分离方法和分离基质的制作方法
【专利摘要】本发明公开将生物分子与液体中的至少一种其它组分分离的方法，其包括使所述液体与包含固体载体和与所述固体载体结合的聚合物链的分离基质接触的步骤。聚合物链包含从结构CH2=CH-L-X的第一个单体衍生的单元，其中L是共价键或包含2-6个碳原子的烷基醚或羟基取代的烷基醚链，和X是磺酸根或膦酸根基团。
【专利说明】分离方法和分离基质
[0001] 本发明的【技术领域】 本发明涉及生物分子的分离，和更具体地涉及蛋白的离子交换分离。本发明还涉及适 合于生物分子的分离的分离基质和涉及制备这样的基质的方法。
[0002] 发明背景 有许多情况需要从液体分离一种化合物，例如污染物或所需的分子。基于电荷-电荷 的相互作用被用于许多领域以捕获并因而分离荷电的或可荷电的化合物。
[0003] 在化学和生物【技术领域】，目标化合物如药物或药物候选物通常需要从来源于生产 过程的污染物质中分离。例如，通过重组宿主细胞的表达产生的蛋白药物或药物候选物将 需要例如从宿主细胞和可能的细胞碎片、其它宿主细胞蛋白、DNA、RNA和源自发酵或细胞培 养液的任何其它化合物中分离。由于其对目标化合物通用性和灵敏性，在许多当前使用的 生物技术纯化方案中，色谱作为至少一个步骤被包括在内。术语色谱包括一系列密切相关 的分离方法，所有这些方法均基于使两个相互不混溶的相接触这一原理。更具体地，目标化 合物被引入流动相，所述流动相与固定相接触。然后目标化合物在其被流动相携带通过系 统时，将经历固定相和流动相之间的一系列相互作用。相互作用利用样品组分的物理或化 学特性的差异。
[0004] 色谱中的固定相包含配体（其为能够与目标化合物相互作用的官能团）已与之偶 联的固体载体。因此，配体将赋予载体进行分离、鉴定和/或纯化感兴趣的分子的能力。液 相色谱方法通常按照分离化合物所利用的相互作用原理命名。例如，离子交换色谱是基于 电荷-电荷的相互作用；疏水相互作用色谱（HIC)利用疏水相互作用；和亲和色谱是基于 特异性的生物亲和性。
[0005] 众所周知，离子交换是基于荷电的目标化合物和相反荷电的色谱基质之间的可逆 相互作用。最常见通过增加盐浓度进行洗脱，但改变PH同样是可能的。离子交换剂分为阳 离子交换剂（其中荷负电的色谱基质用于吸附荷正电的目标化合物）和阴离子交换剂（其 中荷正电的色谱基质用于吸附荷负电的目标化合物）。术语"强"离子交换剂用于在广泛 的PH间隔内荷电的离子交换剂，而〃弱〃离子交换剂在某些pH值下是可荷电的。一种通 常使用的强阳离子交换剂包括磺酸根（sulphonate)配体，称为S基团。在某些情况下，这 样的阳离子交换剂按照由官能团及其连接于载体的接头形成的基团命名；例如SP阳离子 交换剂，其中S基团通过丙基连接于载体。
[0006] 离子交换剂中的荷电基团（通常称为配体）可以不同的方式连接于载体或支持 材料。几篇出版物（US5453186、W02008145270、US8092682、W02012015379、EP2412433 和 EP2412435)描述了荷电单体如何才能接枝聚合到支持材料上，以形成其中配体存在于与支 持物共价连接的悬挂接枝聚合物链（pendant graft polymer chains)上的离子交换剂。然 而，特别是在生物加工领域，对分离基质的需求不断增加，因此存在着对进一步开发基质， 特别是关于提供改进的选择性和容量以及在碱性清洗过程中的稳定性的基质的需求。
[0007] 发明概述 本发明的一个方面是提供一种具有高通量和高选择性的分离方法。这可用如在权利要 求1中定义的方法实现。一个优点是对目标蛋白的高结合容量可与例如单体的和聚集的免 疫球蛋白之间的高选择性一起获得。另外的优点是在升高的离子强度下的高结合容量、快 速的物质传输/结合动力学和高碱稳定性-允许在基质必须被更换之前进行很多次循环 -可得以实现。
[0008] 本发明的另一个方面是提供具有对目标蛋白的高结合容量和高选择性，以及高碱 稳定性的分离基质。这可使用如在权利要求16中定义的基质实现。
[0009] 本发明的第三个方面是提供一种制备具有对目标蛋白的高结合容量和高选择性， 以及高碱稳定性的分离基质的方法。这可采用如在权利要求29中描述的方法实现。
[0010] 本发明的其它合适的实施方案在所附的权利要求书中描述。
[0011] 附图简述 图1显示用烯丙基缩水甘油醚使载体上的羟基烯丙基化的反应流程。
[0012] 图2显示用于接枝的以下单体的混合物：a)乙烯基磺酸（VSA)和乙烯基吡咯烷酮 (VP)、b) 3-烯丙氧基，2-羟基-1-丙烷磺酸（APS)和乙烯基吡咯烷酮和c)甲基丙烯酸 羟乙基酯（HEMA)和乙烯基膦酸（VPA)。
[0013] 图3显示为除去聚集的抗体的理想（实线）选择性曲线和不太理想的（虚线）曲 线。
[0014] 图4显示对VP-VSA原型S67-G1-A100和S67-G1-A200与参照物比较的聚集体除 去选择性曲线。
[0015] 图5显示对VP-VSA原型S50-G1-A25和S50-G1-A50与参照物比较的聚集体除去 选择性曲线。
[0016] 图6显示对VP-VSA原型S50-G2-A25和S50-G3-A25与参照物比较的聚集体除去 选择性曲线。
[0017] 图7显示对VP-VSA原型S50-G4-A200和S67-G1-A200与参照物比较的聚集体除 去选择性曲线。初始的聚集体浓度是7%。
[0018] 图 8 显示对 VP-VSA 原型 S67-G1-A200、S67-G1-A450 和 S50-G4-A200 与参照物比 较的聚集体除去选择性曲线。初始的聚集体浓度是7%。
[0019] 图9显示对VP-VSA原型S77-G1-A200和S77-G1-A450与参照物比较的聚集体除 去选择性曲线。
[0020] 图10显示对VP-VSA原型S80-G1-A200与参照物比较的聚集体除去选择性曲线。
[0021] 图11显示对基于聚二乙烯基苯的VP-VSA原型P63-G1-A200在pH 5. 0下与参照 物比较的聚集体除去选择性曲线。
[0022] 图12显示对基于聚二乙烯基苯的VP-VSA原型P63-G1-A200在pH 5. 25下与参照 物比较的聚集体除去选择性曲线。
[0023] 图13显示蛋白混合物和单克隆抗体在a)参照基质SP Sepharose HP和b)本发 明的VPA-接枝基质上的色谱图。
[0024] 实施方案详述 本发明的一个方面公开一种将生物分子与液体中的至少一种其它组分分离的方法。所 述方法包括使液体与分离基质接触的步骤，所述分离基质包含固体载体和与固体载体结合 的聚合物链，其中聚合物链包含从结构CH 2=CH-L-X的第一个单体衍生的单元，其中L是i) 共价键或ii)烷基醚或羟基取代的烷基醚链（其任何一个包含2-6个碳原子），和X是磺 酸根或膦酸根基团。聚合物链中的片此
【权利要求】
1. 一种将生物分子与液体中的至少一种其它组分分离的方法，所述方法包括使所述液 体与包含固体载体和与所述固体载体结合的聚合物链的分离基质接触的步骤，其中所述聚 合物链包含从结构CH 2=CH-L_x的第一个单体衍生的单元，其中L是共价键或包含2-6个碳 原子的烷基醚或羟基取代的烷基醚链，和X是磺酸根或膦酸根基团。
2. 权利要求1的方法，其中所述生物分子是蛋白、肽或核酸。
3. 权利要求1或2的方法，其中所述生物分子是免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或含免疫 球蛋白的蛋白，如抗体、抗体片段、抗体缀合物或抗体融合蛋白。
4. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述至少其它组分是蛋白，例如宿主细胞蛋白； 蛋白A ;或免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或含免疫球蛋白的蛋白的聚集体。
5. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述液体是来自先前的色谱步骤的洗脱液，所 述色谱步骤例如亲和步骤、离子交换步骤、多峰步骤或疏水相互作用步骤。
6. 权利要求1-4中任一项的方法，其中所述液体是来自分离基质的流通液，所述基质 例如离子交换基质、多峰基质或疏水相互作用基质。
7. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述生物分子是免疫球蛋白、免疫球蛋白片段 或含免疫球蛋白的蛋白，例如抗体、抗体片段、抗体缀合物或抗体融合蛋白且其中至少1%， 例如至少5%或至少10%的所述生物分子呈聚集体的形式。
8. 前述权利要求中任一项的方法，还包括用洗脱缓冲液从所述分离基质洗脱所述生物 分子的步骤。
9. 前述权利要求中任一项的方法，还包括用清洗液，例如包含至少0.1 mol/1 NaOH或 0. 5-2 mol/1 NaOH的碱性清洗液，清洗所述分离基质的步骤。
10. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述聚合物链是共聚物链且还包含从第二个 非荷电单体衍生的单元。
11. 权利要求10的方法，其中第二个非荷电单体是N-乙烯基酰胺。
12. 权利要求10或11的方法，其中所述第二个非荷电单体选自N-乙烯基吡咯烷酮、 N-乙烯基己内酰胺、N-乙烯基甲酰胺和N-乙烯基乙酰胺。
13. 前述权利要求中任一项的方法，其中L是共价键或-CH2-〇-L'-，其中1/是(：2-(；或 C3_C4亚烷基链，其任选地被至少一个羟基取代。
14. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述第一个单体选自乙烯基磺酸盐、乙烯基膦 酸盐和烯丙氧基羟基丙基磺酸盐。
15. 权利要求10-14中任一项的方法，其中在所述共聚物链中，从第一个单体衍生的单 元与从第二个单体衍生的单元的摩尔比是0. 05至5,例如0. 10至2或0. 5至2。
16. -种分离基质，其包含固体载体和与所述固体载体结合的共聚物链，其中所述共聚 物链包含从以下单体衍生的单元： a) 结构CH2=CH-L-X的第一个单体，其中L是共价键或包含2-6个碳原子的烷基醚或 羟基取代的烷基醚链，和X是磺酸根或膦酸根基团；和 b) 第二个非荷电单体。
17. 权利要求16的分离基质，其中L是共价键或-CH2-〇-L' -，其中L'是C2-C4或C3-C4 亚烷基链，其任选地被至少一个羟基取代。
18. 权利要求16或17的分离基质，其中所述至少一个荷电单体选自乙烯基磺酸盐、乙 稀基勝酸盐和稀丙氧基轻基丙基横酸盐。
19. 权利要求16-18中任一项的分离基质，其中所述第二个非荷电单体是N-乙烯基酰 胺。
20. 权利要求16-19中任一项的分离基质，其中所述第二个非荷电单体选自N-乙烯基 吡咯烷酮、N-乙烯基己内酰胺、N-乙烯基甲酰胺和N-乙烯基乙酰胺。
21. 权利要求16-20中任一项的分离基质，其中在所述共聚物链中，从第一个单体衍生 的单元与从第二个单体衍生的单元的摩尔比是0. 05至5,例如0. 10至2或0. 5至2。
22. 权利要求16-21中任一项的分离基质，其中所述基质的离子容量是20-300微摩尔 /ml，例如 20-200 或 20-80 微摩尔 /ml。
23. 权利要求16-22中任一项的分离基质，其中固体载体包含多羟基聚合物，例如多 糖。
24. 权利要求16-23中任一项的分离基质，其中固体载体包含琼脂或琼脂糖。
25. 权利要求16-24中任一项的分离基质，其中固体载体是交联的，例如与羟基烷基醚 交联。
26. 权利要求16-25中任一项的分离基质，其中固体载体是多孔的，例如呈多孔珠或多 孔膜的形式。
27. 权利要求16-26中任一项的分离基质，其中固体载体具有对应于0.5-0. 9,例如 0. 6-0. 8的KD值的孔径，所述KD值用Mw 110 kDa的葡聚糖作为探针分子测量。
28. 权利要求16-27中任一项的分离基质，其中基质具有对应于0. 1-0. 8,例如0. 2-0. 6 的KD值的孔径，所述KD值用Mw 110 kDa的葡聚糖作为探针分子测量。
29. -种制备权利要求16-28中任一项的分离基质的方法，包括以下步骤： a) 提供包含具有可共聚的C=C双键的部分或易于形成游离基的部分的固体载体； b) 使固体载体与包含第一和第二个单体的混合物接触；和 c) 引发基团聚合。
30. 权利要求29的方法，其中步骤c)在使得实现以下的条件下进行：形成包含从所述 第一和第二个单体衍生的单元的共聚物链，并通过用所述C=C双键的共聚合作用或者通过 引发或从易于游离基形成的所述部分的链转移而共价连接至固体载体。
31. 权利要求29或30的方法，还包括在步骤a)之前，用包含可共聚的C=C双键的部分 或易于形成游离基的部分衍生所述固体载体的步骤。
32. 权利要求29-31中任一项的方法，其中所述包含可共聚的C=C双键的部分是烯丙 基，例如稀丙基酿基或稀丙基轻基丙基酿基。
33. 权利要求29-32中任一项的方法，其中所述易于形成游离基的部分包含i)链转移 基团，例如硫醇基或羟基的α位上的氢或ii)引发基团如过氧化物、氢过氧化物、过硫酸盐 或偶氮化合物。
【文档编号】B01J20/26GK104245078SQ201380021764
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年4月22日 优先权日:2012年4月25日
【发明者】汉斯森 J., 罗德里戈 G., E. 塞德曼 T. 申请人:通用电气健康护理生物科学股份公司