加热的色谱分离方法
【专利摘要】本发明提供了从进料混合物回收多元不饱和脂肪酸（PUFA）产物的色谱分离方法，该方法包括使进料混合物通过含有作为洗脱液的含水有机溶剂的一个或多个色谱柱，其中，进料混合物通过至少一个色谱柱的温度比室温更高。
【专利说明】加热的色谱分离方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及纯化多元不饱和脂肪酸(PUFA)及其衍生物的改进的色谱分离方法。特别是，本发明涉及允许待使用的洗脱液的量减少的改进的色谱分离方法。
【背景技术】
[0002]脂肪酸(特别是PUFA)及其衍生物是生物学上重要分子的前体，它们在调节诸如血小板聚集、炎症和免疫反应等生物学功能中起着重要作用。因此，PUFA及其衍生物可在治疗上可用于治疗广泛的病理病症，这病理病症包括CNS病症、包括糖尿病性神经病变的神经病变、心血管疾病、包括炎性皮肤疾病的全身免疫系统和炎症病症。
[0003]在诸如蔬菜油和海洋油等天然进料中发现PUFA。然而，这些PUFA经常以饱和脂肪酸和许多其他杂质的掺和剂存在于这些油中。因此，在用于营养或用于药物之前，应该对PUFA进行合意的纯化。
[0004]不幸的是，PUFA极易被破坏。因此，当在氧存在下加热时，它们易于发生异构化反应、过氧化反应和低聚反应。因此，难以通过PUFA产物的分馏和纯化来制备纯脂肪酸。即使在真空条件下蒸馏也可能导致不可接受的产物降解。
[0005]色谱分离技术为本领域技术人员所众所周知。涉及固定床系统和模拟或真实移动床系统的色谱分离技术均为本领域技术人员所熟悉。
[0006]在常规的固定床色谱系统中，其组分待分离的混合物渗透通过容器。该容器一般是圆柱形的，并且通常被称为柱。该柱含有对流体表现出高渗透率的多孔材料的填料(一般称为固定相)。混合物中各组分的渗透速度取决于该组分的物理性质，从而使得组分接连地且优选地从柱中出来。因此，一些组分趋向于牢固地固定到固定相，并且因此将缓慢地渗出，然而其他组分趋向于薄弱地固定并更快速地从柱中出来。已经提出许多不同的固定床色谱系统并且这些固定床色谱系统均被用于分析目的和工业生产目的。
[0007]模拟和真实移动床色谱是本领域技术人员所熟悉的已知技术。操作原理涉及液体洗脱液相和固体吸附剂相的逆流移动。该操作允许溶剂的最小用量，从而使得该方法经济可行。已经发现这种分离技术在不同领域中的若干应用，这些领域包括碳氢化合物、工业化学品、油、糖和API。
[0008]因此，模拟移动床系统由含有串联连接在一起的吸附剂的若干独立的柱组成。在第一方向上洗脱液通过该柱。在系统中原料和洗脱液的注入点和已分离组分的收集点依靠一系列阀门而周期性地移动。整体效应将模拟含有固体吸附剂的移动床的单一柱的操作，固体吸附剂在洗脱液的流动的逆流方向上移动。因此，如常规的固定床系统中的，模拟移动床系统由含有洗脱液通过的固体吸附剂的固定床的柱组成；但在模拟移动床系统中，该操作达到模拟连续逆流移动床的程度。
[0009]参照图1，示出了典型的模拟移动床色谱设备。通过考虑含有被分成多段(section)(更精确地说，从柱的底部到顶部被分成四个重叠的子区域1、I1、III和IV)的固定相S的竖直的色谱柱来解释模拟或真实移动床色谱分离方法的概念。借助于泵P在底部的IE处引入该洗脱液。在子区域II和子区域III之间的IA+B处引入待分离的组分A和B的混合物。在子区域I和子区域II之间的SB处收集主要含有B的提取物，并且在子区域III和子区域IV之间的SA处收集主要含有A的提余物。
[0010]在模拟移动床系统的情况下，通过弓I入点和收集点相对于固体相的移动来弓I起固定相S的模拟向下移动。在真实移动床系统的情况下，通过多个色谱柱相对于引入点和收集点的移动来引起固定相S的模拟向下移动。在图1中，洗脱液向上流动，并且混合物A+B注入到子区域II和子区域III之间。组分将根据它们与固定相的色谱相互作用(例如在多孔介质上的吸附)而移动。对固定相表现出较强的亲和力的组分B (运动较慢的组分)将会较慢地被洗脱液夹带并且将会由延迟地跟随着洗脱液。对固定相表现出较弱的亲和力的组分A (运动较快的组分)将会容易地被洗脱液夹带。如果恰当地估计和控制参数的合适设置(特别是在每个子区域中的流速)，那么将在子区域III和子区域IV之间收集展示对固定相的较弱亲合性的组分A作为提余物，并且在子区域I和子区域II之间收集展示对固定相的较强亲合性的组分B作为提取物。
[0011]因此，应当理解的是，示意性示出在图1中的常规的移动床系统仅限于二元分馏。
[0012]在下列若干专利中描述了用于模拟移动床色谱的方法和装置，这些专利包括:US2985589、US3696107、US3706812、US3761533、FR-A-2103302、FR-A-2651148 和FR-A-2651149,通过引用将这些专利的全文并入本文中。该主题还在Ganetsos和Barker编辑的“Preparative and Production Scale Chromatography，，, Marcel Dekker Inc, NewYork, 1993中得以充分论述，通过引用将其全文并入本文中。
[0013]真实移动床系统在操作上类似于模拟移动床系统。然而，不是借助于阀门系统来变换进料混合物和洗脱液的注入点与被分离开的组分的收集点，而是使一系列吸附部件(即，柱)相对于进料点和排出点进行物理移动。再者，操作达到模拟连续的逆流的移动床的程度。
[0014]在以下若干专利中描述了真实移动床色谱的方法和装置，这些专利包括:US6979402、US5069883和US4764276，通过引用将这些专利并入本文中。
[0015]PUFA产物的纯化特别有挑战性。因此，用于制备PUFA产物的许多合适的原料是极其复杂的混合物，该极其复杂的混合物含有大量在色谱设备中具有非常相似的保留时间的不同组分的。因此，非常难以将治疗上有用的PUFA与这些原料分离。然而，特别是对于药物应用和营养食品应用来讲，需要高纯度的PUFA产物。因此历史上，当需要高纯度PUFA产物时，已经使用了蒸馏。然而，如上所讨论，使用蒸馏作为用于难以处理的PUFA的分离技术具有显著的缺点。
[0016]一般而言，分离PUFA的所有色谱分离技术利用大体积的有机溶剂作为洗脱液。在完成色谱分离方法后，必须从洗脱液中的溶液中回收PUFA。典型地，巨大支出的时间和精力涉及到从洗脱液中的溶液中回收PUFA。而且，用作色谱分离方法中的洗脱液的有机溶剂经常有害于环境或处理它们的技工。因此，需要待使用的有机溶剂的量减少的色谱分离方法。
[0017]如上所述，含有PUFA的合适的商业原料，例如鱼油，典型地含有在色谱设备中具有非常相似的保留时间的大量的不同组分。因此，也需要提高在具有相似的保留时间的进料混合物的组分之间的分辨率的色谱分离方法。
【发明内容】
[0018]已经有利地发现，在室温以上的温度下所进行的色谱分离方法需要较少的有机溶剂洗脱液。因此，在高温(elevated temperature)下,基本上减少了商业上关注的很多PUFA的保留时间，反过来，意味着较少的有机溶剂洗脱液必须用于分离含有各种不同的PUFA的混合物，例如鱼油原料，或鱼油衍生的原料。
[0019]已经有利地发现，使用含水有机溶剂来提高色谱分离方法中使用的水的量提高了存在于具有相似的保留时间的进料混合物中的组分的分辨率。这意味着具有较高的水含量的洗脱液允许PUFA产物与进料混合物较干净地分离。
[0020]因此，本发明提供了从进料混合物中回收多元不饱和脂肪酸(PUFA)产物的色谱分离方法，该方法包括进料混合物通过含有作为洗脱液的含水有机溶剂的一个或多个色谱柱，
[0021]其中，进料混合物通过色谱柱中的至少一个的温度大于室温。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1示出用于分离二元混合物的模拟或真实移动床方法的基本原理。
[0023]图2示出适合于将EPA与运动较快和较慢的组分(即，极性较大和极性较小的杂质)分离的本发明的一个【具体实施方式】。
[0024]图3示出适合于将DHA与运动较快和较慢的组分(即，极性较大和极性较小的杂质)分离的本发明的一个【具体实施方式】。
[0025]图4更详细地示出适合于将EPA与运动较快和较慢的组分(即，极性较大和极性较小的杂质)分离的本发明的一个【具体实施方式】。
[0026]图5更详细地示出适合于将DHA与运动较快和较慢的组分(即，极性较大和极性较小的杂质)分离的本发明的一个【具体实施方式】。
[0027]图6更详细地示出适合于将EPA与运动较快和较慢的组分(即，极性较大和极性较小的杂质)分离的本发明的第一优选的实施方式的替代方法。
[0028]图7更详细地示出适合于将DHA与运动较快和较慢的组分(即，极性较大和极性较小的杂质)分离的本发明的第二优选的实施方式的替代方法。
[0029]图8示出用于纯化与运动较快和较慢的组分(即，极性较大和极性较小的杂质)分离的EPA的本发明的一个【具体实施方式】。
[0030]图9示出用于纯化与运动较快和较慢的组分(即，极性较大和极性较小的杂质)分离的EPA的本发明的一个【具体实施方式】的替代方法。
[0031]图10示出可以进行本发明的色谱分离方法的一个【具体实施方式】的三种方式。
[0032]图11显示用于纯化与运动较快和较慢的组分(S卩，极性较大和极性较小的杂质)分离的EPA的进一步的实施方式。
[0033]图12显示按照本发明所生产的EPA PUFA的GC FAMES迹线(traces)。
[0034]图13显示按照本发明所生产的EPA PUFA的GC FAMES迹线。
【具体实施方式】
[0035]如本文所用的，术语“PUFA产物”是指包含一种或多种的典型地具有营养或药物重要性的多元不饱和脂肪酸(PUFA)和/或其衍生物的产物。典型地，PUFA产物是单一的PUFA或其衍生物。或者，PUFA产物是两种或更多种PUFA或其衍生物，例如两种PUFA或其衍生物的混合物。
[0036]术语“多元不饱和脂肪酸”(PUFA)是指含有多于一个双键的脂肪酸。这种PUFA为本领域技术人员所周知。如本文所用的，PUFA衍生物是甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯、酯、磷脂、酰胺、内酯或盐形式的PUFA。甘油三酯和酯是优选的。酯是更优选的。酯典型地为烷基酯，优选C1-C6的烷基酯，更优选C1-C4的烷基酯。酯的实例包括甲酯和乙酯。乙酯是最优选的。
[0037]典型地，PUFA产物含有至少一种ω-3或co-6PUFA，优选至少一种(0-3PUFA。co-3PUFA的实例包括α -亚麻酸(ALA)、十八碳四烯酸(SDA)、二十碳三烯酸(ΕΤΕ)、二十碳四烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。优选SDA、EPA、DPA和DHA。更优选EPA和DHA。(0-6PUFA的实例包括亚油酸(LA)、Y -亚麻酸(GLA)、二十碳二烯酸、二高-Y-亚麻酸(DGLA)、花生四烯酸(ARA)、二十二碳二烯酸、肾上腺酸以及二十二碳五(ω -6)烯酸。优选LA、ARA, GLA和DGLA。
[0038]在一个实施方式中，PUFA产物是EPA和/或EPA乙酯(EE)。
[0039]在另一个实施方式中，PUFA产物是DHA和/或DHA乙酯(EE)。
[0040]在又一个实施方式中，PUFA产物是EPA和DHA和/或EPA EE和DHA EE的混合物。
[0041]在最优选的实施方式中，PUFA产物是EPA或EPA乙酯，所生产的EPA或EPA乙酯的纯度为大于90%的纯度，优选为大于95%的纯度，并且更优选为大于97%的纯度。
[0042]典型地，除了所述PUFA产物，在本发明的色谱分离方法中收集另外的次要PUFA产物。优选地，PUFA产物是ΕΡΑ，并且另外的次要PUFA产物是DHA。
[0043]在本发明的进一步的实施方式中，该设备配置为收集PUFA产物，该PUFA产物是EPA和DHA的浓缩混合物。因此，使用含有EPA、DHA,比EPA和DHA极性更大的组分以及比EPA和DHA极性更小的组分的进料混合物。在第一分离步骤中，典型地移出比EPA和DHA极性更小的材料。在第二分离步骤中，典型地移出比EPA和DHA极性更大的材料，并且收集EPA和DHA的浓缩混合物作为PUFA产物。
[0044]适用于通过本发明的方法分馏的进料混合物可以从包括植物和动物油和脂肪的天然来源中和从包括基因修饰的植物、动物和包括酵母的微生物的合成来源中获得。实例包括鱼油、藻油和微藻油以及植物油，例如琉璃苣油，蓝蓟油和月见草油。在一个实施方式中，进料混合物是鱼油。在另一个实施方式，进料混合物是藻油。当期望的PUFA产物是EPA和/或DHA时，藻油特别合适。当期望的PUFA产物是GLA时，基因修饰的红花油特别合适。当期望的PUFA产物是EPA时，基因修饰的酵母特别合适。
[0045]在特别优选的实施方式中，进料混合物是鱼油或鱼油衍生的原料。已经有利地发现，当使用鱼油或鱼油衍生的原料时，通过本发明的方法可以大于90%的纯度，优选为大于95%的纯度，并且更优选为大于97%的纯度生产EPA或EPA乙酯PUFA产物。
[0046]在通过本发明的方法分馏之前，进料混合物可以经历化学处理。例如，它可以经历甘油酯交换或甘油酯水解，在某些情况下，接着经历选择性方法，诸如结晶、分子蒸馏、尿素分馏、硝酸银或其他金属盐溶液的萃取、碘内酯化反应或超临界流体分馏。或者，进料混合物可以直接使用而没有初始处理步骤。[0047]进料混合物典型地含有PUFA产物以及至少一种极性较大的组分和至少一种极性较小的组分。极性较小的组分相比PUFA产物对本发明的方法中使用的吸附剂具有更强的吸附力。在操作期间，这种极性较小的组分典型地优先于液体洗脱液相而随着固体吸附剂相移动。极性较大的组分相比PUFA产物对本发明的方法中使用的吸附剂具有更弱的吸附力。在操作期间，这种极性较大的组分典型地优先于固体吸附剂相而随着液体洗脱液相移动。一般而言，极性较大的组分将分离进入提余物流，而极性较大的组分将分离进入提取物流。
[0048]极性较大和极性较小的组分的实例包括(I)存在于天然油(例如，海洋油或植物油)中的其他组分，(2)贮藏、精炼和在先前浓缩步骤期间形成的副产物以及(3)来自先前浓缩或纯化步骤期间利用的溶剂或试剂的污染物。
[0049](I)的实例包括其他不需要的PUFA ;饱和脂肪酸；固醇，例如胆固醇；维生素；以及环境致污物，诸如多氯联苯(PCB)、聚芳烃(PAH)杀虫剂、有机氯杀虫剂、二噁英和重金属。PCB、PAH、二噁英和有机氯杀虫剂都是高度非极性的组分。
[0050](2)的实例包括来自PUFA产物的同分异构体以及氧化或分解产物，例如，脂肪酸及其衍生物的自氧化聚合产物。
[0051](3)的实例包括可以加入以从进料混合物中移出饱和或单一不饱和脂肪酸的尿素。
[0052]优选地，进料混合物是含PUFA的海洋油(例如，鱼油)，更优选的是包含EPA和/或DHA的海洋油(例如，鱼油)。
[0053]通过本发明的方法制备浓缩的EPA (EE)的典型的进料混合物包含50?75%的EPA (EE),O?10%的DHA (EE)以及包括其他必要的ω-3和ω-6脂肪酸的其他组分。
[0054]通过本发明的方法制备浓缩EPA (EE)的优选的进料混合物包括:55%的EPA (EE),5%的DHA (EE)以及包括其他必要的ω-3和ω-6脂肪酸的其他组分。DHA (EE)比EPA(EE)极性更小。
[0055]通过本发明的方法制备浓缩DHA (EE)的典型的进料混合物包括:55?75%的DHA(EE),O?10%的EPA (EE)以及包括其他必要的ω-3和ω-6脂肪酸的其他组分。
[0056]通过本发明的方法制备浓缩DHA (EE)的优选的进料混合物包括:75%的DHA (ΕΕ)、7%的EPA (EE)以及包括其他必要的ω-3和ω-6脂肪酸的其他组分。EPA (EE)比DHA(EE)极性更大。
[0057]通过本发明的方法制备EPA (EE)和DHA (EE)的浓缩混合物的典型的进料混合物包括:大于33%的EPA (EE)和大于22%的DHA (ΕΕ)。
[0058]典型地，本发明的方法中使用的所有色谱柱的温度大于室温。
[0059]如将理解的是，在大于室温的温度下至少一个色谱柱中，柱的内部对分离方法来说是重要的。因此，典型地，色谱柱里面的含水有机溶剂洗脱液和吸附剂的温度大于室温。当然，可以通过内部机构(例如通过加热洗脱液和/或进料混合物)和/或外部机构(例如通过用任何已知传统机构加热色谱柱的外面)在至少一个色谱柱里面获取所需的温度。
[0060]典型地，通过加热含水有机溶剂洗脱液和/或进料混合物来获取加热后的色谱柱的所需高温。这具有内部加热柱的效果。
[0061]因此，进料混合物通过色谱柱中的至少一个的温度也可以测量为含水有机溶剂洗脱液的温度。
[0062]因此，本发明也提供了从进料混合物中回收多元不饱和脂肪酸(PUFA)产物的色谱分离方法，该方法包括使进料混合物通过含有作为洗脱液的含水有机溶剂的一个或多个色谱柱，
[0063]其中，如本文所定义的，洗脱液的温度高于室温。
[0064]或者，通过加热柱来获取色谱柱中的至少一个的所需温度。使用例如电加热罩、热水套或盘管(coil)或者通过热辐射灯来进行加热。典型地加热一个或多个色谱柱的内部和/或外部。
[0065]可以通过加热柱和/或含水有机溶剂洗脱液和/或进料混合物来获取色谱柱中的至少一个的所需温度。
[0066]典型地，色谱柱中的至少一个的温度大于30°C，优选大于35°C，更优选大于40°C，甚至更优选大于45°C，甚至更优选大于50°C，甚至更优选大于55°C，并且甚至更优选大于57 °C。在某些实施方式中，56 °C的温度是有利的。
[0067]典型地，色谱柱中的至少一个的温度为至多100°C，优选至多95°C，更优选至多900C，甚至更优选至多85°C，甚至更优选至多80°C，甚至更优选至多75°C，并且甚至更优选至多70°C。
[0068]典型地，色谱柱中的至少一个的典型的温度范围为30~100°C、35~95°C、40~90 0C >45 ~85°C、50 ~8(TC、55 ~75? 或者 57 ~7(TC。
[0069]色谱柱中的至少一个的优选的温度范围为40~70°C，优选为50~67°C，更优选56~65°C，并且甚至更优选57~63°C。
[0070]本发明的方法涉及使进料混合物通过一个或多个色谱柱。任何已知的色谱柱可以用于所要求保护的方法。
[0071]一个或多个色谱柱典型地含有吸附剂。色谱分离【技术领域】中已知的常规吸附剂可以用于本发明的方法。当使用多于一个色谱柱时，每个色谱柱可以含有相同的或不同的吸附剂。典型地，当使用多于一个色谱柱时，每个柱含有相同的吸附剂。这种通常使用的材料实例是聚合物珠粒，优选用DVB (二乙烯基苯)成网的聚苯乙烯；和硅胶，优选具有C8或C18烷烃的反相键合的硅胶，特别是C18烷烃的反相键合的硅胶。优选的是C18键合的反相硅胶。本发明的方法中使用的吸附剂优选是非极性的。
[0072]吸附剂固定相材料的形状可以是例如球形或非球形的珠粒，优选为基本上球形的珠粒。这种珠粒的直径典型地为5~500微米，优选为10~500微米，更优选为15~500微米，更优选为40~500微米，更优选为100~500微米，更优选为250~500微米，更加优选为250~400微米，最优选为250~350微米。在一些实施方式中，可以使用的珠粒的直径为5~35微米，典型地为10~30微米，优选为15~25微米。一些优选的粒径多少比过去的模拟和真实移动床方法中使用的珠粒的粒径更大。使用较大颗粒能够使较低压力的洗脱液用于该系统。依次地，这在设备的成本节约、效率和寿命方面上具有优势。已惊奇地发现，大粒径`的吸附剂珠粒可以用于本发明的方法(具有它们的相关优势)，而在分辨率上没有任何损失。
[0073]使用的柱的维度没有特别受限制，并将在一定程度上取决于待纯化的进料混合物的体积。技术人员将能够易于确定适当大小的柱以应用。每个柱的直径典型地为10~1000mm,优选为10?500mm,更优选为25?250mm,甚至更优选50?100mm,并最优选为70?80mm。每个柱的长度典型地为10?300cm,优选为10?200cm,更优选为25?150cm,甚至更优选为70?IlOcm,并更优选为80?100cm。
[0074]本发明的方法中使用的洗脱液是含水有机溶剂。
[0075]含水有机溶剂典型地包括水以及一种或多种醇、醚、酯、酮或腈或者其混合物。
[0076]醇溶剂为本领域技术人员所众所周知。醇典型地为短链醇。醇的化学式典型地为R0H，其中，R是直链或支链Cl?C6烷基。Cl?C6烷基优选为未取代的。醇的实例包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇和叔丁醇。优选甲醇和乙醇。更优选甲醇。
[0077]醚溶剂为本领域技术人员所众所周知。醚典型地为短链醚。醚典型地具有化学式R-O-R'，其中R和R’相同或不同，并且代表直链或支链的C1?C6烷基。C1?C6烷基优选为未取代的。优选的醚包括二乙醚、二异丙醚和甲基叔丁基醚(MTBE)。
[0078]酯溶剂为本领域技术人员所众所周知。酯典型地为短链酯。酯典型地具有化学式R-(C=O)-O-R'，其中R和R’相同或不同，并且代表直链或支链的C1?C6烷基。优选的酯包括乙酸甲酯和乙酸乙酯。
[0079]酮溶剂为本领域技术人员所众所周知。酮典型地为短链酮。酮典型地具有化学式R-(C=0)-R’，其中R和R’相同或不同，并且代表直链或支链的C1-C6烷基。C1-C6烷基优选为未取代的。优选的酮包括丙酮、甲乙酮和甲基异丁基酮(MIBK)。
[0080]腈溶剂为本领域技术人员所众所周知。腈典型地为短链腈。腈典型地具有化学式R-CN，其中，R代表直链或支链的C1?C6烷基。C1?C6烷基优选为未取代的。优选的腈包括乙腈。
[0081]典型地，含水有机溶剂是含水醇或含水乙腈。
[0082]含水有机溶剂优选为含水甲醇或含水乙腈。更优选含水甲醇。
[0083]典型地，洗脱液不是超临界状态。典型地，洗脱液是液体。
[0084]典型地，整个设备中的洗脱液的平均水与有机溶剂的比例，例如水:甲醇比例，为
0.1:99.9?12:88体积份，优选为0.25:99.75?10:90体积份，并更优选为0.5:99.5?9:91体积份。在一些实施方式中，整个设备中的洗脱液的平均水与有机溶剂的比例，例如水:甲醇比例，优选为0.1:99.9?9:91体积份，更优选为0.25:99.75?7:93体积份，甚至更优选为0.5:99.5?6:94体积份。在其他实施方式中，整个设备中的洗脱液的平均水与有机溶剂的比例，例如水:甲醇比例，优选为4:96?12:88体积份，优选为6:94?10:90体积份，优选为7:93?9:91体积份，甚至优选为7.5:92.5?8.5:91.5体积份。
[0085]当含水有机溶剂是含水乙腈时，洗脱液典型地含有至多30wt%的水，余量为乙腈。优选地，洗脱液含有5?25wt%的水，余量为乙腈。更优选地，洗脱液含有10?20wt%的水，余量为乙腈。甚至更优选地，洗脱液含有15?25wt%的水，余量为乙腈。
[0086]典型地，基于水和有机溶剂的总重量，洗脱液含有5wt%的水或更多。优选地，洗脱液含有6wt%的水或更多，更优选7wt%的水或更多，甚至更优选约8wt%的水。因此,洗脱液典型地含有5?15wt%的水,优选6?13wt%的水,更优选7?llwt%的水,甚至更优选
7.5?9.5wt%的水，甚至更优选7.5?8.5wt%的水。有利地，此增加的水含量提高了存在于进料混合物中的密切相关组分的分辨率。增加的水含量的洗脱液可以在某些环境下需要较大体积的正使用的洗脱液。在实践中，这通过将进料混合物通过的色谱柱中的至少一个加热至大于室温的温度，优选通过将洗脱液加热至大于室温的温度而进行弥补(offset)。以此方式加热柱和/或洗脱液减少需要使用的溶剂量。
[0087]任何已知的色谱设备均可以用于本发明的方法目的，只要它涉及使进料混合物通过一个或多个含有作为洗脱液的含水有机溶剂的色谱柱，其中，进料混合物通过的色谱柱中的至少一个的温度大于室温。
[0088]在模拟或移动床色谱设备进行本发明的方法的每个分离步骤。
[0089]本发明的方法中使用的色谱柱数不特别受限制。在某些实施方式中，可以使用单一色谱柱。因此，这种实施方式典型地涉及单一固定柱。
[0090]在其他的实施方式中，使用多于一个色谱柱。这可以涉及使进料混合物通过两个或更多个串联或并联布置的可相同或不同的色谱柱。在此实施方式中使用的柱数不特别受限制，但是典型地不超过三十个柱。
[0091]使用多个色谱柱的一个【具体实施方式】是模拟或真实移动床色谱。
[0092]因此，本发明的方法典型地包括引入进料混合物到具有含有作为洗脱液的含水有机溶剂的多个连接的色谱柱的一个或多个模拟或真实移动床色谱设备中，其中，多个连接的色谱柱中的至少一个的温度大于室温。
[0093]典型地，基本上所有连接的色谱柱的温度大于室温。优选地，所有连接的色谱柱的温度大于室温。
[0094]任何已知的模拟或真实移动床色谱设备均可以用于本发明的方法的目的，只要设备按照本发明的方法使用。如果依照本发明的方法进行配置，US2985589、US3696107、US3706812、US3761533、FR-A-2103302、FR-A-2651148、FR-A-2651149、US6979402、US5069883和US4764276中描述的这些设备都可以使用。
[0095]在一个实施方式中，该方法包括步骤:
[0096](i)在具有含有作为洗脱液的含水有机溶剂的多个连接的色谱柱的模拟或真实移动床色谱设备中的第一分离步骤中，纯化进料混合物以获得中间产物；以及(ii )在使用具有含有作为洗脱液的含水有机溶剂的多个连接的色谱柱的模拟或真实移动床色谱设备的第二分离步骤中，纯化(i )中获得的中间产物以获得PUFA产物；
[0097]其中，第一分离步骤中的多个连接的色谱柱中的一个或多个的温度和/或第二分离步骤中的多个连接的色谱柱中的一个或多个的温度大于室温；并且其中，
[0098](a)在同一色谱设备上依次进行第一和第二分离步骤，在第一和第二分离步骤之间回收中间产物并且在第一和第二分离步骤之间调节在色谱设备中的方法条件，使得在每个分离步骤中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离；或者
[0099](b)在单独的第一和第二色谱设备上分别进行第一和第二分离步骤，从第一分离步骤中所获得的中间产物引入到第二色谱柱中，并且在每个分离步骤中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。
[0100]在此实施方式中，术语“模拟或真实移动床色谱设备”典型地是指多个连接的色谱柱，该多个连接的色谱柱含有作为洗脱液的含水有机溶剂，并且具有进料混合物流的一个或多个注入点、水和/或有机溶剂的一个或多个注入点、从所述多个连接的色谱柱中能够收集液体的提余物取出流、来自所述多个连接的色谱柱的提取物流和提余物流，由所述提取物流和提余物流能够收集液体。
[0101]在此实施方式中使用的色谱设备具有含有作为洗脱液的含水有机溶剂的单一列的串联连接的色谱柱。典型地，每个色谱柱连接到设备中与该柱相邻的两个柱。因此，来自该列中的给定柱的输出连接到该列中的相邻的柱的输入，相对于该列中的洗脱液的流动是下游。因此，洗脱液可以绕着连接的色谱柱的列流动。典型地，没有色谱柱连接到该设备中的不相邻的柱。
[0102]如本文所使用的，术语“不相邻”是指在例如相同设备中，由一个或多个柱，优选3个或更多个柱，更优选5个或更多个柱，最优选约5个柱分开的柱。
[0103]典型地，在此实施方式中，每个设备仅具有进料混合物的一个注入点。在一个实施方式中，每个设备仅具有含水有机溶剂洗脱液的一个注入点。在另一个实施方式中，每个设备具有水和/或有机溶剂的两个或更多个注入点。
[0104]术语“提余物”为本领域技术人员所众所周知。在真实和模拟移动床色谱的上下文中，它是指与固体吸附剂相相比随液体洗脱液相移动更迅速的组分的流。因此，与进料流相比，提余物流典型地富含极性较大的组分并缺乏极性较小的组分。
[0105]术语“提取物”为本领域技术人员所众所周知。在真实和模拟移动床色谱的上下文中，它是指与液体洗脱液相相比随固体吸附剂相移动更迅速的组分的流。因此，与进料流相比，提取物流典型地富含极性较小的组分并缺乏极性较大的组分。
[0106]在此实施方式中，每个设备中使用的柱数不特别受限制。技术人员将能够易于确定适当的柱数以使用。柱数典型地为4个或更多个，优选为6个或更多个，更优选为8个或更多个，例如4、5、6、7、8、9或10个柱。在优选的实施方式中，使用5个或6个柱，更优选6个柱。在另一个优选的实施方式中，使用7个或8个柱,更优选8个柱。典型地,有不多于25个柱，优选不多于20个柱，更优选不多于15个柱。
[0107]在此实施方式中，第一和第二分离步骤中使用的色谱设备典型地含有相同的柱数。对于某些应用，它们可以具有不同的柱数。
[0108]在此实施方式中，第一和第二分离步骤中使用的色谱设备中的柱典型地具有相同的维度，但对于某些应用，可以具有不同的维度。
[0109]柱的流速受限于一系列柱中的最大压力并且取决于柱的维度和固体相的粒径。本领域技术人员将能够易于建立每个柱维度的所需流速以确保充分解吸。直径较大的柱一般将需要较高的流动以保持穿过柱的线性流动。
[0110]在此实施方式中，对于上面所概述的典型的柱大小，典型地，进入第一分离步骤中使用的色谱设备的洗脱液的流速为I?4.5L/min，优选为1.5?2.5L/min。典型地，来自第一分离步骤中使用的色谱设备的提取物的流速为0.1?2.5L/min，优选为0.5?2.25L/min。在来自第一分离步骤的提取物的一部分循环回到第一分离步骤的中使用的设备的实施方式中，循环的流速典型地为0.7?1.4L/min，优选为约lL/min。典型地，来自第一分离步骤中使用的色谱设备的提余物的流速为0.2?2.5L/min，优选为0.3?2.0L/min。在来自第一分离步骤的提余物的一部分循环回到第一分离步骤中使用的设备的实施方式中，循环的流速典型地为0.3?1.0L/min，优选为约0.5L/min。典型地，进料混合物引入到第一分离步骤中使用的色谱设备中的流速为5?150mL/min,优选为10?100mL/min,更优选为20 ?BOmT ,/mi η。[0111]在此实施方式中，对于上面所概述的典型的柱大小，典型地，进入第二分离步骤中使用的色谱设备的洗脱液的流速为I?4L/min，优选为1.5?3.5L/min。典型地，来自第二分离步骤中使用的色谱设备的提取物的流速为0.5?2L/min，优选为0.7?1.9L/min。在来自第二分离步骤的提取物的一部分循环回到第二分离步骤中使用的设备的实施方式中，循环的流速典型地为0.6?1.4L/min,优选为0.7?1.lL/min,更优选为约0.9L/min。典型地，来自第二分离步骤中使用的色谱设备的提余物的流速为0.5?2.5L/min，优选为
0.7?1.8L/min,更优选为约1.4L/min。在来自第二分离步骤的提余物的一部分循环回到第二分离步骤中使用的设备的实施方式中，循环的流速典型地为0.3?1.0L/min，优选为约 0.5L/min。
[0112]如技术人员将理解的，经由各种提取物流和提余物流所收集或移出的液体的速率的参数是指一段时间中移出的液体体积，典型地为L/min。相似地，液体循环回到设备，典型地回到设备中的相邻的柱的速度的参考是指一段时间中循环的液体体积，典型地为L/min。
[0113]在此实施方式中，优选真实移动床色谱。
[0114]步进时间(step time),即切换进料混合物和洗脱液的注入点与所收集的懼分的各种取出点之间的时间，不特别受限制，并且将取决于所使用的柱数和维度以及通过设备的流速。技术人员将能够易于确定合适的步进时间以用于本发明的方法。步进时间典型地为100?1000秒，优选为200?800秒，更优选为250?750秒。在一些实施方式中，合适的步骤时间为100?400秒，优选为200?300秒，更有优选为约250秒。在其他实施方式中，合适的步进时间为600?900秒，优选为700?800秒，更优选为约750秒。
[0115]在此实施方式中，本发明的方法包括第一或第二分离方法。
[0116]这两个步骤可以易于在单一色谱设备上进行。因此，在一个实施方式中，(a)第一和第二分离步骤依次在同一色谱设备上进行，在第一和第二步骤之间回收中间产物并且在第一和第二分离步骤之间调节色谱设备中的方法条件，使得在每个分离步骤中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。此分离方法的优选实施方式如图1Oa所示。因此，第一分离步骤(左手侧)在具有8个柱的SMB设备上进行。在第一和第二分离步骤之间，中间产物回收到例如容器中，调节色谱设备中的方法条件，使得在每个分离步骤中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。然后，第二分离步骤(右手侧)在具有8个柱的SMB设备上进行。
[0117]在实施方式(a)中，调节方法步骤通常是指整体上调节设备中的方法条件，即物理调节设备使得条件不同。它不是指简单地再次引入中间产物回到方法条件可能碰巧不同的相同设备的不同部分中。
[0118]或者，第一和第二分离色谱设备可以用于第一和第二分离步骤。因此，在另一个实施方式中，(b)第一和第二分离步骤分别在单独的第一和第二色谱设备上进行，来自第一分离设备的中间产物引入到第二色谱设备中，并且在每个分离步骤中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。
[0119]在实施方式(b)中，两个分离步骤可以依次进行或同时进行。
[0120]因此，在两个分离步骤依次进行的情况下的实施方式(b)中，第一和第二分离步骤依次分别在单独的第一和第二色谱设备上进行，在第一和第二分离步骤之间回收中间产物并且调节第一和第二色谱设备中的方法条件，使得在每个分离步骤中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。此分离方法的优选实施方式如图1Ob所示。因此，第一分离步骤(左手侧)在具有8个柱，一至八，的SMB设备上进行。在第一和第二分离步骤之间，中间产物回收到例如容器中，然后引入到第二分离SMB设备中。第二分离步骤(右手侧)在具有8个柱，九至十六，的第二分离SMB设备上进行。调节两个色谱设备中的方法条件，使得在每个分离步骤中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。
[0121]在两个分离步骤同时进行的情况下的实施方式(b)中，第一和第二分离步骤同时在单独的第一和第二色谱设备上进行，在第一和第二分离步骤之间将中间产物引入到第二分离步骤中使用的色谱设备中，并且调节第一和第二色谱设备中的方法条件，使得在每个分离步骤中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。此分离方法的优选实施方式如图1Oc所示。因此，第一分离步骤(左手侧)在具有8个柱，一至八，的SMB设备上进行。然后，第一分离步骤中获得的中间产物引入到第二分离步骤中使用的第二分离色谱设备中。中间产物可以直接地或例如经由容器而间接地从第一分离步骤送到第二分离步骤。第二分离步骤(右手侧)在具有8个柱，九至十六，的第二分离SMB设备上进行。调节两个色谱设备中的方法条件，使得在每个分离步骤中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。
[0122]在两个分离步骤同时进行的情况下的实施方式(b)中，洗脱液单独地在两个单独的色谱设备中循环。因此，除了在第二分离步骤中纯化并引入到第二分离步骤中使用的色谱设备中的中间产物中可作为溶剂存在的洗脱液，在两个单独的色谱设备之间不共用洗脱液。在第一和第二分离步骤中使用的两个单独的色谱设备之间不共用色谱柱。
[0123]在此实施方式中，在第一分离步骤中获得中间产物之后，在第二分离步骤中纯化中间产物之前，可以部分地或全部地移出含水有机溶剂洗脱液。或者，可以在第二分离步骤中纯化中间产物，而不移出任何存在的溶剂。
[0124]如上所提及的，在此实施方式中，在每个分离步骤中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。在实施方式(a)中，在第一和第二分离步骤之间调节两个分离步骤中使用的单一 SMB设备的方法条件，使得在每个分离步骤中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。在实施方式(b)中，设置第一和第二分离步骤中使用的两个单独的色谱设备中的方法条件，使得在每个分离步骤中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。
[0125]因此，在此实施方式中，改变第一和第二分离步骤中的方法条件。改变的方法条件可以包括:例如，使用的柱的大小、使用的柱数、柱中使用的填料、SMB设备的步进时间、设备的温度、分离步骤中使用的洗脱液或设备中使用的流速，特别是经由提取物流或提余物流所收集的液体的循环速率。
[0126]优选地，在此实施方式中，可以改变的方法条件是分离步骤中使用的洗脱液的水与有机溶剂的比例和/或经由分离步骤中的提取物流或提余物流所收集的液体的循环速率。这两个选项在下面进行更详细的讨论。
[0127]在此实施方式中，与进料混合物相比，第一分离步骤中获得的中间产物典型地富含PUFA产物。
[0128]在此实施方式中，第一分离步骤中获得的中间产物然后引入到第二分离步骤中使用的色谱设备。
[0129]在此实施方式中，典型地收集中间产物作为来自第一分离步骤中使用的色谱设备的提余物流或提取物流。[0130]典型地，在此实施方式中，收集中间产物作为第一分离步骤中的提余物流，并且收集PUFA产物作为第二分离步骤中的提取物流。因此，第一分离步骤中收集的提余物流用作第二分离步骤中的进料混合物。第一分离步骤中收集的提余物流典型地含有I3UFA产物和极性较大的组分。
[0131]或者，在此实施方式中，收集中间产物作为第一分离步骤中的提取物流，并且收集PUFA产物作为第二分离步骤中的提余物流。因此，第一分离步骤中收集的提取物流用作第二分离步骤中的进料混合物。第一分离步骤中收集的提取物流典型地含有PUFA产物和极性较小的组分。
[0132]在此实施方式中，在每个分离步骤中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。典型地，本发明的方法的每个分离步骤中分离的组分具有不同的极性。
[0133]优选地，在此实施方式中，在第一分离步骤中将PUFA产物与进料混合物的极性较小的组分分离，并且在第二分离步骤中将PUFA产物与进料混合物的极性较大的组分分离。
[0134]典型地，在此实施方式中，(a)来自第一分离步骤中使用的设备的提取物流的一部分循环回到第一分离步骤中使用的设备中；和/或
[0135](b)来自第一分离步骤中使用的设备的提余物流的一部分循环回到第一分离步骤中使用的设备中；和/或
[0136](C)来自第二分离步骤中使用的设备的提取物流的一部分循环回到第二分离步骤中使用的设备中；和/或
[0137](d)来自第二分离步骤中使用的设备的提余物流的一部分循环回到第二分离步骤中使用的设备中。
[0138]优选地，在此实施方式中，(a)来自第一分离步骤中使用的设备的提取物流的一部分循环回到第一分离步骤中使用的设备中；和
[0139](b)来自第一分离步骤中使用的设备的提余物流的一部分循环回到第一分离步骤中使用的设备中；和
[0140](C)来自第二分离步骤中使用的设备的提取物流的一部分循环回到第二分离步骤中使用的设备中；和
[0141](d)来自第二分离步骤中使用的设备的提余物流的一部分循环回到第二分离步骤中使用的设备中。
[0142]在此实施方式中的循环涉及将第一或第二分离步骤中使用的色谱设备外的提取物流或提余物流的一部分进料回到该步骤中使用的设备中，典型地到相邻的柱中。此相邻的柱是在系统中相对于洗脱液的流动为下游的相邻的柱。
[0143]在此实施方式中，经由第一或第二分离步骤中的提取物流或提余物流循环回到该步骤中使用的色谱设备所收集的液体的速率是经由将该流进料回到该步骤中使用的设备中，典型地回到相邻的柱，即在系统中相对于洗脱液流动的下游柱中所收集的液体的速率。
[0144]这可以参照图9中的优选实施方式看出。第一分离步骤中的提取物流的循环速率是从第一分离步骤中使用的色谱设备的柱2的底部所收集的提取物进料到第一分离步骤中使用的色谱设备的柱3的顶部的速率，即进料到第一分离步骤中的色谱设备的柱3的顶部的液体的流速。
[0145]在此实施方式中，第二分离步骤中的提取物的循环速率是在第二分离步骤中使用的色谱设备的柱2的底部所收集的提取物进料到第二分离步骤中使用的色谱设备的柱3的顶部的速率，即进料到第二分离步骤中的色谱设备的柱3的顶部的液体的流速。
[0146]在此实施方式中，典型地通过将该分离步骤中的该流所收集的液体进料到容器中并且然后用泵将来自容器中的该液体抽回到该分离步骤中使用的设备中，典型地到相邻的柱中来影响第一和/或第二分离步骤中的提取物流和/或提余物流的循环。在这种情况下，在第一和/或第二分离步骤中经由具体的提取物或提余物所收集的液体循环速率，典型地回到相邻的柱的速率是用泵将液体从容器抽回到色谱设备中的速率，典型地到相邻的柱中的速率。
[0147]正如技术人员将理解的是，在此实施方式中，经由洗脱液流和原料流引入到色谱设备的液体的量与从该设备中移出并循环回到设备中的液体的量平衡。
[0148]因此，在此参照图9的实施方式中，对于提取物流，进入在第一和第二分离步骤中使用的色谱设备中洗脱液(解吸剂)的流速(D)等于在该分离步骤中经由提取物流所收集的液体积聚到容器中的速率(El和E2)加上将提取物循环回到该具体分离步骤中使用的色谱设备中的速率(D-EI和D-E2)。
[0149]在此实施方式中，对于来分离步骤的提余物流，将提取物循环回到该具体分离步骤中使用的色谱设备的速率(D-E1和D-E2)加上原料引入到该具体分离步骤中使用的色谱设备中的速率(F和Rl)等于经由该具体分离步骤中的提余物流所收集的液体积聚到容器中的速率(Rl和R2)加上提余物循环回到该具体分离步骤中使用的色谱设备中的速率(D+F-E1-R1和 D+R1-E2-R2)。
[0150]在此实施方式中，来自色谱设备的具体提取物流或提余物流所收集的液体积聚到容器中的速率也可以被认为是移出来自该色谱设备的该提取物流或提余物流的净速率。
[0151]典型地，在此实施方式中，调节经由第一分离步骤中的提取物流和提余物流所收集的液体循环回到该分离步骤中使用的设备中的速率，使得在每个分离步骤中PUFA产物可以与进料混合物的不同组分分离。
[0152]典型地，在此实施方式中，调节经由第二分离步骤中的提取物流和提余物流所收集的液体循环回到该分离步骤中使用的设备中的速率，使得在每个分离步骤中PUFA产物可以与进料混合物的不同组分分离。
[0153]优选地，在此实施方式中，调节经由每个分离步骤中的提取物流和提余物流所收集的液体循环回到该分离步骤中使用的设备中的速率，使得在每个分离步骤中PUFA产物可以与进料混合物的不同组分分离。
[0154]典型地，在此实施方式中，经由第一分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到第一分离步骤中使用的色谱设备中的速率不同于经由第二分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到第二分离步骤中使用的色谱设备中的速率，和/或经由第一分离步骤中的提余物流所收集的液体循环回到第一分离步骤中使用的色谱设备中的速率不同于经由第二分离步骤中的提余物流所收集的液体循环回到第二分离步骤中使用的色谱设备中的速率。
[0155]改变经由第一或第二分离步骤中的提取物流和/或提取物流所收集的液体循环回到该具体分离步骤中使用的设备中的速率具有改变存在于提取物流和提余物流中的极性较大和极性较小的组分的量的作用。因此，例如，较低的提取物循环速率导致该分离步骤中的较少的极性较小的组分被提余物流携带。较高的提取物循环速率导致较多的极性较小的组分被提余物流携带(carry through)。
[0156]这个可以从例如，图6中所示的本发明的【具体实施方式】看出。经由第一分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到该分离步骤中使用的设备的速率(D-El)将影响在第一分离步骤中的提余物流携带任何组分A的程度(Rl)。
[0157]典型地，在此实施方式中，经由第一分离步骤中的提取物所收集的液体循环回到第一分离步骤中使用的色谱设备的速率比经由第二分离步骤中的提取物所收集的液体循环回到第二分离步骤中使用的色谱设备的速率更快。优选地，从第一分离步骤中收集含有PUFA和极性较大的组分的提余物流并在第二分离步骤中纯化，并且经由第一分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到第一分离步骤中使用的色谱装置中的速率比经由第二分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到第二分离步骤中使用的色谱装置中的速率更快。
[0158]或者，在此实施方式中，经由第一分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到第一分离步骤中使用的色谱装置中的速率比经由第二分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到第二分离步骤中使用的色谱装置中的速率更慢。
[0159]典型地，在此实施方式中，经由第一分离步骤中的提余物所收集的液体循环回到第一分离步骤中使用的色谱设备的速率比经由第二分离步骤中的提余物所收集的液体循环回到第二分离步骤中使用的色谱设备的速率更快。优选地，从第一分离步骤中收集含有PUFA和极性较大的组分的提取物流并在第二分离步骤中纯化，并且经由第一分离步骤中的提余物流所收集的液体循环回到第一分离步骤中使用的色谱装置中的速率比经由第二分离步骤中的提余物流所收集的液体循环回到第二分离步骤中使用的色谱装置中的速率更快。
[0160]或者，在此实施方式中，经由第一分离步骤中的提余物流所收集的液体循环回到第一分离步骤中使用的色谱装置中的速率比经由第二分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到第二分离步骤中使用的色谱装置中的速率更慢。
[0161]在此实施方式中，当调节循环速率使得在每个分离步骤中PUFA产物可以与进料混合物的不同组分分离时，每个分离步骤中使用的洗脱液的水与有机溶剂的比例可以相同或不同。典型地，每个分离步骤中使用的洗脱液的水与有机溶剂的比例为0.5:99.5?
5.5:94.5体积份。
[0162]典型地，在此实施方式中，每个分离步骤中使用的洗脱液的水与有机溶剂的比例具有不同的水与有机溶剂的比例。优选地调节每个分离步骤中使用的洗脱液的水与有机溶剂的比例，使得在每个分离步骤中PUFA产物可以与进料混合物的不同组分分离。
[0163]在此实施方式中，每个分离步骤中使用的洗脱液的洗脱能力典型地不同。优选地，第一分离步骤中使用的洗脱液的洗脱能力大于第二分离步骤中使用的洗脱液的洗脱能力。在实践中，这个通过改变每个分离步骤中使用的水和有机溶剂的相对量来获取。
[0164]取决于有机溶剂的选择，它们可以是比水的更强的解吸剂。或者，它们可以是比水更弱的解吸剂。例如，乙腈和醇是比水更强的解吸剂。因此，当含水有机溶剂是含水醇或乙腈时，第一分离步骤中使用的洗脱液中的醇或乙腈的量大于第二分离步骤中使用的洗脱液中的醇或乙腈的量。[0165]典型地，在此实施方式中，第一分离步骤中的洗脱液的水与有机溶剂的比例比第二分离步骤中的洗脱液的水与有机溶剂的比例更低。因此，第一分离步骤中的洗脱液比第二分离步骤中的洗脱液典型地含有更多的有机溶剂，优选醇，更优选甲醇。
[0166]在此实施方式中，当每个分离步骤中使用的含水有机溶剂具有不同的水与有机溶剂的比例时，第一分离步骤中的洗脱液的水与有机溶剂的比例典型地为0:100?5:95体积份，优选为0.1:99.9?2.5:97.5体积份，更优选为0.25:99.75?2:98体积份，且最优选为0.5:99.5?1.5:98.5体积份。在这些实施方式中，第二分离步骤中的洗脱液的水与有机溶剂的比例典型地为2:98?8:92体积份，优选为3:97?7:93体积份，更优选为4:96?6:94体积份，并且甚至更优选为4.5:95.5?5.5:94.5体积份。
[0167]在此实施方式中，当每个分离步骤中使用的含水有机溶剂具有不同的水有机溶剂含量时，第一分离步骤中的洗脱液的水与有机溶剂的比例优选为0.5:99.5?1.5:98.5体积份，并且第二分离步骤中的洗脱液的水与有机溶剂的比例优选为4.5:95:5?5.5:94.5体积份。
[0168]将理解的是，上面所指的每个分离步骤中的水和有机溶剂的比例是全部的色谱设备中的平均比例。
[0169]典型地，在此实施方式中，通过引入水和/或有机溶剂到分离步骤中使用的色谱设备中的一个或多个柱中来控制在每个分离步骤中的洗脱液的水与有机溶剂的比例。因此，例如，为了获取比第二分离步骤中的水与有机溶剂的比例更低的第一分离步骤中的水与有机溶剂的比例，典型地，与第二分离步骤中使用的色谱设备相比，水更缓慢地引入到第一分离步骤中使用的色谱设备中。
[0170]典型地，在此实施方式中，在每个分离步骤中使用的色谱设备中的不同的点处引入基本上纯的有机溶剂和基本上纯的水。这两个流的相对流速将确定色谱设备中的整体溶剂曲线(profile)。或者，在此实施方式中，在每个分离步骤中使用的每个色谱设备中的不同的点处引入不同的有机溶剂/水混合物。那个将涉及两种或更多种不同的有机溶剂/水混合物引入到具体分离步骤中使用的色谱设备中，每种有机溶剂/水混合物具有不同的有机溶剂/水比例。此实施方式中的有机溶剂/水比例的相对流速和相对浓度将确定该分离步骤中使用的色谱设备中的整体溶剂曲线。
[0171]优选地，在此实施方式中，要么(I)收集含有PUFA产物与极性较大的组分的中间产物作为第一分离步骤中的提余物流，并且收集PUFA产物作为第二分离步骤中的提取物流；要么
[0172](2)收集含有PUFA产物和极性较小的组分的中间产物作为第一分离步骤中的提取物流，并且收集PUFA产物作为第二分离步骤中的提余物流。
[0173]选项(I)适合于从进料混合物中纯化EPA。
[0174]选项(I)示于图2。在第一分离步骤中纯化包含PUFA产物(B)和极性较大的组分(C)和极性较小的组分(A)的进料混合物F。在第一分离步骤中，移出极性较小的组分(A)作为提取物流E1。收集PUFA产物(B)和极性较大的组分(C)作为提余物流R1。提余物流Rl是随后在第二分离步骤中纯化的中间产物。在第二分离步骤中，移出极性较大的组分(C)作为提余物流R2。收集PUFA产物(B)作为提取物流E2。
[0175]选项(I)更详细地示于图4。除了示出有机溶剂解吸剂(D)和水(W)引入到每个色谱设备的点，图4和图2相同。有机溶剂解吸剂(D)和水(W)—起组成洗脱液。(D)相典型地是基本上纯的有机溶剂；但在某些实施方式中，它可以是主要包含有机溶剂的有机溶剂/水混合物。(W)相典型地是基本上纯的水；但在某些实施方式中，它可以是主要包含水的有机溶剂/水混合物，例如98%的水/2%的乙腈的混合物。
[0176]选项(I)的进一步图解示于图6。这里没有分离的水注入点，而代替地，在(D)处注入含水有机溶剂解吸剂。
[0177]在此实施方式中，通过改变每个色谱设备中的洗脱液的解吸能力可以辅助提余物流和提取物流的分离。这个可以通过在每个色谱设备中的不同的点处引入洗脱液的有机溶齐IJ (或有机溶剂丰富)组分和水(或水丰富)组分来获取。因此，典型地，在系统中相对于洗脱液的流动，在提取物输出点上游处引入有机溶剂，并且在提取物输出点和引入原料到该区域的点之间引入水。这个示于图4。
[0178]典型地，在此实施方式中，第一分离步骤中使用的含水有机溶剂洗脱液比第二分离步骤中使用的洗脱液含有更多的有机溶剂，即第一步骤中的水与有机溶剂的比例比第二步骤中的水与有机溶剂的比例更低。
[0179]在此实施方式中，可以通过改变经由第一和第二分离步骤中的提取物流和提余物流所收集的液体循环回到该分离步骤中使用的色谱设备中的速率来辅助分离。
[0180]典型地，在此实施方式中，经由第一分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到第一分离步骤中使用的色谱设备中的速率比经由第二分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到第二分离步骤中使用的色谱设备中的速率更快。
[0181]在此实施方式中，相对于洗脱液的流动，典型地在引入进料混合物到第一分离步骤中使用的色谱设备中的点的下游处移出第一分离步骤中的第一提余物流。
[0182]在此实施方式中，相对于洗脱液的流动，典型地在引入进料混合物到第一分离步骤中使用的色谱设备中的点的上游处移出第一分离步骤中的第一提取物流。
[0183]在此实施方式中，相对于洗脱液的流动，典型地在中间产物引入到第二分离步骤中使用的色谱设备中的点的下游处移出第二分离步骤中的第二提余物流。
[0184]在此实施方式中，相对于洗脱液的流动，典型地在中间产物引入到第二分离步骤中使用的色谱设备中的点的上游处移出第二分离步骤中的第二提取物流。
[0185]典型地，在此实施方式中，相对于洗脱液的流动，在移出第一提取物流的点的上游处有机溶剂或含水有机溶剂引入到第一分离步骤中使用的色谱设备中。
[0186]典型地，在此实施方式中，当水引入到第一分离步骤中使用的色谱设备中时，相对于洗脱液的流动，在引入进料混合物的点的上游处但在移出第一提取物流的点的下游处有机溶剂或含水有机溶剂引入到第一分离步骤中使用的色谱设备中。
[0187]典型地，在此实施方式中，相对于洗脱液的流动，在移出第二提取物流的点的上游处有机溶剂或含水有机溶剂引入到第二分离步骤中使用的色谱设备中。
[0188]典型地，在此实施方式中，当水引入到第二分离步骤中使用的色谱设备中时，相对于洗脱液的流动，在引入中间产物的点的上游处但在移出第二提取物流的点的下游处有机溶剂或含水有机溶剂引入到第二分离步骤中使用的色谱设备中。
[0189]选项(2)适合于从进料混合物中纯化的DHA。
[0190]选项(2)示于图3。在第一分离步骤中纯化包含PUFA产物(B)和极性较大的组分(C)和极性较小的组分(A)的进料混合物F。在第一分离步骤中，移出极性较大的组分(C)作为提余物流Rl。收集PUFA产物(B)和极性较小的组分(A)作为提取物流El。提取物流El是随后在第二分离步骤中纯化的中间产物。在第二分离步骤中，移出极性较小的组分(A)作为提取物流E2。收集PUFA产物(B)作为提余物流R2。
[0191]选项(2)更详细地示于图5。除了示出引入有机溶剂解吸剂(D)和水(W)到每个色谱设备中的点，图5和图3相同。如上，(D)相是典型地是基本上纯的有机溶剂，但在某些实施方式中，可以是主要包含有机溶剂的有机溶剂/水混合物。(W)相典型地是基本上纯的水，但在某些实施方式中，可以是主要包含水的有机溶剂/水混合物，例如98%的水/2%的甲醇混合物。
[0192]选项(2)的进一步的图解示于图7。这里没有分离的水注入点，而代替地，在(D)处注入有机溶剂解吸剂。
[0193]典型地，在此实施方式中，经由第一分离步骤中的提余物流所收集的液体再次引入到第一分离步骤中使用的色谱设备中的速率比经由第二分离步骤中的提余物流所收集的液体再次引入到第二分离步骤中使用的色谱设备中的速率更快。
[0194]典型地，在此实施方式中，第一分离步骤中使用的含水有机溶剂洗脱液比第二分离步骤中使用的洗脱液含有更少的有机溶剂，即第一分离步骤中的水与有机溶剂的比例高于第二分离步骤中的更高。
[0195]在此实施方式中，相对于洗脱液的流动，典型地在引入进料混合物到第一分离步骤中使用的色谱设备中的点的下游处，移出第一分离步骤中的第一提余物流。
[0196]在此实施方式中，相对于洗脱液的流动，典型地在引入进料混合物到第一分离步骤中使用的色谱设备中的点的上游处，`移出第一分离步骤中的第一提取物流。
`[0197]在此实施方式中，相对于洗脱液的流动，典型地在引入进料混合物到第二分离步骤中使用的色谱设备中的点的下游处，移出第二分离步骤中的第二提余物流。
`[0198]在此实施方式中，相对于洗脱液的流动，典型地在引入进料混合物到第二分离步骤中使用的色谱设备中的点的上游处，移出第二分离步骤中的第二提取物流。
[0199]典型地，在此实施方式中，相对于洗脱液的流动，典型地在移出第一提取物流的点的上游处，有机溶剂或含水有机溶剂引入到第一分离步骤中使用的色谱设备。
[0200]典型地，在此实施方式中，当水引入到第一分离步骤中使用的色谱设备中时，相对于洗脱液的流动，在引入进料混合物的点的上游处但在移出第一提取物流的点的下游处，水引入到第一分离步骤中使用的色谱设备中。
[0201 ] 典型地，在此实施方式中，相对于洗脱液的流动，在移出第二提取物流的点的上游处，将有机溶剂或含水有机溶剂引入到第二分离步骤中使用的色谱设备中。
[0202]典型地，在此实施方式中，当水引入到第二分离步骤中使用的色谱设备中时，相对于洗脱液的流动，在引入中间产物的点的上游处但在移出第二提取物流的点的下游处，水引入到第二分离步骤中使用的色谱设备中。
[0203]在此实施方式中，第一和第二分离设备中使用的每个模拟或真实移动床色谱设备优选由八个色谱柱组成。这些是指柱I~8。在每个设备中，八个柱串联排列使得柱I的底部连接到柱2的顶部，柱2的底部连接到柱3的顶部…等等…并且柱8的底部连接到柱I顶部。这些连接可以可选地经由保持容器(holding container),随着循环流进入下一个柱中。洗脱液的流动从柱I到柱2到柱3等等通过系统。吸附剂的有效流动从柱8到柱7到柱6等等通过系统。
[0204]这个示于图8。包含PUFA产物(B)和极性较大(C)和极性较小(A)的组分的进料混合物F引入到第一分离步骤中使用的色谱设备中的柱5的顶部。有机溶剂解吸剂引入到第一分离步骤中使用的色谱设备的柱I的顶部。水引入到第一分离步骤中使用的色谱设备的柱4的顶部。在第一分离步骤中，从柱2的底部移出极性较小的组分(A)作为提取物流El。从柱7的底部移出PUFA产物(B)和极性较大的组分(C)作为提余物流Rl。提余物流Rl是随后在第二分离步骤中通过在柱5的顶部处引入到第二分离步骤中使用的色谱设备中进行纯化的中间产物。有机溶剂解吸剂引入到第二分离步骤中使用的色谱设备中的柱I的顶部。水引入到第二分离步骤中使用的色谱设备中的柱4的顶部。在第二分离步骤中，在柱7的底部处，移出极性较大的组分(C)作为提余物流R2。在柱2的底部处，收集PUFA产物(B)作为提取物流E2。
[0205]在此实施方式中，典型地将有机溶剂引入到第一分离步骤中使用的色谱设备的柱I的顶部。
[0206]在此实施方式中，典型地将水引入到第一分离步骤中使用的色谱设备的柱4的顶部。
[0207]在此实施方式中，典型地将有机溶剂引入到第二分离步骤中使用的色谱设备的柱I的顶部。
[0208]在此实施方式中，典型地将有机溶剂引入到第二分离步骤中使用的色谱设备的柱4的顶部。
[0209]在此实施方式中，典型地将进料流引入到第一分离步骤中使用的色谱设备的柱5的顶部。
[0210]在此实施方式中，从第一分离步骤中使用的色谱设备的柱7的底部收集第一提余物流作为中间产物。然后在第二分离步骤中纯化此中间产物并且典型地引入到第二分离步骤中使用的色谱设备的柱5的顶部。在第二分离步骤中纯化之前，第一提余物流可以可选地收集到容器中。
[0211]在此实施方式中，典型地从第一分离步骤中使用的色谱设备的柱2的底部移出第一提余物流。第一提取物流可以可选地收集到容器中并且再次引入到第一分离步骤中使用的色谱设备的柱3的顶部。
[0212]在此实施方式中，典型地从第二分离步骤中使用的色谱设备的柱7的底部移出第二提余物流。
[0213]在此实施方式中，典型地从第二分离步骤中使用的色谱设备的柱2的底部收集第二提取物流。此第二提取物流典型地含有已纯化的PUFA产物。第二提取物流可以可选地收集到容器中并且再次引入到第二分离步骤中使用的色谱设备的柱3的顶部。
[0214]在此实施方式中，所使用的洗脱液典型地为含水醇，优选为含水甲醇。水与醇的比例典型地为0.5:99.5?6:94体积份。
[0215]典型地，在此实施方式中，第一分离步骤中使用的色谱设备中的水与有机溶剂的比例比第二分离步骤中使用的色谱设备中的水与有机溶剂的比例更低。因此，第一分离步骤中的洗脱液典型地比第二分离步骤中使用的洗脱液含有更多的有机溶剂。[0216]在此实施方式中，第一分离步骤中的水与有机溶剂的比例典型地为0.5:99.5?1.5:98.5体积份。第二分离步骤中的水与有机溶剂的比例典型地为2:98?6:94体积份。
[0217]在此实施方式中，虽然图8的实施方式如图1Oa所示配置，但是图1Ob和IOc所示的配置也可以用于此实施方式中。
[0218]此实施方式也示于图9。包含PUFA产物(B)的极性较大的组分(C)和极性较小的组分(A)引入到第一分离步骤中使用的色谱设备中的柱5的顶部。含水有机溶剂解吸剂引入到第一分离步骤中使用的色谱设备中的柱I的顶部。在第一分离步骤中，从柱2的底部移出极性较小组分(A)作为提取物流El。从柱7的底部移出PUFA产物(B)和极性较大的组分(C)作为提余物流R1。提余物流Rl是在第二分离步骤中通过引入到第二分离步骤中使用的色谱设备的柱4的顶部进行纯化的中间产物。含水有机溶剂解吸剂引入到第二分离步骤中使用的色谱设备中的柱I的顶部。在第二分离步骤中，在柱7的底部处，移出极性较大组分(C)作为提余物流R2。在柱2的底部处，收集PUFA产物(B)作为提取物流E2。
[0219]在此实施方式中，典型地将含水有机溶剂引入到第一分离步骤中使用的色谱设备中的柱I的顶部。
[0220]在此实施方式中，典型地将含水有机溶剂引入到第二分离步骤中使用的色谱设备中的柱9的顶部。
[0221]在此实施方式中，典型地将进料流引入到第一分离步骤中使用的色谱设备中的柱5的顶部。
[0222]在此实施方式中，典型地从第一分离步骤中使用的色谱设备的柱7的底部收集第一提余物流作为中间产物。然后，中间产物在第二分离步骤中纯化并典型地引入到第二分离步骤中使用的色谱设备的柱5的顶部。在第二分离步骤中纯化之前，第一提余物流可以可选地收集到容器中。
[0223]在此实施方式中，典型地从第一分离步骤中使用的色谱设备的柱2的底部移出第一提取物流。第一提取物流可以可选地收集到容器中并且部分再次引入到第一分离步骤中使用的色谱设备的柱3的顶部。经由第一分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到第一分离步骤中使用的色谱设备中的速率是用泵将液体从此容器抽到柱3的顶部的速率。
[0224]在此实施方式中，典型地从第一分离步骤中使用的色谱设备的柱7的底部移出第二提余物流。
[0225]在此实施方式中，典型地从第一分离步骤中使用的色谱设备的柱2的底部收集第二提取物流。此第二提取物流典型地含有已纯化的PUFA产物。第二提取物流可以可选地收集到容器中并且部分再次引入到第一分离步骤中使用的色谱设备的柱3的顶部。经由来自第二分离步骤的提取物流所收集的液体循环回到第二分离步骤中使用的色谱设备中的速率是用泵将液体从此容器抽到柱3的顶部中的速率。
[0226]在此实施方式中，所使用的洗脱液典型地为含水醇，优选为含水甲醇。水与醇的比例典型地为0.5:99.5?6:94体积份。
[0227]典型地，在此实施方式中，第一分离步骤中使用的色谱设备中的水与有机溶剂的比例比第二分离步骤中使用的色谱设备中的水与有机溶剂的比例更低。因此，第一分离步骤中使用的洗脱液典型地比第二分离步骤中使用的洗脱液含有更多有机溶剂。
[0228]在此实施方式中，第一分离步骤中的水与有机溶剂典型地为0.5:99.5?1.5:98.5体积份。第二分离步骤中的水与有机溶剂典型地为2:98?6:94体积份。
[0229]在此实施方式中，典型地经由来自第一分离步骤的提取物流所收集的液体循环回到第一分离步骤中使用的色谱设备的速率比经由来自第二分离步骤的提取物流所收集的液体循环回到第二分离步骤中使用的色谱设备的速率更快。在这种情况下，在每个分离步骤中，含水有机溶剂洗脱液典型地基本上相同。
[0230]在此实施方式中，虽然图9的实施方式如图1Oa所示配置，但是示于图1Ob和IOc的配置也用于此实施方式。
[0231]在进一步的实施方式中，本发明的方法包括引入进料混合物到具有含有作为洗脱液的含水醇的多个连接的色谱柱的模拟或真实移动床色谱设备，其中，该设备具有包含第一区域和第二区域的多个区域，每个区域具有来自所述多个连接的色谱柱的提取物流和提余物流，由提取物流和提余物流更够收集液体，并且其中，Ca)从第一区域中的柱中收集含有PUFA产物和极性较大的组分的提余物流并且引入到第二区域中的不相邻的柱中，和/或
(b)从第二区域中的柱中收集含有PUFA产物和极性较小的组分的提余物流并且引入到第一区域中的不相邻的柱中，在每个区域中所述PUFA产物与进料混合物的不同组分分离，其中，多个连接的色谱柱中的至少一个的温度大于55 °C。
[0232]在此进一步的实施方式中，术语“区域”是指多个连接的色谱柱，多个连接的色谱柱含有作为洗脱液的含水醇，并且具有一个或多个进料混合物流的注入点、一个或多个水和/或醇的注入点、来自所述多个连接的色谱柱的提取物流和提余物流，由所述提取物流和提余物流能够收集液体。典型地，每个区域仅具有进料混合物的一个注入点。在一个实施方式中，每个区域仅具有含水醇洗脱液的一个注入点。在另一个实施方式中，每个区域具有两个或更多个水和/或醇的注入点。
[0233]在此进一步的实施方式中，基本上全部的多个连接的色谱柱的温度典型地大于55°C。在此进一步的实施方式中，全部的多个连接的色谱柱的温度典型地大于55°C。
[0234]在此进一步的实施方式中，多个连接的色谱柱中的至少一个的温度典型地为56°C或大于56°C，优选为57°C或大于57°C。
[0235]典型地，在此进一步的实施方式中，多个连接的色谱柱中的至少一个的温度至多IOO0C，优选至多95°C，更优选为至多90°C，甚至更优选为85°C，甚至更优选为80°C，甚至更优选为75°C，并且甚至更优选为70°C。
[0236]典型地，在此进一步的实施方式中，多个连接的色谱柱中的至少一个的温度为56?70°C，优选为56?67°C，更优选为56?65°C，甚至更优选为57?63°C。
[0237]此进一步的实施方式是指如PCT/GB10/002339所描述的，通过引用将这些专利的全文并入本文中。PCT/GB10/002339中列举的优选的方法条件是此进一步的实施方式的优选的方法条件，并且可以将PCT/GB10/002339并入。
[0238]此进一步的实施方式示于图11。包含PUFA产物(B)的进行较大的组分(C)和极性较小的组分(A)的进料混合物F引入到第一区域中的柱5的顶部。含水醇吸附剂引入到第一区域中的柱I的顶部。在第一区域中，从柱2的底部移出极性较小的组分(A)作为提取物流E1。从柱7的底部移出PUFA产物(B)和极性较大的组分(C)作为提余物流。然后，在柱12的顶部处，提余物流Rl引入到第二区域中。含水醇吸附剂引入到第二区域中的柱9的顶部。在第二区域中，在柱14的底部处，移出极性较大的组分(C)作为提余物流R2。在柱10的底部处，收集PUFA产物(B)作为提取物流E2。
[0239]在此进一步的实施方式中，典型地将含水醇引入到第一区域中的柱I的顶部。
[0240]在此进一步的实施方式中，典型地将含水醇引入到第一区域中的柱9的顶部。
[0241]在此进一步的实施方式中，典型地将进料流引入到第一区域中的柱5的顶部。
[0242]在此进一步的实施方式中，典型地从第一区域中的柱7的底部收集第一提余物流并且引入到第二区域中的柱12的顶部。在引入到柱12之前，第一提余物流可以可选地收集到容器中。
[0243]在此进一步的实施方式中，典型地从第一区域中的柱2的底部移出第一提取物流。第一提取物流可以可选地收集到容器中并且部分再次引入到第一区域中的柱3的顶部。经由来自第一区域的提取物流所收集的液体循环回到第一区域中的速率是用泵将液体从此容器抽到柱3的顶部的速率。
[0244]在此进一步的实施方式中，典型地从第二区域中的柱14的底部移出第二提余物流。
[0245]在此进一步的实施方式中，典型地从第二区域中的柱10的底部收集第二提余物流。此第二提取物流典型地含有已纯化的PUFA产物。第二提取物流可以可选地收集到容器中并且部分再次引入到第二区域中的柱11的顶部。经由来自第二区域的提取物流所收集的液体循环回到第二区域中的速率是用泵将液体从此容器抽到柱11的顶部的速率。
[0246]在此进一步的实施方式中，典型地经由来自第一区域的提取物流所收集的液体循环回到第一区域中的速率经由来自第二区域的提取物流所收集的液体循环回到第二区域中的速率更快。
[0247]在此进一步的实施方式中，在每个区域中含水醇洗脱液典型地基本上相同。
[0248]在另外进一步的实施方式中，本发明的方法不同于从进料混合物回收多元不饱和脂肪酸(PUFA)产物的色谱分离方法，该方法包括引入进料混合物到具有含有作为洗脱液的含水醇的多个连接的色谱柱的模拟或真实移动床色谱设备，其中，设备具有至少包含第一区域和第二区域的多个区域，每个区域具有来自所述多个连接的色谱柱的提取物流和提余物流，由所述提取物流和提余物流能够收集液体，并且其中，Ca)从第一区域中的柱中收集含有PUFA产物和极性较大的组分的提余物流并且引入到第二区域中的不相邻的柱中，和/或(b)从第二区域中的柱中收集含有PUFA产物和极性较小的组分的提取物流并且引入到第一区域中的不相邻的柱中，在每个区域中所述PUFA产物与进料混合物的不同组分分离，其中，所有多个连接的色谱柱的温度为40°C或55°C。
[0249]在此另外进一步的实施方式中，术语“区域”如上所定义。
[0250]典型地，在此另外进一步的实施方式中，多个连接的色谱柱中的至少一个的温度为40°C或55°C。优选地，在此另外进一步的实施方式中，在15?55°C下，优选在20?40°C下，甚至更优选在约30°C下，即在室温下进行该方法。
[0251]典型地，在此另外进一步的实施方式中，本发明的方法不同于从进料混合物回收多元不饱和脂肪酸(PUFA)产物的色谱分离方法，该方法包括引入进料混合物到具有含有作为洗脱液的含水醇的多个连接的色谱柱的模拟或真实移动床色谱设备，其中，设备具有至少包含第一区域和第二区域的多个区域，每个区域具有来自所述多个连接的色谱柱的提取物流和提余物流，由所述提取物流和提余物流能够收集液体，并且其中，Ca)从第一区域中的柱中收集含有PUFA产物和极性较大的组分的提余物流并且引入到第二区域中的不相邻的柱中，和/或(b)从第二区域中的柱中收集含有PUFA产物和极性较小的组分的提取物流并且引入到第一区域中的不相邻的柱中，在每个区域中所述PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。
[0252]因此，优选地，在此另外进一步的实施方式中，本发明的方法不同于如PCT/GB10/002339所描述的。
[0253]在又进一步的实施方式中，进料混合物通过的色谱柱中的至少一个的温度不同于40°C或 55°C。
[0254]在此又进一步的实施方式中，进料混合物通过的所有色谱柱的温度典型地不同于40°C或55°C，优选不同于40°C或55°C，更优选不同于39.5?40.5°C或54.5?55.5°C。
[0255]在实践中，本发明的方法一般地将通过计算机来控制。因此，本发明也提供控制如本文所定义的色谱设备的计算机程序，该计算机程序含有代码模块，当计算机程序执行时，代码模块命令设备执行本发明的方法。
[0256]本发明也提供在从进料混合物回收多元不饱和脂肪酸(PUFA)产物的色谱分离方法中一个或多个加热的色谱柱和/或加热的洗脱液和/或加热的进料混合物的应用，该方法包括纯化含有作为洗脱液的含水有机溶剂一个或多个色谱柱中的进料混合物，以(a)减少分离方法中使用的洗脱液的量和/或(b)提高存在于进料混合物中的各种组分的分离方法中的分辨率。
[0257]典型地，加热的色谱柱和/或加热的洗脱液和/或加热的进料混合物中的至少一个加热到如本文所定义的温度。
[0258]典型地，本发明也提供加热的洗脱液在从进料混合物回收多元不饱和脂肪酸(PUFA)产物的色谱分离方法中的应用，该方法包括纯化含有作为洗脱液的含水有机溶剂的一个或多个色谱柱中的进料混合物，以(a)减少分离方法中使用的洗脱液的量和/或(b)提高存在于进料混合物中的各种组分的分离方法中的分辨率。
[0259]本发明也提供从进料混合物回收多元不饱和脂肪酸(PUFA)产物的色谱分离方法，该方法包括使进料混合物通过含有作为洗脱液的含水有机溶剂的一个或多个加热的色谱柱，
[0260]其中，进料混合物通过的色谱柱中的至少一个的温度大于室温，和/或其中，洗脱液和/或进料混合物的温度大于室温，并且
[0261]其中，一个或多个加热的色谱柱能使(a)分离方法中使用的洗脱液的量减少和/或(b)存在于进料混合物中的各种组分的分离方法中的分辨率提高。
[0262]典型地，色谱柱中的至少一个加热到如本文所定义的温度。
[0263]优选地，洗脱液加热到如本文所定义的温度。
[0264]典型地，此方法是如本文所定义的方法。
[0265]典型地，在本发明的方法中，在大于室温的温度下，至少一个色谱柱能使(a)分离方法中使用的洗脱液的量减少和/或(b)存在于进料混合物中的各种组分的分离方法中的分辨率提高。
[0266]本发明也提供包含通过本发明的方法可获得的PUFA产物的组合物。
[0267]下面的实施例对本发明进行说明。[0268]实施例
[0269]实施例1
[0270]根据图11示意性所示的系统，使用真实移动床色谱系统分馏鱼油衍生的原料(55重量°/c^^EPA EE，5重量％的0撤EE)，该真实移动床色谱系统使用键合C18硅胶(粒径300 μ m)作为固定相并使用含水甲醇(90:10w/w甲醇:水)作为洗脱液。如图11所示，15个柱(直径:22mm，长度:300mm)串联连接。解吸剂预加热到60°C的温度，产生约60°C的柱温度。
[0271]操作参数和流速如下。对于下面的条件，EPA EE以高水平的纯度(由GC FAMES测定的99%)生产。EPA产物的GC FAMES迹线如图12所示。
[0272]步进时间:600秒
[0273]原料(F)进料速率:0.5ml/min
[0274]第一区域中的解吸剂进料速率(Dl):33ml/min
[0275]第一区域中的提取物速率(El):7ml/min
[0276]第一区域中的提取物循环速率(Dl-El):26ml/min
[0277]第一区域中的提余物速率(Rl):8ml/min
[0278]第二区域中的解吸剂进料速率(D2):34ml/min
[0279]第二区域中的提取物速率(E2):10ml/min
[0280]第二区域中的提取物循环速率(D2-E2):24ml/min
[0281]第二区域中的提余物速率(R2):8ml/min
[0282]实施例2
[0283]根据图10示意性所示的系统，使用真实移动床色谱系统分馏鱼油衍生的原料(55重量°/c^^EPA EE，5重量％的0撤EE)，该真实移动床色谱系统使用键合C18硅胶(粒径30(^111)作为固定相并使用含水甲醇(98:2￥/^甲醇:水)作为洗脱液。分离I由如图10所示的串联连接的8个柱(直径:76.29mm，长度:914.40mm)组成。隔离并分离来自分离I的中间提余物，并且使用如上述柱的相同顺序进行分离2。解吸剂预加热到40°C的温度，产生约40°C的柱温度。
[0284]操作参数和流速如下。对于下面的条件，EPA EE以高水平的纯度(由GC FAMES测定的98%)生产。EPA产物的GC FAMES迹线如图13所示。
[0285]步进时间:1200秒
[0286]原料(F)进料速率:35ml/min
[0287]第一步骤中的解吸剂进料速率(Dl):2270ml/min
[0288]第一步骤中的提取物速率(El):1320ml/min
[0289]第一步骤中的提取物循环速率(Dl-El):950ml/min
[0290]第一步骤中的提余物速率(Rl):950ml/min
[0291]第二步骤中的解吸剂进料速率(D2):1510ml/min
[0292]第二步骤中的提取物速率(E2):850ml/min
[0293]第二步骤中的提取物循环速率(D2-E2):660ml/min [0294]第二步骤中的提余物速率(R2):670ml/min
[0295]实施例3[0296]在使用含水甲醇洗脱液和C18 二氧化硅吸附剂的固定床色谱设备中测量若干普通脂肪酸的保留时间。因此，测定十八碳四烯酸(SDA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)和油酸(OA)的保留时间，并且改变甲醇的温度和浓度。下面的表显示了绝对保留时间和各种脂肪酸(相对于EPA)的相对保留时间。
[0297]从表1、3和5中的绝对保留时间可以看出，在升高的温度下，整体的运行时间非常短，即在较高温度下具有较低的溶剂消耗和较高的产量。
[0298]从表2、4和6的相对保留时间可以看出，升高的温度相比更密切相关的组分(DHA)对极性较小的杂质(OA)的相对保留时间具有更大的影响。因此，在5%的水下，OA (相对于EPA)的相对保留时间从18°C下的1.91减少到70°C下的1.63，然而DHA (相对于EPA)的相对保留时间从18°C下的1.19减少到70°C下的1.15。当分别使用2%和10%的水进行试验时，看到相似的效果。
[0299]这意味着，使用提高的水含量可以提高密切相关的组分(例如，来自DHA的EPA)的分辨率，但是在较高的温度下进行时具有较低的溶剂消耗和较高的产量。
[0300]表1:各种温度下主要脂肪酸峰的保留时间(分钟)
[0301]使用作为移动相的含有2%水的甲醇和C18 二氧化硅
[0302]
【权利要求】
1.一种从进料混合物回收多元不饱和脂肪酸(PUFA)产物的色谱分离方法，所述方法包括使所述进料混合物通过含有作为洗脱液的含水有机溶剂的一个或多个色谱柱， 其中，所述进料混合物通过的所述色谱柱的至少一个色谱柱的温度大于室温。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述洗脱液不是超临界状态。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，通过加热所述含水有机溶剂洗脱液和/或进料混合物至大于室温的温度来获得大于室温的所述色谱柱的至少一个色谱柱的温度。
4.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述色谱柱中的至少一个色谱柱的温度大于30°C，优选大于40°C。
5.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述色谱柱中的至少一个色谱柱的温度为至多100°c，优选至多70°C。
6.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述色谱柱中的至少一个色谱柱的温度为40~70°C，优选为57~63°C。
7.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述PUFA产物包括至少一种co-3PUFA。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述PUFA产物包括EPA或EPA衍生物和/或DHA或DHA衍生物。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述PUFA产物包括EPA或EPA乙酯(EE)。
10.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，所述方法包括将所述进料混合物引入到具有含有作为洗脱液的含水有机溶剂的多个连接的色谱柱的一个或多个模拟或真实移动床色谱设备中，其中，所述多个连接的色谱柱中的至少一个色谱柱的温度大于室温。
11.根据权利要求10所述的方法，所述方法包括以下步骤: (i)在具有含有作为洗脱液的含水有机溶剂的多个连接的色谱柱的模拟或真实移动床色谱设备中的第一分离步骤中，纯化所述进料混合物以获得中间产物；以及 (ii)在使用具有含有作为洗脱液的含水有机溶剂的多个连接的色谱柱的模拟或真实移动床色谱设备的第二分离步骤中，纯化在(1)中获得的所述中间产物以获得所述PUFA产物； 其中，所述第一分离步骤中的多个连接的色谱柱中的一个或多个色谱柱的温度和/或所述第二分离步骤中的多个连接的色谱柱中的一个或多个色谱柱的温度大于室温；并且其中 (a)在同一色谱设备上依次进行所述第一分离步骤和第二分离步骤，在所述第一分离步骤和第二分离步骤之间回收所述中间产物，并且在所述第一分离步骤和第二分离步骤之间调节所述色谱设备中的方法条件，使得在每个分离步骤中将所述PUFA产物与所述进料混合物的不同组分分离；或者 (b)在单独的第一色谱设备和第二色谱设备上分别进行所述第一分离步骤和第二分离步骤，将从所述第一分离步骤中获得的所述中间产物引入到所述第二色谱设备中，并且在每个分离步骤中将所述PUFA产物与所述进料混合物的不同组分分离。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，所有所述色谱柱的温度都大于室温。
13.根据权利要求10~12中任意一项所述的方法，其中，每个设备具有来自所述多个连接的色谱柱的提取物流和提余物流，由所述提取物流和提余物流能够收集液体。
14.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，基于所述有机溶剂和水的总重量，所述洗脱液含有大于5wt%的水。
15.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述洗脱液是水与醇、醚、酯、酮或腈的混合物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述洗脱液是水与甲醇的混合物。
17.根据权利要求1所述的色谱分离方法，其中，在所述方法包括将所述进料混合物引入到具有含有作为洗脱液的含水醇的多个连接的色谱柱的模拟或真实移动床色谱设备中时，其中，所述设备具有至少包含第一和第二区域的多个区域，每个区域具有来自所述多个连接的色谱柱的提取物流和提余物流，由所述提取物流和提余物流能够收集液体，并且其中，Ca)从所述第一区域中的柱中收集含有所述PUFA产物和极性较大的组分的提余物流并且将所述提余物流引入到所述第二区域中的不相邻的柱中，和/或(b)从所述第二区域中的柱中收集含有所述PUFA产物和极性较小的组分的提取物流并且将所述提取物流引入到所述第一区域中的不相邻的柱中，在每个区域中将所述PUFA产物与所述进料混合物的不同组分分离， 所述多个连接的色谱柱中的至少一个色谱柱的温度大于55°C，优选56°C或更高。
18.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述进料混合物是鱼油原料或鱼油衍生的原料，所述PUFA产物是EPA或EPA乙酯，并且所述PUFA产物以大于90%的纯度，优选大于95%的纯度，更优选大于97%的纯度进行生产。
19.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，在大于室温的温度下的所述至少一个色谱柱能够使(a)所述分离方法中使用的洗脱液的量减少和/或(b)所述进料混合物中存在的各种组分的所述分离方法中的分辨率提高。
20.一个或多个加热的色谱柱和/或加热的洗脱液和/或加热的进料混合物在从进料混合物回收多元不饱和脂肪酸(PUFA)`产物的色谱分离方法中的应用，所述方法包括在含有作为洗脱液的含水有机溶剂的一个或多个色谱柱中纯化所述进料混合物，以(a)减少所述分离方法中使用的洗脱液的量和/或(b)提高在所述进料混合物中存在的各种组分的所述分离方法中的分辨率。
21.根据权利要求20所述的应用，其中，所述一个或多个加热的色谱柱和/或加热的洗脱液和/或加热的进料混合物加热至权利要求4~6中任意一项所述的温度。
【文档编号】B01D15/38GK103826715SQ201280033631
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年7月6日 优先权日:2011年7月6日
【发明者】A·凯利赫, A·莫里森, 阿尼尔·奥斯卡尔, 拉凯什·威拉曼·奈尔雷玛, 阿伯希莱什·阿加瓦尔 申请人:巴斯夫制药（卡兰尼什）公司