施加电偏压，以用醇溶液洗涤来自溶解的样品中的DNA，如在上文的通道A的制备中描述的，以除去可能潜在地干扰过程的细胞碎片和其他材料，例如在血液样品中存在的血红素分子。然后在口 B和D之间施加偏压(bias)，该偏压将水从通道B泵送穿过装置 (300,500)的提取室(302、502)中的二氧化硅单块，由此将DNA洗脱入由凝胶填充的PCR 室(303)中。在PCR室内，在已知合适的试剂的存在下，经过三个PCR温度，将DNA循环约 25至30次，以扩增DNA特征曲线所需要的DNA的片段。这些试剂还可以含有荧光染料，荧光染料可以附接于所选择的DNA片段，使得它们可以在分离过程期间被检测到。然后，已扩增的片段(例如，由扩增用于标准DNA指纹识别的十一个基因座产生的PCR产物)以电动力方式被牵拉至分离通道(304)的颈部，在分离通道(304)的颈部处，将确定的少量引入分离通道(304)中。这也使用电场进行，其中在电极G和E处，将大的电偏压施加于分离通道 (304)，使得扩增产物的DNA片段在随分离通道(304)向下运动时分离。电极接头通常呈具有约500 μ m直径的形式，并且钼丝是优选的。更优选地，导电聚合物，例如碳填充的聚苯乙烯，被用作装置的电极接头，并且涂覆金的铜电极用于将控制单元电源连接至聚合物电极。当扩增产物的DNA片段穿过凝胶基质时，它们的分离受到它们的电荷和尺寸的影响。它们的迁移时间实质上决定它们的尺寸。核酸片段基于尺寸的电泳分离过程是众所周知的技术并且在此不需要进一步解释。在本发明的本实施方案中，使用至少两个激光器和两个分光计来进行这些片段的检测。对检测器的唯一要求是知道激光器发射具有非常精确的波长的光，使得光可以区别于用于标记核酸片段的荧光染料的四种频率。简而言之，两个激光器激发荧光染料(在这种情况下，四种)，以允许两个分光计或检测器(二者被要求允许系统对于2个激光器的光是“盲的”但是仍然看到四种荧光染料)识别片段经过靠近口的检测窗的时间，由此使DNA特征曲线或指纹识别能够被描绘。在运行完成时，机器以类似于通常由ABI (Applied Biosystems Ltd，Warhngton，英国)生成的商用序列的图形的形式输出特征曲线。用于在分析器系统中使用微流体装置的方法还在下文更详细地提供和描述。实质上，待测试的溶解的样品被手动地引入微流体装置中，或待测试的样品被引入装载有用于在装置上溶解待测试的样品的溶解剂的海绵上。然后，溶解的样品被吸收至二氧化硅单块上，然后在二氧化硅单块上原位提取DNA并且洗涤，接着洗脱DNA并使用PCR方法扩增，之后分离出DNA的荧光标记的片段以获得基因指纹。系统的输出结果与保存在英国国家法医科学服务处内的DNA数据库是兼容的，但是可以被容易地改变结构，以与其他国家的那些数据库兼容，如果需要的话。在分析器系统中使用本发明的微流体装置的方法将再次参照图4在下文更详细地进行描述a)利用样品引入口(301)将10_50微升的样品溶解产物和盐酸胍手动加载到位于微流体装置(300)的DNA提取室(302)内的二氧化硅单块上。b)使用位于微流体装置(300)的口 A和C处的电极，通过将80 %的乙醇溶液从洗涤入口(口 A)穿过容纳基于二氧化硅的提取单块的DNA提取室(302)移动至洗涤出口( 口 C)来洗涤含有DNA的溶解的样品。这通过在口两侧施加偏压并且搅动电渗透流(EOF)来实现。搅动EOF的典型电压是50-150v/cm(见表1)。80%乙醇溶液洗涤单块的细胞碎片和不需要的基质，以实现溶解的样品内含有的DNA的回收。c)然后，通过在微流体装置(300)的口 B和D之间施加偏压由此搅动EOF流，使用 H20将保留在二氧化硅单块上的DNA洗脱入PCR室(303)中(见表1)。d)使用聚合酶链反应(PCR)扩增DNA，以形成DNA片段。将PCR室(303)循环加热过3个离散的温度；结果，所选择的DNA片段被指数地扩增。合适的探针用于提供所关心的扩增片段。在完成25至30次PCR过程循环时，允许含有扩增产物的凝胶凝固，即恢复至环境温度。e)以电泳方式将含有DNA片段的PCR产物从PCR室(303)移动至分离通道(304) 的颈部，在分离通道(304)的颈部使用本领域众所周知的捏注入(pinched injection)技术以电动力方式注入微流体装置(303)的分离通道(304)中。以这种方式，一小部分含有 DNA片段的PCR产物被牵拉入分离通道(304)中持续受控的时间(见表1)，然后将电压施加于电极D、E和F，以将没有被注入分离通道(304)中的PCR产物牵拉回来，由此形成注入的PCR产物的不连续的条。然后，将电压施加于电极D、E、F和G(如表1中详细描述的)， 以在分离开始之前集中PCR产物的不连续的条的带电的DNA片段。f)通过在口 D-G之间施加偏压，将注入的PCR产物的DNA片段沿微流体装置(300) 的分离通道(304)进行电泳分离(见表1)。表1-用于试剂和DNA片段迁移率的施加电压和时间
权利要求
1.一种基于凝胶的整体式微流体样品处理装置，包括基底，所述基底具有多个微通道， 以形成至少一个DNA提取室，所述至少一个DNA提取室与扩增室流体配合，所述扩增室进而与分离和检测通道流体配合；所述微通道容纳DNA提取材料和对于处理所述样品来说所必需的基于凝胶的反应试剂；所述装置还包括电接触，所述电接触用于耦合于外部电源并且能够引起对整个装置中的所述基于凝胶的试剂和从所述样品提取的DNA的电动力操作。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述基底由惰性不导电材料形成。
3.根据权利要求2所述的装置，其中所述基底由玻璃或类似物形成。
4.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述装置的尺寸在120mm乘60mm的区域中。
5.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述DNA提取材料是位于所述DNA提取室中的带电材料。
6.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述DNA提取材料是位于所述DNA提取室中的固相提取材料。
7.根据权利要求6所述的装置，其中所述固相提取材料是多孔的基于二氧化硅的固相提取材料。
8.根据权利要求7所述的装置，其中所述基于二氧化硅的固相提取材料是基于二氧化硅的单块。
9.根据权利要求8所述的装置，其中所述基于二氧化硅的单块是热引发的基于二氧化硅的单块。
10.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述至少DNA提取室、扩增室以及分离和检测通道包括在它们中的基于凝胶的试剂，所述至少DNA提取室、扩增室以及分离和检测通道的每一个中的所述基于凝胶的试剂与在其中发生的过程的性质有关。
11.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中多个另外的通道、入口和出口被设置用于引入到所述装置周围或在所述装置周围运动或除去基于凝胶的试剂。
12.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述DNA提取室包括样品引入口。
13.根据权利要求12所述的装置，其中所述样品引入口包括样品接收工具或与所述样品接收工具流体连通，以提供溶解的样品的引入。
14.根据权利要求13所述的装置，其中所述样品接收工具适于提供将溶解的样品直接引入到所述DNA提取室中。
15.根据权利要求13所述的装置，其中所述样品接收工具适于提供未溶解的生物样品的接收、所述未溶解的生物样品的溶解以及将所述溶解的样品引入到所述DNA提取室中。
16.根据权利要求15所述的装置，其中所述样品接收工具包括吸收性构件，所述吸收性构件用于在使用中接收样品，预装载溶解剂以及适于被放置为与DNA提取室引入口流体连通，以在被如此放置时向所述DNA提取室引入口中接收、溶解和引入样品。
17.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述DNA提取室包括洗涤入口和与所述洗涤入口流体连接的洗涤出口。
18.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述基底被盖密封以用于包封在其中界定的内部微通道。
19.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述装置包括多个电极，以电动力操作整个装置中被支持在凝胶内的试剂、溶解的样品和所提取的DNA和DNA片段；所述电极在一端可密封地连接于所述装置，并且远离所述装置的那些端可连接于电源。
20.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述基于凝胶的反应试剂包括光学探针。
21.根据权利要求20所述的装置，其中所述光学探针是荧光染料。
22.根据权利要求20所述的装置，其中所述光学探针是化学发光染料。
23.一种用于分析生物样品中的DNA的便携的整体式系统，包括用于对来自所述样品的DNA片段进行提取和纯化、扩增、分离和分析的电动力驱动系统，所述系统还包括基于凝胶的微流体样品处理装置，所述基于凝胶的微流体样品处理装置包括基底，所述基底具有多个微通道，以形成至少一个DNA提取室，所述至少一个DNA提取室与溶解室和扩增室流体配合，所述溶解室和所述扩增室进而与分离和检测通道流体配合，多个电极被定位在所述微流体装置内并且耦合于电源，所述多个电极被配置为电动力操作所述微流体装置周围的基于凝胶的试剂以及DNA和DNA片段，其中所述微流体装置适于经过所述DNA提取室接收所述样品；所述系统还包括加热元件，其耦合于或毗邻所述微流体样品处理装置； 检测器，其被定位为通过可检测信号检测DNA片段；以及便携的壳体，其被配置为容纳所述微流体装置、电动力驱动系统、所述检测器和所述电源。
24.根据权利要求23所述的系统，其中所述加热元件是非接触式加热元件。
25.根据权利要求M所述的系统，其中所述加热元件包括微波辐射的源。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的系统，还包括用于以图形形式显示所述DNA 可检测信号的输出工具。
27.一种分析DNA的方法，包括a)将样品引入位于分析器系统中的基于凝胶的微流体样品处理装置的DNA提取室中；b)在所述DNA提取室内对所述样品进行电动力操作以提取DNA；c)将所述DNA提取室中的所述DNA电动力洗脱至扩增室；d)在所述扩增室中扩增所述DNA，以在凝胶内形成扩增产物；e)将所述扩增产物电动力注入分离通道中；f)对所述扩增产物进行电动力分离，以形成DNA特征曲线。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述样品在被引入所述DNA提取室中之前被溶解。
29.根据权利要求观所述的方法，其中所述样品在被引入所述装置中之前被溶解。
30.根据权利要求四所述的方法，其中所述样品在离液盐溶液中被引入所述装置中。
31.根据权利要求观所述的方法，其中样品溶解步骤在所述装置旁或在所述装置上进行。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述样品通过以下步骤被引入 提供装载有溶解剂的吸收性构件；向所述吸收性构件上施用未溶解的生物细胞的样品；将所述吸收性构件施用在和/或保留在与所述DNA提取室流体连通的样品接收部位处，以向所述DNA提取室中引入溶解的样品。
33.根据权利要求27至32中任一项所述的方法，其中将所述DNA提取室中的所述DNA 洗脱至所述扩增室通过电动力操作来进行。
34.根据权利要求27至33中任一项所述的方法，其中所述样品通过将洗涤溶液从所述 DNA提取室的洗涤入口运动至所述DNA提取室的洗涤出口被电动力纯化。
35.根据权利要求27或34中任一项所述的方法，其中在所述DNA室内对所述样品的所述电动力操作借助于电渗透操作所述样品来进行。
36.根据权利要求27至35中任一项所述的方法，其中所述DNA片段的扩增通过聚合酶链反应(PC 来进行。
37.根据权利要求27至36中任一项所述的方法，其中所述扩增产物的所述电动力分离通过电泳分离来进行。
38.根据权利要求27至37中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤检测所述DNA特征曲线并且将所述检测信号传递至输出工具，使得能够以图形方式观察所述特征曲线。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述方法还包括将所述特征曲线与已知的特征曲线进行比较。
40.一种基于凝胶的微流体样品处理装置，其如在本文中并参考图3、4、10和11大体描述的。
41.一种用于分析生物样品中的DNA的便携的整体式系统，其如在本文中并参考图1和 2大体描述的。
42.一种分析DNA的方法，其如在本文中参考实施例大体描述的。
全文摘要
一种适合于在犯罪现场的法医调查的基于凝胶的整体式微流体样品处理装置，包括基底，基底具有多个微通道，以形成至少一个DNA提取室，所述至少一个DNA提取室与扩增室流体配合，扩增室进而与分离和检测通道流体配合；所述微通道容纳DNA提取材料和对于处理所述样品来说所必需的基于凝胶的反应试剂；装置还包括电接触，电接触用于耦合于外部电源且能够引起对整个装置中的所述基于凝胶的试剂和从所述样品提取的DNA的电动力操作。
文档编号B01L7/00GK102245305SQ200980149637
公开日2011年11月16日 申请日期2009年10月12日 优先权日2008年10月10日
发明者斯蒂芬·约翰·哈斯韦尔 申请人:赫尔大学