本发明涉及生物化学和生物医学工程领域，特别是微流体装置和用于检测生物化学分子的微流体装置。
背景技术：
疾病的延迟诊断是医院的一个主要问题。例如，对多重耐药细菌(MDRB)的延迟诊断可以导致提高的死亡率和发病率，因为这些细菌具有高度的接触传染性并且这些细菌的感染率在大约数小时内成指数地增加。患者由于延迟诊断而进行的治疗和住院也对卫生保健行业造成巨大的经济负担。此外，集中式医院尤其面临巨大的后勤和经济负担，其中通常每天超过300名患者被筛选病原体，如耐甲氧西林(methicillin)的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)病原体。
例如，MRSA感染每年使美国卫生保健系统花费超过200亿美元。快速增加的MRSA感染率进一步加剧了该问题，相比于1995年的22％，所述MRSA感染率占2004年金黄色葡萄球菌感染的60％。在新加坡的公立医院，受MRSA细菌感染的患者在住院期间死亡的可能性是未感染患者的10倍。这些患者还在医院停留4.6倍长的时间并且面临4倍高的医院相关费用。
除拯救生命以外，病原体的快速检测还使得卫生保健人员能够以及时的方式采取缓解措施，如隔离患者并确定有效的治疗方案。
现行表型诊断方法是缓慢的，对于某些疾病来说范围在18–24小时或甚至更长，例如对于结核病来说需约4–6周。这是因为此类表型诊断方法，如用于精确检测MRSA的抗微生物敏感性测试，非常依赖于细菌培养物的生长速率。因此，这些方法通常需要长达1–4天，在此期间，感染率和患者死亡率会显著增加。因此，现有的表型方法需要用检测耐药基因的方法，如聚合酶链式反应(PCR)或实时PCR来补充。即使靶耐药基因的存在可能并不赋予表型耐药性并且将不会检测到新颖的耐药基因，PCR也无疑是用于检测已知的靶耐药基因的快速且灵敏的测定。
然而，考虑到与任何给定的细菌菌种有关的耐药基因的绝对数目，必须以高度多重的方式进行PCR。例如，在MRSA感染的情况下，卫生保健提供者不仅关注主要耐药基因(其为mecA)的存在，而且除此以外，他们还想要确定细菌和种特异性控制基因如16SrRNA和nuc以及其它抗生素耐药基因如ermA、blaZ和msrA的存在。实际上，仅MRSA感染就存在远远超过20种的目标靶基因。
实施正确治疗也是与检测病原体的存在一样关键的任务。例如，传统知识建议在不存在抗生素耐药特征的情况下使用广谱抗生素来治疗MRSA感染。然而，广谱抗生素的使用存在缺点。此外，新的治疗如使用噬菌体需要进一步研究以显示它们在体内环境中起作用。目前，窄谱抗生素被广泛地视为一种用于MRSA感染的可行的治疗选择，条件是使用PCR快速筛选患者的所有相关抗生素耐药基因。
在使用PCR筛选抗生素耐药基因时，出于两个原因，进行多个单重(singleplexed)PCR反应并非一种可行的选择。首先，这显著地增加了每名患者的PCR反应数目，因此限制了可以被同时处理的患者样品的数目。其次，考虑到患者样品(其限于不涉及培养步骤的单个鼻拭子)不得不被分割在几个反应中，测定的灵敏度也会受到不利影响。此外，如上文所述，多个靶基因有待筛选。另一方面，多重PCR将解决这些问题，因为多个抗生素耐药靶基因将在单个PCR反应中被扩增，从而将患者通量有效地增加了多倍。
实时PCR使得能够进行多重检测。然而，所检测的靶基因的数目是低的，通常在1至3个靶标范围，且在一些情况下，为4到5个靶标。低多重性主要归因于光可分离的荧光缀合DNA探针的数目的限制。因此，发射带宽有效地限于500-700nm。此外，在通常连接于DNA探针的5’端的有机荧光团的激发光谱与发射光谱之间存在显著重叠。
可选地，代替实时PCR，终点多重PCR测定也可以是一种可行的选择，因为只需要确定耐药基因的存在或不存在。
多重PCR在单个反应中合并了多个引物对，其中每个引物对扩增某个靶基因。在基因扩增之后是使用DNA结合染料进行的终点检测测定，如凝胶电泳和解链曲线分析，以确认所述靶基因的存在。通常基于相应扩增子的大小(凝胶电泳)或解链温度(解链曲线分析)来检测靶基因。然而，此类检测方法具有有限的特异性，因为两个不同靶基因的扩增子可能具有类似的大小和/或解链温度，或者可选地，大小和解链温度的值可能过于接近而使得扩增子可能不被准确地分辨。此类情况在检测大量靶基因的高度多重测定中极有可能出现。此外，凝胶电泳是极其耗时且劳动密集的。
DNA微阵列被视为一种可行的终点检测测定，其中首先进行多重PCR以生成单链扩增子，之后是扩增子与固定化在芯片上的序列特异性探针的杂交。然而，工作流程是耗时且劳动密集的，其中将芯片与PCR产物培育数小时，之后进行一系列的洗涤步骤。还需要对芯片进行表面处理以将探针固定化到芯片表面上并且确保在培育期间DNA定位于探针样点处。高的设备成本是另一个问题，因为使用机器人技术将探针点样到芯片表面上，并且光学设置加入了用于从一个视野转移到另一个视野以覆盖整个芯片区域的扫描器。
DNA测序是另一种平台技术，其使得能够进行基因组测序和分析以确定是否存在已知的突变或耐药性决定簇。然而，DNA测序仍然是耗时的过程，其可能需要几天，并且在测序速度与可能产生的测序误差之间还存在折衷。虽然DNA纯化是DNA测序的一个关键先导，但它也是快速诊断细菌感染和抗生素耐药性的一个限制因素，因为首先进行过夜培养以获得纯的种特异性细菌菌落，从所述菌落提取DNA。
最后，虽然更新的测序技术可以大幅减少测序时间，但与购买这些机器并运行所述测定相关的成本仍然很高。
因此，需要提供克服或至少改善一个或多个上述缺点的装置和系统。需要检测靶分子的快速、高通量且精确的方法。
技术实现要素：
在第一个方面，提供了一种微流体装置，其包括：多个孔，每个孔具有入口和出口，其中所述入口与一个或多个进入通道流体连通并且所述出口与一个或多个排出通道流体连通，其中所述出口通过出口连接通道连接到所述排出通道并且所述入口通过入口连接通道连接到所述进入通道，其中所述出口连接通道的尺寸被构造成使得所述孔中所包含的液体的表面张力阻止所述液体通过所述出口连接通道被释放。
在第二个方面，提供了一种系统，其包括：如本文所公开的微流体装置；和检测装置，其被布置在所述微流体装置的上方或下方，用于检测在使用期间由所述孔中所包含的可能反应产物发射的信号。
在第三个方面，提供了一种使用如本文所公开的系统从液体样品中检测至少一种靶分子的方法，其中所述方法依序包括：通过以被选择成允许所述液体样品流入到所述多个孔中、同时避免所述液体释放到所述排出通道中的流速，将所述液体样品从包含可能的靶分子的源泵送到进入通道中来用所述液体样品填充多个孔，通过从连接到所述进入通道的真空源抽真空来去除所述进入通道中的过量液体，将密封剂泵送到所述进入通道中，之后将密封剂泵送到所述排出通道中以由此隔离每个孔中的液体样品，和检测由靶分子与检测探针之间的反应产物发射的可能信号。
在第四个方面，提供了如本文所公开的系统在检测耐受至少一种抗细菌剂的细菌中的用途。
附图说明
当结合非限制实施例和附图考虑时，参考具体实施方式将更好地理解本发明，在附图中：
图1a显示根据本公开的一个具体实施例的每个孔的俯视图的图示。图1b显示所公开的微流体装置100中的孔的横截面视图的图示。图1c显示通过包括会聚区域的出口连接通道106连接到排出通道108的孔102的俯视图的图示。
图2显示根据本公开的一个具体实施例的所公开装置的一部分的俯视图的图示。
图3显示根据本公开的一个具体实施例的每个孔102中所加载的分子信标探针150的横截面视图的图示。
图4a显示根据本公开的一个具体实施例的装置100的图示，其中多个孔102被布置在圆形构造中。图4b显示根据本公开的另一个具体实施例的装置100的图示，其中多个孔102被布置在正方形构造中。
图5A显示当使用粘合剂时的所公开的装置的图像。所述图像证明，除了源以及在孔和通道内之外，在使用粘合剂的地方也可以看见荧光。图5B显示具有黑胶带覆盖其中放置粘合剂的区域的所公开装置的图像，证明所述黑胶带有效地降低了先前由所述粘合剂发射的自身荧光。
图6显示根据本公开的一个具体实施例的系统300的图示。
图7a显示根据本公开的一个实施例的光隔离物350的示意图。图7b显示合并了光隔离物350的光学系统的原型的照片。图7c显示来自入射于微流体装置上的多个孔上的光源的呈圆形模式的光束的示意图。
图8显示具有辐射对称的入射于微流体装置的表面上的光的分布。
图9A显示实施例3中所提到的第一装置中的孔2-3中的金黄色葡萄球菌中的mecA、nuc和blaZ基因的自发检测的图像。图9B显示实施例3中所提到的第二装置中的孔5-6中的金黄色葡萄球菌中的mecA、nuc和blaZ基因的自发检测的图像。图9C显示实施例3中所提到的第三装置中的孔8-9中的金黄色葡萄球菌中的mecA、nuc和blaZ基因的自发检测的图像。图9A到9C证实MB探针与靶基因之间的杂交是高特异性的，并且在紧邻预加载有MB探针的孔的相邻孔之间不存在串扰(cross talk)。
图10显示实施例3中的每个靶基因在孔2-3(第一组图)、孔5-6(第二组图)和孔8-9(第三组图)中的荧光的图。图10确认来自对应于目标靶标的探针的荧光读出值显著高于两个非靶标的读出值。
图11A和图11B分别显示实施例4中提到的nuc和mecA基因的检测的图像。杂交信号强度随着nuc和mecA MB探针的加载浓度分别从0.8pmol/孔增加到6.4pmol/孔而增加。
图12显示实施例5中的包含无模板对照的装置与包含阳性对照的装置的荧光的比较的图。在两种装置中的孔2–3、孔5–6和孔8–9中预加载对应于mecA、nuc和blaZ靶基因的序列特异性MB探针。图12显示阳性对照相较于无模板对照于对应孔处具有显著更高的荧光信号。
图13显示实施例6中的使用所公开装置以0ng/μL(无模板对照(NTC))、2×10-5ng/μL、2×10-3ng/μL、2×10-1ng/μL和2×101ng/μL变化的mecA DNA模板浓度的荧光的图。显示mecA靶基因可以在低到2×10-3ng/μL的检测极限下被检测到。
图14显示实施例6中的使用CFX96机器作为金标准比较在实时PCR测定中以0ng/μL(NTC),2×10-11ng/μL、2×10-9ng/μL、2×10-7ng/μL、2×10-5ng/μL、2×10-3ng/μL、2×10-1ng/μL和2×101ng/μL变化的mecA DNA模板浓度的荧光的图。显示mecA靶基因可以在低到2×10-3ng/μL的检测极限下被检测到。因此，所公开装置的检测灵敏度与CFX96机器的检测灵敏度相当。
在附图中，相同的标记表示相同的部件。
具体实施方式
在实施方案中，提供了一种微流体装置，其包括：多个孔，每个孔具有入口和出口，其中所述入口与一个或多个进入通道流体连通并且所述出口与一个或多个排出通道流体连通，其中所述出口通过出口连接通道连接到所述排出通道并且所述入口通过入口连接通道连接到所述进入通道，其中所述出口连接通道的尺寸被构造成使得所述孔中所包含的液体的表面张力阻止所述液体通过所述出口连接通道被释放。
有利地，液体的表面张力(它是液体的固有性质)的使用消除了对现有技术微流体装置中所需的复杂设计的需要。因此，当与现有技术微流体装置比较时，所公开的装置由于其在设计上的简单性而具有经济优势。
如本文所用的术语“流体连通”可以指液体或气体的连通。本文所提到的液体可以是溶液，如水溶液。
在实施例中，液体可以通过一个或多个进入通道被引入到孔中。在一个实施例中，所述装置仅包括一个进入通道，使得液体通过一个进入通道被引入到多个孔中。在另一个实施例中，所述装置包括多个进入通道，使得液体通过一个进入通道被引入到每个孔中。进入通道可以彼此分开或彼此互连。
进入通道通过入口连接通道与孔的入口流体连通。因此，进入通道中的液体可以流动经过入口连接通道以通过入口进入孔中。
在实施例中，可以通过一个或多个排出通道从孔中去除液体。在一个实施例中，所述装置仅包括一个排出通道。在其它实施例中，可以通过一个或多个进入通道从孔中去除液体。在此类实施例中，液体可以被引入到进入通道的一端中并且从进入通道的另一端中被去除。
排出通道通过出口连接通道与孔的出口流体连通。因此，孔中的液体可以通过出口从孔中流出并且通过出口连接通道流入到排出通道中。排出通道可以彼此分开或彼此互连。
有利地，将液体引入到多个孔中是简单且直接的。
根据本公开的一个具体实施例的每个孔的俯视图的图示示于图1a中，而所公开的微流体装置100中的孔的横截面视图的图示示于图1b中。孔102具有入口110和出口104。入口110通过入口连接通道112与进入通道114流体连通。出口104通过出口连接通道106与排出通道108流体连通。液体沿箭头A的方向流动经过孔102。液体可以沿箭头A的方向进入进入通道114。可选地，在所述装置仅包括一个进入通道的情况下，液体可以沿垂直于箭头A的方向进入进入通道114。液体可以沿箭头A的方向从排出通道108中被去除。可选地，在所述装置仅包括一个排出通道的情况下，液体可以沿垂直于箭头A的方向从排出通道108中被去除。
孔的几何形状可以不受特别限制。例如，孔的几何形状可以基本上为圆柱形或基本上为立方形。进入通道或排出通道的几何形状可以不受特别限制。进入通道的几何形状可以基本上为圆柱形或基本上为立方形。在如从图1b所见的实施例中，孔102可以具有盲穴的形状以及平坦且光滑的底表面，并且于所述孔的顶部处分别通过入口连接通道112和出口连接通道106在一侧连接到进入通道114并且在另一侧连接到排出通道108。进入通道114和排出通道108也可以具有平坦的底表面和正方形横截面形状。
如图1b中所图示的，微流体装置可以是包括多个穴的衬底，所述多个穴形成多个孔。所述衬底还可以包括在所述孔的一侧沿所述衬底的长度延伸形成进入通道的槽和在所述孔的另一侧沿所述衬底的长度延伸形成排出通道的槽。所述衬底还可以包括在进入通道或排出通道与所述孔之间的孔口以分别形成入口连接通道或出口连接通道。
在实施例中，进入通道将多个孔的所有入口彼此连接。因此，流动经过进入通道的液体可以依次进入多个孔。例如，液体将进入位于最靠近流体流开始处的孔，之后进入下一个孔，依此类推。
在实施例中，排出通道将多个孔的所有出口彼此连接。因此，流出每个孔的液体进入排出通道。
为了帮助液体的流动，可以施加正压力或负压力。所施加的正压力可以来自借以将液体泵送或注射到所述装置中的泵或注射器。可选地，可以泵送或注射气体以提供正压力。所施加的负压力可以来自真空源。在使用真空源的情况下，可以在真空源之前提供液体捕集器以阻止液体进入真空源。
为了帮助进入通道中的液体的流动，可以在进入通道的一端施加正压力以推进所述液体，或可以在进入通道的另一端施加负压力以抽出所述液体，或相应地施加正压力和负压力两者以使所述液体朝施加负压力的一端移动。为了在进入通道的一端提供正压力，可以将液体泵送到进入通道的该端中。可选地，可以通过注射器将液体注射到进入通道的该端中。液体源可以与进入通道的第一端流体连通。所述液体源可以是填充有液体的室、管或注射器，所述液体被泵送或注射到进入通道的第一端中。气体源可以与进入通道的第一端流体连通。所述气体源可以是填充有气体的注射器，所述气体被注射到进入通道的第一端中以推进所述液体通过进入通道。气体可以是不与液体反应的惰性气体，或可以是空气。为了在进入通道的另一端提供负压力，可以使用例如注射器施加真空。真空源可以与进入通道的第二端流体连通。真空源可以通过液体捕集器连接到进入通道的一端。
在一个实施例中，为了帮助液体从进入通道流入孔中，可以在排出通道处抽负压。
为了帮助液体从孔流入排出通道中，可以在排出通道的一端施加正压力以推进所述液体，或在排出通道的另一端施加负压力以抽出所述液体，或相应地施加正压力和负压力两者以使所述液体朝施加负压力的一端移动。为了在排出通道的一端提供正压力，气体源可以与排出通道的第一端流体连通。气体源可以是填充有气体的注射器，所述气体被注射到排出通道的第一端中以推进所述液体通过排出通道。气体可以是不与液体反应的惰性气体，或可以是空气。为了在排出通道的另一端提供负压力，可以使用例如注射器施加真空。在一个实施例中，可使用例如注射器施加真空。真空源可以与排出通道的第二端流体连通。真空源可以通过液体捕集器连接到排出通道的一端。
当液体通过入口连接通道和入口进入孔时，液体由于出口连接通道的尺寸而被保留在所述孔内。出口连接通道的尺寸可以被构造成阻止液体在填充期间从孔中释放。由于出口连接通道的尺寸的构造，因此孔中所包含的液体在填充期间在出口连接通道处的表面张力高于推进所述液体进入排出通道中的压力。推进所述液体进入排出通道中的压力可以取决于空气与液体之间的压力差，其可能与填充速度、各种通道的尺寸和其它参数有关。填充速度是液体在如本文所述的填充步骤期间的流速。
如本文所用的术语“表面张力”是指液体与出口连接通道的表面之间的分离表面即液体-固体界面处的张力。表面张力表征了液体润湿出口连接通道的表面的能力。当液体润湿表面时，液体基本上扩散整个表面。通常，如果液滴与表面之间的接触角大于90°，则在液体-固体界面处存在高表面张力并且所述液体不从所述孔中被释放到排出通道中。相反，如果液滴与表面之间的接触角小于90°，则在液体-固体界面处存在低表面张力并且所述液体从所述孔中被释放到排出通道中。在一个实施例中，当液体与出口连接通道的表面之间的接触角小于90°时,所述液体在填充期间从所述孔中被释放。
当所述孔中的液体上的压力增加直到所述压力基本上等于出口连接通道处的液体的表面张力时，所述孔可以基本上完全被填充，例如所述孔的体积的90％或95％或99％或100％被填充。然后可以停止将液体引入到所述装置中。在一个实施例中，当所述液体上的压力高于出口连接通道处的液体的表面张力时，液体被释放到排出通道中。
可以通过在进入通道的第一端施加正压力以从进入通道的第二端推出液体来去除进入通道中的过量液体。正压力可以呈泵送或注射的气体形式。可选地，可以在进入通道的第二端施加负压力以抽出所述液体，或相应地施加正压力和负压力两者以使所述液体朝施加负压力的一端移动。可以同样去除排出通道中的任何过量液体。
根据本公开的一个具体实施例的所公开装置的一部分的俯视图的图示示于图2中。液体沿箭头A1的方向流动经过进入通道114并且首先进入孔102。当孔102正在被液体填充时，出口连接通道106的尺寸阻止孔102中的液体排入排出通道108中。当孔102基本上被完全填充时，液体流指向第二个孔102’。在孔102’的填充期间，出口连接通道106’的尺寸阻止孔102’中的液体排入排出通道108中。在孔102’的填充完成后，液体流指向第三个孔102”。输入液体是从一个被填充孔(例如孔102)进入排出通道中，还是继续填充到未填充孔(例如孔102’)中取决于两个孔的相对阻力。相对阻力取决于所公开的微流体装置的设计。在一个实施例中，由于出口连接通道的尺寸，因此所有孔中的液体将直到所有孔基本上完全被填充才会进入排出通道中。在另一个实施例中，由于出口连接通道的尺寸和进入通道的尺寸，因此所有孔中的液体将直到所有孔基本上完全被填充才会进入排出通道中。如果出口连接通道的尺寸足够小且进入通道的尺寸足够大，使得对排出所述孔的相对阻力高于对进入下一个孔的相对阻力，则输入液体可以不从被填充孔进入排出通道中，而是可以继续填充下一个孔。相反，如果出口连接通道的尺寸并非足够小，而进入通道的尺寸过窄，使得对排出所述孔的相对阻力低于对进入下一个孔的相对阻力，则可能存在输入液体将在所有孔均被填充之前进入排出通道中的风险。
因此，进入通道的尺寸可以相对于出口连接通道的尺寸被构造成使得在所述孔中所包含的液体通过出口连接通道被释放到排出通道中之前，所有孔基本上完全被填充。进入通道的横截面可以是约0.5mm到1mm×约0.5mm到1mm。进入通道的直径或宽度可以是约0.5mm到1mm、或约0.6mm到1mm、或约0.7mm到1mm、或约0.5mm到0.9mm、或约0.5mm到0.8mm。进入通道的深度可以是约0.5mm到1mm、或约0.6mm到1mm、或约0.7mm到1mm、或约0.5mm到0.9mm、或约0.5mm到0.8mm。在一个实施例中，进入通道的宽度是0.6mm并且进入通道的深度是0.5mm。此外，由于进入通道中的过量液体可能不被利用并去除，因此进入通道的尺寸可以被构造得较小以将液体的浪费减到最少。
相比于进入通道，排出通道的尺寸可以被构造得较大以将被去除的液体或被引入的密封剂的流动阻力减到最小。排出通道的横截面可以是约0.7mm到1.5mm×约0.5mm到1.5mm。排出通道的直径或宽度可以是约0.7mm到1.5mm、或约0.8mm到1.5mm、或约0.9mm到1.5mm、或约1mm到1.5mm、或约1.1mm到1.5mm、或约1.2mm到1.5mm、或约0.7mm到1.4mm、或约0.7mm到1.2mm、或约0.7mm到1mm。排出通道的深度可以是约0.5mm到1.5mm、或约0.6mm到1.5mm、或约0.7mm到1.5mm、或约0.8mm到1.5mm、或约0.9mm到1.5mm、或约0.5mm到1.3mm、或约0.5mm到1.1mm、或约0.5mm到0.9mm。在一个实施例中，排出通道的宽度是1mm并且排出通道的深度是0.7mm。
出口连接通道的尺寸相对于孔的尺寸可以足够小以提供足够的表面张力以阻止液体进入排出通道。如上文所述，相较于进入通道的尺寸，出口连接通道的尺寸可以足够小，以在剩余孔被液体填充之前阻止液体释放到出口连接通道中。出口连接通道的尺寸可以小于进入通道的尺寸。出口连接通道的尺寸或横截面可以是约0.05mm到3mm×约0.05mm到3mm。在出口连接通道具有圆柱形几何形状的情况下，出口连接通道的直径可以是约0.05mm到3mm、或约0.1mm到3mm、或约0.1mm到1.5mm、或约0.2mm到3mm、或约0.2mm到2.5mm、或约0.2mm到2mm、或约0.2mm到1.5mm、或约0.3mm到3mm、或约0.3mm到2.5mm、或约0.3mm到2mm、或约0.3mm到1.5mm、或约0.4mm到3mm、或约0.4mm到2.5mm、或约0.4mm到2mm、或约0.4mm到1.5mm、或约0.5mm到3mm、或约0.5mm到2.5mm、或约0.5mm到2mm、或约0.5mm到1.5mm、或约0.8mm到3mm、或约0.8mm到2.5mm、或约0.8mm到2mm、或约0.8mm到1.5mm、或约0.1mm到1mm、或约0.1mm到0.8mm、或约0.1mm到0.5mm、或约0.1mm到0.4mm、或约0.1mm到0.3mm。在出口连接通道具有矩形几何形状的情况下，出口连接通道的长度可以是约0.05mm到3mm、或约0.1mm到3mm、或约0.1mm到1.5mm、或约0.2mm到3mm、或约0.2mm到2.5mm、或约0.2mm到2mm、或约0.2mm到1.5mm、或约0.3mm到3mm、或约0.3mm到2.5mm、或约0.3mm到2mm、或约0.3mm到1.5mm、或约0.4mm到3mm、或约0.4mm到2.5mm、或约0.4mm到2mm、或约0.4mm到1.5mm、或约0.5mm到3mm、或约0.5mm到2.5mm、或约0.5mm到2mm、或约0.5mm到1.5mm、或约0.8mm到3mm、或约0.8mm到2.5mm、或约0.8mm到2mm、或约0.8mm到1.5mm、或约0.1mm到1mm、或约0.1mm到0.8mm、或约0.1mm到0.5mm、或约0.1mm到0.4mm、或约0.1mm到0.3mm；并且出口连接通道的宽度可以是约0.05mm到3mm、或约0.1mm到3mm、或约0.1mm到1.5mm、或约0.2mm到3mm、或约0.2mm到2.5mm、或约0.2mm到2mm、或约0.2mm到1.5mm、或约0.3mm到3mm、或约0.3mm到2.5mm、或约0.3mm到2mm、或约0.3mm到1.5mm、或约0.4mm到3mm、或约0.4mm到2.5mm、或约0.4mm到2mm、或约0.4mm到1.5mm、或约0.5mm到3mm、或约0.5mm到2.5mm、或约0.5mm到2mm、或约0.5mm到1.5mm、或约0.8mm到3mm、或约0.8mm到2.5mm、或约0.8mm到2mm、或约0.8mm到1.5mm、或约0.1mm到1mm、或约0.1mm到0.8mm、或约0.1mm到0.5mm、或约0.1mm到0.4mm、或约0.1mm到0.3mm。出口连接通道的深度可以是约0.2mm到0.5mm、或约0.3mm到0.5mm、或约0.4mm到0.5mm、或约0.2mm到0.4mm、或约0.2mm到0.3mm。在一个实施例中，出口连接通道的尺寸或横截面是0.2mm×0.2mm。在另一个实施例中，出口连接通道的横截面是0.2mm×0.2mm并且出口连接通道的长度是0.35mm。出口连接通道可以包括将所述孔平稳地连接到出口连接通道的会聚区域。会聚区域可以具有从通过出口连接通道的纵轴到会聚区域的侧壁测量的约30度到60度(例如45度)的角度(角度a)和从所述孔的底部到出口连接通道的底部测量的约40度到70度(例如56度)的角度(角度b)。出口连接通道106的会聚区域图示于图1c中，其中所述出口连接通道的会聚区域相对于侧壁的角度被表示为角度a，其可以是45度，并且所述出口连接通道的会聚区域相对于底部的角度被表示为角度b，其可以是56度。
术语“直径”是指物体的最大长度。对于具有不规则形状的物体来说，直径是所述物体的最长横截面的长度。
所述孔的直径可以是约1mm到4mm、或约1.5mm到4mm、或约1.7mm到4mm、或约2mm到4mm、或约2.2mm到4mm、或约2.5mm到4mm、或约3mm到4mm、或约1mm到3mm、或约1mm到2.5mm、或约1mm到2.2mm、或约1mm到2mm、或约1.5mm到3mm、或约2mm到3mm、或约2mm到2.5mm；并且所述孔的深度或高度可以是约0.5mm到1.5mm、或约0.6mm到1.5mm、或约0.7mm到1.5mm、或约0.8mm到1.5mm、或约0.9mm到1.5mm、或约1mm到1.5mm、或约0.5mm到1mm、或约0.5mm到0.9mm、或约0.5mm到0.8mm、或约0.8mm到1mm。
孔的直径和深度可以被调节以适合微流体装置的应用。在一些情况下，减小孔的体积是有利的。孔的体积可以是约1μL到10μL、2μL到10μL、或约2μL到5μL、或约3μL到5μL。在一个实施例中，可以将孔的直径减小到2mm并且可以将孔的深度减小到1mm以将孔的体积减小到3.1μL。
多个孔可以在约2到超过100个、或约2到100个、或约5到100个、或约10到100个、或约5到50个的范围。在一个实施例中，存在31个孔。因此，所述装置中所包含的总液体体积可以是约30μL到100μL、或约30μL到约90μL、或约40μL到约70μL。在一个实施例中，具有约46μL的总液体体积的所公开的装置中包含10个孔。有利地，所公开的装置的总液体体积可以是现有技术装置中所需的总液体体积的一部分。例如，具有10个孔的所公开的装置的总液体体积是10个常规PCR管中所需的总体积的约20％。可以通过再次引入从进入通道中去除的过量液体来进一步减小总液体体积。总液体体积在这里包括孔的体积和进入通道中的液体的体积。
入口连接通道的尺寸可以被构造成使得液体的表面张力不阻止液体流入到孔中。入口连接通道的尺寸相对于进入通道的尺寸可以足够大，使得液体的表面张力不阻止液体流入到孔中，并且在填充期间孔中的液体不流出。
在实施例中，多个孔仅可通过进入通道和排出通道进入。在实施例中，所述孔可以通过阻止通过进入通道和排出通道的进入来隔离。“隔离”意指将特定的物种或物质与混合物、样品或生物样本隔开。有利地，孔中的液体在隔离后可以例如不会通过蒸发损失到环境中。进一步有利地，在隔离后，每个孔中所含的液体将不会污染其它孔中的液体。还可以减少导致假阳性发射读数的杂散信号发射的出现。在一个实施例中，没有出现假阳性或假阴性。
密封剂可以用于隔离孔中的液体。可以将密封剂引入到进入通道或排出通道中以密封并隔离孔中的液体。可以将密封剂泵送或注射到进入通道的一端或排出通道的一端中。还可通过在进入通道或排出通道的另一端施加真空而将密封剂从密封剂源引入到进入通道的一端或排出通道的一端中。密封剂源可以与进入通道的一端或排出通道的一端流体连通。密封剂源可以是填充有密封剂的管或室。
密封剂可以是可以至少部分地阻断或阻止孔中液体的泄漏以有效地隔离孔中的液体的任何类型的物质。“有效的”意指孔中的液体(包括入口连接通道和出口连接通道中的液体)与孔外部(例如进入通道或排出通道中)的混合物、样品或样本充分隔开。密封剂可以是相比于孔中的液体具有更低的蒸发速率的任何类型的材料。密封剂可以是与孔中的液体不混溶的任何类型的材料。密封剂可以是不允许孔中液体的蒸气通过的任何类型的材料。密封剂可以是蜡、聚合物、明胶、树胶、淀粉或其衍生物。
在一个实施例中，密封剂可以是液体蜡。如本文所用的术语“蜡”包括天然存在的脂肪酸酯，如巴西棕榈蜡(carnauba)、小烛树蜡(candelilla)、蜂蜡等；具有蜡的物理特征的矿物油和其它有机材料，如聚乙烯、石蜡、地蜡等。石蜡通常用于定义通常从衍生自混合基或石蜡基型的矿物油的石油馏分获得的硬质结晶蜡并且可以包括诸如高沸点馏分蜡和微晶蜡的材料。在一个实施例中，液体蜡是来自Bio-Rad Laboratories公司，CA,USA的Chill-outTM液体蜡。
在实施例中，每个孔可以包括检测探针。术语“检测探针”泛指能够结合靶分子的分子，其中“检测探针”可以涵盖固定到载体的探针分子或未固定到载体的探针分子。检测探针可以被固定到包括表面、膜或粒子在内的载体。在一个实施例中，检测探针未被固定到载体。因此可以避免被固定的探针的位阻。
检测探针可以能够通过共价键合、氢键合、静电键合或其它吸引相互作用结合靶分子的至少一部分，例如靶核酸的特定序列，以检测靶分子。在一个实施例中，检测探针可以是结合靶分子的蛋白质，所述靶分子也可以是蛋白质。因此，本实施例中的结合是通过蛋白质-蛋白质相互作用来检测例如蛋白质结构的构象变化。在另一个实施例中，检测探针可以是结合靶分子的核酸，所述靶分子也可以是核酸。因此，本实施例中的结合是通过杂交以检测例如靶核酸的存在或不存在或所述核酸中的单核甘酸突变的存在。靶分子与检测探针之间的反应产物可以发射可以通过检测系统检测的信号。
如本文所用的术语“靶核酸”是指包含可以结合到检测探针的互补区域的序列区域的核酸序列。靶核酸序列可以被扩增并且在与检测探针的互补区域杂交时，可能检测到靶核酸的存在或不存在和靶核酸的定量量。如本申请中所用的术语"杂交"是指两条完全或部分互补的单核酸链以反向平行的取向聚集在一起以形成具有双链区域的稳定结构的能力。该双链结构(有时称为杂交体)的两条组成链被氢键保持在一起。尽管这些氢键最通常在单核酸链上含有碱基腺嘌呤和胸腺嘧啶或尿嘧啶(A和T或U)或胞嘧啶和鸟嘌呤(C和G)的核苷酸之间形成，但碱基配对可以在不是这些"正则"对的成员的碱基之间形成。非正则碱基配对是本领域所熟知的。参见例如The Biochemistry of the Nucleic Acids(Adams等人编辑，1992)。
检测探针可以耦合到用于测量靶标与检测探针的杂交的检测工具，如标记。标记可以是放射性同位素或荧光团。在一个实施例中，每种检测探针可以与不同的荧光团缀合，使得可以区分不同的探针。
在实施例中，检测探针包括DNA或RNA。在其它实施例中，检测探针包括具有发夹环结构的单链多核苷酸，所述发夹环结构能够与样品多核苷酸的一个区域形成双链复合物。在一个实施例中，检测探针是包含荧光团和猝灭剂的分子信标(MB)探针。有利地，MB探针在其使用前不需要任何进一步修饰。进一步有利地，检测测定不需要另外的单价或二价盐或添加剂，如牛血清白蛋白(BSA)。在靶分子不存在下，MB探针保持呈稳定的发夹构象，使得来自荧光团的荧光由于多核苷酸的一端处的荧光团与多核苷酸的另一端处的猝灭剂邻近而被完全猝灭。例如，MB探针的5’端处的6-羧基荧光素(6-FAM)荧光团与3’端处的黑洞猝灭剂-1(BHQ1)邻近猝灭任何荧光。在靶分子存在下，所述探针的一部分与所述靶分子的互补序列杂交，从而导致荧光团与猝灭剂分离并随后导致从荧光团发射荧光。
在实施例中，靶分子包括DNA或RNA。在实施例中，靶分子包括目标基因。在一个实施例中，目标基因可以是赋予针对抗病毒或抗细菌治疗，如用一种或多种抗生素治疗的抗性的基因。在另一个实施例中，目标基因可以是细菌和种特异性对照基因。在一个具体实施例中，目标基因是16SrRNA和nuc。在另一个具体实施例中，目标基因是mecA、ermA、blaZ和msrA。
有利地，在室温(例如30℃)下，检测探针与靶分子之间的反应是基本上瞬时的。目标靶标可以与各自的检测探针杂交，其中在30℃的最佳温度下实现具有微量噪声的信号发射。进一步有利地，不需要探针和靶标的任何培育以产生反应产物。在可能的反应之前或之后也不需要任何洗涤。在需要检测靶基因的存在或不存在的情况下，有利地不需要解链曲线分析和相关设备。
在实施例中，检测探针是冻干的检测探针。有利地，检测探针的冻干避免了对将检测探针固定到载体的需要。当需要去除未结合的检测探针的洗涤步骤时，需要检测探针的固定。然而，在一个实施例中，由于仅在检测探针结合到靶分子时发射信号，因此不需要洗涤步骤。此外，还可以避免对提供检测探针的机器人干预的需要。在引入液体或样品之前，所述孔可以预加载检测探针。被预加载的检测探针可以在每个孔内被冻干。因此，可能的靶分子与孔中预加载的检测探针之间的反应可以在将包含可能的靶分子的样品引入到所述孔中之后瞬时进行。
所述孔可以预加载有平衡基线杂交强度的量的探针。在一个实施例中，所述孔可以预加载有约0.5pmol/孔到7pmol/孔的量的探针。所需探针的浓度可以取决于靶分子。为了增强荧光强度和均匀性，可以将探针的浓度优化。有利地，此类优化在传统的微阵列方法中是不可能的，在传统的微阵列方法中固体载体上的加载能力受到限制。
在实施例中，每个孔包含独特的序列特异性检测探针。每个独特的检测探针可以特异性地结合到不同的靶分子。有利地，每个孔可以能够检测特定的目标靶标，因此，所公开的装置能够检测与孔的数目一样多的靶分子。
在实施例中，靶分子是扩增反应产物。扩增反应通过模板依赖性过程导致核酸分子的浓度相对于其初始浓度的增加。术语“模板依赖性过程”是指涉及引物分子的模板依赖性延伸的过程。扩增方法包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、DNA连接酶链式反应和本领域技术人员所熟知的其它扩增反应。扩增反应的组分包括用于扩增靶核酸的试剂，例如，扩增引物、多核苷酸模板、三磷酸脱氧核糖核苷酸、聚合酶和核苷酸。
在一个实施例中，使用不对称PCR或LATE PCR。不对称PCR优先扩增双链DNA模板中的一条DNA链。有利地，由于通过高度多重的不对称PCR反应扩增靶分子，因此可以实现高通量。进一步有利地，扩增产物不需要任何进一步修饰，即可连接任何官能团或荧光团。
本方法涉及将扩增产物分布到一排孔中，其中由于其中具有序列特异性检测探针的每个孔能够瞬时检测特定的目标靶标，因此可以实现高度的多重性。
在一个实施例中，上文提到的液体是包含靶分子或可能包含靶分子的溶液。所述溶液可以是生物样品，例如面颊拭子，其取自受试者以检测特定基因的存在或不存在。
样品中的靶分子的浓度可以低于0.01ng/μL、或低于0.005ng/μL、或低于0.004ng/μL、或低于0.003ng/μL、或低于0.002ng/μL、或低于0.001ng/μL。
在实施例中，使用密封剂来隔离所述孔中的溶液。在其中不使用密封剂的实施例中，当加热微流体装置时，所述孔中的溶液蒸发。这是因为所述溶液周围的空气促进蒸发。在发生蒸发的情况下，可以降低检测探针与溶液中的靶分子之间的反应产物发射的信号(例如荧光)的强度。荧光强度的衰减可以在低到40℃到50℃的温度下发生。当微流体装置被加热到超过约95℃时，可以观测到密封剂和溶液中形成大量气泡，这不利地影响荧光定量。因此，使用密封剂是有利的。
因此，在实施例中，进入通道与以下的源处于流体连通，所述源包括但不限于连接到进入通道的第一端的真空源或通过液体捕集器连接到进入通道的第一端的真空源、连接到进入通道的第二端的密封剂源、连接到进入通道的第二端的气体源和连接到进入通道的第二端的包含可能的靶分子的源。在实施例中，排出通道与以下的源处于流体连通，所述源包括但不限于连接到排出通道的第一端的真空源或通过液体捕集器连接到排出通道的第一端的真空源和连接到排出通道的第二端的密封剂源。在所有实施例中，进入通道或排出通道与各种源的连接受一个或多个阀控制，所述一个或多个阀可以被单独地控制。所述阀可以是电磁阀或旋转阀。所述阀的控制可以是自动化的，由此促进所述装置内的各种流体的传输。例如，可以促进靶分子自动化递送到各自的孔中用于与序列特异性检测探针杂交。
根据本公开的一个具体实施例的装置100的图示示于图4a中。该实施例中的多个孔被布置在圆形构造中。被扩增的PCR产物202沿进入通道114被引入，依序进入所述孔，即孔102，之后是孔102’等。为了帮助产物202的流动，空气源204在进入通道114的第一端提供空气以推进产物202通过所述通道，而真空源208在进入通道114的第二端提供真空以抽出所述产物通过所述通道。液体移动的一般方向是沿箭头A的方向。真空源208通过液体捕集器210连接到进入通道114的第二端以阻止任何过量液体进入所述真空源。当多个孔102完全被PCR产物202填充时，过量PCR产物从进入通道114中被去除以阻止不同孔之间例如由于预加载的检测探针从一个孔扩散到另一个孔中所致的串扰。进入通道和排出通道两者均被来自液体蜡源206的液体蜡填充以密封孔102中的PCR产物202，由此阻止样品蒸发。源202、204、206和208可以通过具有阀的管道连接到进入通道114或排出通道108。在使用时，PCR产物202通过打开V4和V6被引入。在所述孔完全被填充之后，过量的产物202通过打开V3和V6被去除。液体蜡通过打开V2和V6被引入到进入通道114中以阻止孔102中的产物202的蒸发。液体蜡通过打开V1和V5被引入到排出通道108中。根据本公开的另一个具体实施例的装置100的图示示于图4b中，其中多个孔102被布置在正方形构造中。
靶分子结合到检测探针可以产生发射信号的反应产物。在一个实施例中，靶分子结合到检测探针导致发射荧光。有利地，所公开的装置不需要对装置表面的耗时培育、洗涤或表面修饰。也可以不需要对装置表面进行涂覆，由此避免了来自涂覆材料的任何散射或背景荧光。
根据本公开的一个具体实施例的每个孔102中所加载的分子信标探针150的横截面视图的图示示于图3中。进入通道114可以递送包含特异性靶分子的生物样品，所述特异性靶分子将仅结合与所述靶分子特异性互补的分子信标探针150之一。
对荧光发射的检测的代表是终点PCR检测方法，其中可以确定靶分子的存在或不存在。因此可以避免实时PCR的缺点。
可以在单独的步骤中进行扩增反应以及对扩增产物与检测探针之间的反应产物的检测。有利地，在将扩增产物分布到微流体装置中的多个孔中之前，将扩增产物复制到足够大的拷贝数目。因此，所公开的装置的多重能力仅仅取决于孔的数目。
如本文所述，靶分子可以是赋予对抗细菌治疗的抗性的核酸。
所述装置可以用覆盖材料覆盖以封闭多个孔或通道。所述覆盖材料可以与所述装置中的液体相容。此类覆盖物的一个实施例作为140图示于图1b和图3中。可选地，所述装置可以包含外壳以封闭多个孔或通道。封闭多个孔或通道的材料可以是透明的。在一个实施例中，多个孔或通道被薄的透明胶带覆盖，所述透明胶带例如MicroAmpTM光学粘合膜，它是PCR相容的，不含DNA/RNA/RNase，来自Applied Biosystems,California,USA。所述装置的剩余部分可以由半透明材料或不透明材料制成。
所述装置可以由不抑制检测探针与靶分子结合的材料制成。所述材料可以是聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯、聚乙烯醇、丙烯腈丁二烯苯乙烯或聚苯乙烯。有利地，所述装置可以与市面上发现的常见PCR试剂相容，所述常见的PCR试剂例如来自Qiagen,Netherlands(Taq PCR Master Mix Kit)、Promega,WI,USA(GoTaqHot Start Colorless Master Mix)和Invitrogen,CA,USA(Platinum PCRSuperMix)的PCR主混合物(master mix)。
所述覆盖材料还可以是不透明材料，或另外被半透明材料或不透明材料覆盖。在一个实施例中，不透明材料是黑胶带。有利地，不透明材料减少或阻止背景信号发射，所述背景信号发射可以干扰从检测探针与靶分子之间的反应产物发射的信号。在一个实施例中，用于覆盖多个孔或通道的透明粘合剂是绿色自身荧光源，它可以与检测探针的荧光发射谱带重叠，从而产生所述孔和通道内的假阳性信号。图5A显示所公开装置的图像，其展示在所述图像的底部来自所述源以及其中放置粘合剂的孔和通道内的荧光。图5B显示具有黑胶带覆盖其中放置粘合剂的区域的所公开装置的图像。当比较图5A和5B时，很明显，黑胶带有效地降低了先前由粘合剂发射的自身荧光。
进入通道和排出通道可以通过O形环紧固到微流体装置。
当液体蜡被用作密封剂时，它也可以发射自身荧光。然而，其发射波长是蓝色，因此可以被容易地滤掉。此外，检测探针可以发射低自身荧光到几乎没有自身荧光。
在一个实施方案中，提供了一种系统，其包括所公开的微流体装置。所述系统可以包括检测装置，所述检测装置被布置在所公开的微流体装置的上方或下方，用于检测在使用期间由所述孔中所包含的可能反应产物发射的信号。
所述检测装置可以是光学系统。所述光学系统可以包括光源和滤光器，所述滤光器能够捕捉由检测探针与靶分子的反应产物发射的信号。所述光源可以是紫外-可见(UV-Vis)宽带汞/LED光源，并且所述滤光器可以是激发滤光器、发射滤光器和二向色滤光器，各自具有靶向MB探针的6-FAM荧光团的相容的波段。此类滤光器可以从Semrock公司，New York,USA获得。所述光源可以能够照明微流体装置，使得照相机可以捕捉所发射的可能信号的图像。检测装置中所包括的光源和滤光器还可以能够通过镜头和照相机发射信号以激发反应产物生成荧光。合适的照相机的一个示例是从Point Grey Research公司，Richmond BC,Canada获得的Grasshopper2CCD基红-绿-蓝(RGB)照相机，其具有从Edmund Optics,NJ,USA获得的25-mm聚焦镜头。由所述照相机捕捉的图像可以通过处理程序进行处理。例如，可以使用来自Matlab Image Acquisition Toolbox,The Mathworks公司，MA,USA的定制的图像分析软件。处理程序可以由处理器如计算机执行。有利地，所述光学系统为发射信号如荧光的一次性成像提供了非电动化设置。
所公开的微流体装置中所包含的多个孔可以被布置成与加热元件热连通。所述系统可以包括加热模块，使得可以进行可能的靶分子与检测探针之间的反应产物的终点解链曲线分析。有利地，可以检测靶序列中的单点突变或多点突变。在一个实施例中，如果只需要检测靶基因的存在或不存在，则所述系统不包括加热模块。在不需要解链曲线分析的情况下，也可以检测单核苷酸多态性(SNP)。在一个实施例中，检测探针对SNP敏感，其中相较于完全匹配，所述探针与DNA序列之间的单个碱基对错配产生更低的荧光强度。在该实施例中，所述探针在一个孔(孔A)中可以是冻干的且具有野生型/正常序列，并且在另一个孔(孔B)中可以是具有包含SNP的突变序列的探针。如果扩增产物具有野生型序列，则孔A相较于孔B将记录更高的荧光强度。相反，如果扩增产物具有包含SNP的突变序列，则孔B相较于孔A将记录更高的荧光强度。有利地，缺少加热模块使得所公开的系统是紧凑的且成本有效的。进一步有利地，所公开的系统可以具有与现有技术系统相当的特异性和灵敏度。在微流体装置上直接发生的检测探针与靶分子的终点杂交可以与在实时扩增反应中相同的检测探针的终点杂交具有相当的检测灵敏度。有利地，所公开的系统可以能够检测低到0.002ng/μL的DNA浓度。所公开的系统的特异性可以归因于所用的序列特异性检测探针，因此，不需要解链曲线分析。
加热模块可以是Peltier加热模块。加热模块可以包括风扇、热电(TE)加热器/冷却器(例如来自FerroTec,CA,USA的9501/127/030)和TE控制套件(例如来自FerroTec,CA,USA)。TE控制套件可以包括放大器(例如来自FerroTec,CA,USA的FTA600H-桥式放大器)和温度控制器(例如来自FerroTec,CA,USA的FTC100温度控制器)。TE加热器可以由受温度控制器控制的放大器供能。T-型热电偶(例如5TC-TT-T-40-36,OMEGAEngineering,CT,USA)可以被安装在TE加热器上以测量温度，并且可以用作对温度控制器的反馈。TE加热器与所述孔内部的实际温度之间的温度差可以通过直接测量具有等体积的PCR产物的所述孔内部的温度来校准。
根据本公开的一个具体实施例的系统300的图示示于图6中。来自装备有镜头303的CCD照相机204的光源302将圆锥形光束投射到微流体装置100上。CCD照相机204连接到计算机304。容器206中的液体蜡被提供并且通过管道(未显示)连接到装置100。还提供了容纳PCR产物的管202并且所述管可以通过取样端口310连接到装置100。呈注射泵208形式的真空源与液体捕集器210一起被提供。可以通过由温度控制器308控制的加热器306加热装置100。在使用时，将预加载有MB探针(未显示)的微流体装置100插入到加热器306的顶部上。容纳PCR产物溶液的管202连接到取样端口310并且PCR产物通过控制阀(未显示)和注射器泵208生成的真空被递送到所述孔中。然后，PCR产物通过来自容器206的液体蜡被密封在所述孔中，所述液体蜡填充了微流体装置100的进入通道和排出通道(未显示)两者。根据温度控制器308中预设的程序，加热器306在每个温度散热几分钟，逐步升高所述孔中的PCR混合物的温度。在这几分钟期间，来自光源302的激发光束照明装置100上的所有孔，并且生成的荧光被镜头和CCD照相机捕捉。图像数据然后被传送到计算机用于进一步处理以提供光学检测的结果。
在一个实施例中，从光源生成的光束可以被隔离物封闭以阻止光能损失到环境中。有利地，由此可以促进荧光成像。所述隔离物可以被构造成根据光束的形状的形状。在一个实施例中，所述隔离物是圆锥形并且直接可连接到照相机的镜头。接头可以是螺纹接头。在一个实施例中，所述隔离物具有长度为4mm的C座阳螺纹，所述螺纹的直径为1英寸并且每英寸具有32个螺纹，而所述镜头具有对应的阴螺纹。镜头与微流体装置之间的距离可以被调节成使得到达所述装置的光束足以覆盖多个孔。在一个实施例中，镜头与微流体装置之间的距离可以被调节成使得到达所述装置的光束足以覆盖96孔板。
根据本公开的一个实施例的光隔离物350的示意图示于图7a中。光隔离物350的具有d1直径的阳螺纹312b直接可连接到照相机镜头的对应阴螺纹312a(图6中所示)。镜头与微流体装置之间的距离(h)是约25cm并且光束的直径(d2)是约21.2cm。图7b显示合并了光隔离物350的光学系统的原型的照片。光学系统包括照相机204和光源302，所述光源302通过准直光学镜头303连接到滤光器314。所述光学系统通过C座接口(未显示)直接安装在光隔离物350上方。
入射于微流体装置上的多个孔上的来自具有或不具有隔离物的所述光源的光束可以具有如图7c中所示的圆形模式。入射于所述装置上的光的直径是d2，它是隔离物(在使用时)的直径。由于隔离物具有用于连接到镜头的接头，因此在所述接头下方将不存在任何入射光。因此，在入射光的中央区域将存在具有基本上等于接头的直径的直径d1的暗点。
在实施例中，多个孔以确保入射光在所有孔内都是基本上均匀的模式被布置在微流体装置上。由于入射光的中央区域中存在暗点，因此多个孔可以围绕所述暗点被布置成例如围绕所述暗点的对称模式。所述孔可以被布置成围绕所述暗点的正方形模式或围绕所述暗点的圆形模式。在一个实施例中，多个孔被布置成围绕所述暗点的辐射对称模式。有利地，检测探针的激发可以在所有孔内都是基本上均匀的，因为当被投射在微流体装置的表面上时，来自所述光源的激发光也具有辐射对称分布。这有利地使得能够进行整个装置的一次性成像，由此避免了对进行每个孔的多次扫描的光学扫描器的需要。这极大地降低了所公开的系统的复杂性和成本。所述微流体装置的紧凑的大小也有利地使得所有孔能够在单视野中成像。
图8确认入射于微流体装置的表面上的光的分布具有辐射对称。所述分布具有以(0,0)处的光轴为中心的辐射对称。
所述系统可以包括如上文所述的密封剂源，所述密封剂源可连接到所述装置，而与进入通道的一端或排出通道的一端或进入通道和排出通道的一端流体连通。
所述系统可以包括如上文所述的气体源，所述气体源可连接到所述装置，而与进入通道的一端流体连通。
所述系统可以包括如上文所述的包含可能靶分子的源，所述包含可能靶分子的源可连接到所述装置，而与进入通道的一端流体连通。
所述系统可以包括如上文所述的真空源，所述真空源连接到排出通道的一端或进入通道的一端或进入通道和排出通道的一端。所述系统可以包括真空源，所述真空源通过液体捕集器连接到排出通道的一端或进入通道的一端或进入通道和排出通道的一端，如上文所述。
在一个实施方案中，提供了一种使用本文所公开的系统从液体样品中检测至少一种靶分子的方法，其中所述方法依序包括：通过以被选择成允许所述液体样品流入到所述多个孔中、同时避免所述液体释放到所述排出通道中的流速，将所述液体样品从包含可能的靶分子的源泵送到进入通道中来用所述液体样品填充多个孔，通过从连接到所述进入通道的真空源抽真空来去除所述进入通道中的过量液体，将密封剂泵送到所述进入通道中，之后将密封剂泵送到所述排出通道中以由此隔离每个孔中的液体样品，和检测由靶分子与检测探针之间的反应产物发射的可能信号。
在实施例中，依序进行所述步骤。
所述多个孔可以依序被所述液体样品填充，如本文所述。所述靶分子可以是扩增反应的反应产物，如本文所述。所述扩增反应可以是如本文所述的反应，例如不对称PCR。
在填充步骤期间，可以以被选择为使得在所有孔被填充之前，所述液体样品不进入所述排出通道的流速，将所述液体样品从样品源泵送通过所述进入通道。可以以约10mL/h到120mL/h、或约10mL/h到100mL/h、或约10mL/h到80mL/h、或约10mL/h到60mL/h、或约30mL/h到120mL/h、或约30mL/h到100mL/h、或约30mL/h到80mL/h的流速，将所述液体样品从所述样品源泵送通过所述进入通道，以填充所述孔。在一个实施例中，流速是约10mL/h到100mL/h。在一个实施例中，流速是40mL/h到60mL/h。有利地，流速的范围提供了稳定的填充操作。如果流速高于上限，则填充操作变得不稳定，从而导致一些孔不被填充或不被完全填充。流速的范围可以通过从连接到排出通道的真空源抽真空来实现。
在填充步骤期间，对所述孔中的检测探针的微扰可以补偿检测探针与靶分子的混合物的混合或涡旋的不存在。有利地，微扰对于重构探针并定量从任何给定孔产生的荧光信号可能足够。
在去除步骤期间，可以通过从连接到进入通道的一端的真空源抽真空而从进入通道中去除过量液体。可以从连接到进入通道的另一端的气体源引入气体以帮助去除过量液体。去除步骤的流速可以高于填充步骤的流速。在一个实施例中，可以以140mL/h的流速从进入通道中去除所述液体。在另一个实施例中，可以以约10mL/h到140mL/h、或约10mL/h到120mL/h、或约10mL/h到100mL/h、或约10mL/h到80mL/h、或约30mL/h到140mL/h、或约30mL/h到120mL/h、或约30mL/h到100mL/h、或约50mL/h到140mL/h、或约50mL/h到120mL/h的流速从进入通道中去除所述液体。在一个实施例中，流速是40mL/h到60mL/h。
将密封剂泵送到进入通道中的步骤可以以取决于进入通道的尺寸的流速进行。将密封剂泵送到进入通道中的步骤可以以约10mL/h到40mL/h、或约10mL/h到30mL/h、或约20mL/h到40mL/h、或约20mL/h到30mL/h的流速进行。在一个实施例中，流速是约10mL/h到20mL/h以确保将密封剂引入到进入通道中是稳定的。在一个实施例中，流速是10mL/h到15mL/h。
将密封剂泵送到排出通道中的步骤可以以取决于排出通道的尺寸的流速进行。将密封剂泵送到排出通道中的步骤可以以约10mL/h到80mL/h、或约10mL/h到70mL/h、或约10mL/h到60mL/h、或约20mL/h到80mL/h、或约20mL/h到70mL/h、或约30mL/h到80mL/h的流速进行。在一个实施例中，流速是20mL/h到40mL/h。这一步骤的流速由于排出通道的更大尺寸而可以高于将密封剂泵送到进入通道中的步骤的流速。
在一个实施例中，在将密封剂泵送到排出通道中的步骤之前进行将密封剂泵送到进入通道中的步骤以有效地隔离所述孔中的液体。
在将液体蜡泵送到进入通道中的步骤之前进行将密封剂泵送到排出通道中的步骤的情况下，在孔出口处形成具有约44达因/cm的界面张力的油/水界面。然而，相比之下，孔出口处的水的表面张力在20℃是约72.8达因/cm，远高于油/水界面的界面张力。因此，当液体蜡填充内通道时，排出通道处的油/水界面的界面张力可能不足以将溶液约束在所述孔内。所述溶液因此可以进入排出通道，由此影响对孔的光学检测的精确性。
密封剂可以是本文所公开的密封剂，如液体蜡。
所述步骤可以在室温下进行。有利地，可以在低到30℃的温度下在每个孔中产生对流流动，从而帮助检测探针和靶分子的混合以产生完全均匀的混合物。
如果需要解链曲线分析，则所述方法可以在小于75℃或小于70℃的温度下进行以阻止密封剂和液体中形成气泡。
有利地，所公开的方法可以在少于1min、或少于40秒、或少于30秒、或少于20秒、或少于15秒、或少于12秒内完成。整个样品到检测的工作流程可以在少于5小时、或少于3小时、或少于2小时内完成。有利地，所公开的方法提供了对可能靶分子的快速且高通量的筛选。可以提供赋予对针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗生素治疗的抗性的一组基因的快速检测。
在一个实施方案中，提供了所公开的系统在检测抗至少一种抗细菌剂的细菌中的用途。所公开的系统可以用于检测赋予对针对抗病毒或抗细菌感染的治疗的抗性的基因。所述细菌可以是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
术语“细菌感染”是指病原细菌对宿主哺乳动物的侵入。这包括通常存在于哺乳动物的机体之内或之上的细菌的过度生长。更通常地，细菌感染可以是其中细菌群体的存在正在损害宿主哺乳动物的任何境况。术语“抗细菌剂”是指由微生物产生的抑制其它微生物生长的天然存在的抗生素，以及在实验室内合成或改良的具有杀细菌活性或细菌抑制活性的药剂，例如β-内酰胺抗细菌剂、糖肽、大环内酯类、喹诺酮类、四环素和氨基糖苷类。通常，如果抗细菌剂是细菌抑制性的，则意指所述药剂基本上终止细菌细胞生长(但不杀死细菌)；如果所述药剂是杀细菌的，则意指所述药剂杀死细菌细胞(并且可以在杀死细菌之前终止生长)。在一个实施例中，抗细菌剂是抗生素。
所公开的系统可以是在医院里进行的常规抗生素敏感测试的可行的替代。
本文所说明性地描述的本发明可在不存在本文未明确公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制的情况下被合适地实施。因此，例如，术语"包含"、"包括"、"含有"等应当被宽泛地解读并且没有限制。另外，本文所采用的术语和表达是作为描述而非限制的术语被使用，并且使用这些术语和表达并不意在排除所显示和描述的特征或其部分的任何等同物，而应认识到可在所要求保护的本发明范围内作出各种修改。因此，应当理解，虽然已经通过优选实施方案和任选特征具体地公开了本发明，但本领域技术人员可采用本文所公开的优选实施方案和任选特征中所体现的本发明的修改和变更，并且认为此类修改和变更在本发明范围内。
本文已对本发明进行了宽泛的和类属性的描述。落入该类属公开的每个较窄的种和亚类属分组也构成本发明的一部分。这包括带有将任何主题从类属中去除的附带条件或负面限制来概括性地描述本发明，而不管被除去的内容是否在本文中明确述及。
其它实施方案在以下权利要求书和非限制性实施例内。另外，在用马库什组(Markush group)描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员将认识到，由此也是以马库什组的任何单个成员或成员亚组来描述本发明。
实验部分
实施例1
在本实施例中进行目标DNA靶标的不对称扩增。目标DNA靶标是nuc、mecA和blaZ基因。
用于nuc基因的正向过量引物由SEQ ID NO:1表示，用于nuc基因的反向限制引物由SEQ ID NO:2表示并且用于nuc基因的MB探针由6-FAM-SEQ ID NO:3-BHQ1表示。
用于mecA基因的正向过量引物由SEQ ID NO:4表示，用于mecA基因的反向限制引物由SEQ ID NO:5表示并且用于mecA基因的MB探针由6-FAM-SEQ ID NO:6-BHQ1表示。
用于blaZ基因的正向过量引物由SEQ ID NO:7表示，用于blaZ基因的反向限制引物由SEQ ID NO:8表示并且用于blaZ基因的MB探针由6-FAM-SEQ ID NO:9-BHQ1表示。
多重PCR反应溶液包含100μL用于每种目标DNA靶标的过量引物(2μM)和限制引物(0.2μM)、200μM每种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)、2mM MgCl2、2×无色反应缓冲液(pH 8.5)中的热启动DNA聚合酶和2μL模板DNA。
在PTC 200热循环仪(Bio-Rad Laboratories,CA,USA)上进行PCR扩增。
进行95℃持续2分钟的初始变性步骤，之后进行95℃持续30秒、50℃持续30秒(复性步骤)和72℃持续30秒(复性步骤)的60个循环。在60个循环结束时包括72℃持续10分钟的最终延长步骤。
实施例2
只有当微流体装置的表面平面上的光强度分布辐射对称时，入射光的均匀性才有可能。通过以下实验证实入射光的辐射对称。
使用功率计(841-PE型，Newport公司，Irvine,CA,USA)来测量入射于位于离光学纤维(400μm,0.75m UV-SR,Ocean Optics)出口10cm处的样品平面上的光强度(μW/cm2)。采用固态可切换光源(Lumencor,SpectraLight Engine,Lumencor公司，Beaverton,OR,USA)。以离光轴0–15mm的各种径向位移进行测量。
图8确认入射于样品平面(即芯片)上的光的分布具有辐射对称。由于所述孔以辐射对称模式排列，因此这确保了入射光在所有芯片孔内都是均匀的。
实施例3
使用所公开的微流体装置来检测金黄色葡萄球菌中的mecA、nuc和blaZ基因。将所述实验在三个装置上重复三次。
在第一个装置中，在孔2–3(图9A中由实心白箭头指示)中预加载mecA-特异性MB探针、nuc-特异性MB探针和blaZ-特异性MB探针。在第二个装置中，在孔5-6(图9B中由实心白箭头指示)中预加载mecA-特异性MB探针、nuc-特异性MB探针和blaZ-特异性MB探针。在第三个装置中，在孔8-9(图9C中由实心白箭头指示)中预加载mecA-特异性MB探针、nuc-特异性MB探针和blaZ-特异性MB探针。在所有三个装置中，将1.6皮摩尔冻干的mecA-特异性MB探针、nuc-特异性MB探针和blaZ-特异性MB探针预加载到各自的孔中。
在不对称的单重PCR反应中单独地扩增mecA、nuc和blaZ靶标，然后将单链PCR产物递送到所述三个装置中。在递送扩增的PCR产物后，MB探针将与它们的互补靶标杂交，从而在488nm下的蓝光激发下产生520nm下的荧光发射。
图9A到9C显示在室温下在三个装置中对金黄色葡萄球菌中的mecA、nuc和blaZ基因的自发检测。
如图9A到9C中所观测到的，所述检测测定具有高度特异性。特定的探针只有在其互补靶标存在下才发射荧光。如图9A中所见，在其中发生MB探针与所述基因之间的杂交的孔2-3中检测到荧光。如图9B中所见，在其中发生MB探针与所述基因之间的杂交的孔5-6中检测到荧光。如图9C中所见，在其中发生MB探针与所述基因之间的杂交的孔8-9中检测到荧光。
图10确认来自对应于目标靶标的探针的荧光读出值显著高于两个非靶标的读出值。尽管nuc基因的杂交信号明显低于mecA和blaZ基因的杂交信号，但在其互补靶标存在下，它仍然显著高于另外两个基因的杂交信号。在图10中，“*”表示p≤0.01。
图9A到9C还确认相邻孔之间不存在串扰。紧邻预加载有MB探针的孔的相邻孔(由虚线箭头指示)显示没有荧光信号。这确认了从一个孔到另一个孔没有荧光团遗留。
实施例4
这里研究MB探针的量对nuc和mecA杂交信号的影响。
图11A-B显示杂交信号强度随着nuc和mecA MB探针的加载浓度分别从0.8pmol/孔增加到6.4pmol/孔而增加。
这表明样品中的互补ssDNA的量可能过量，因此，杂交量随着探针量的增加而增加。
另一种意见是ssDNA可能具有限制与它们杂交的探针的比例的二级结构。提供更高浓度的探针可以增加杂交的可能性。
不管怎样，不同的靶标倾向于展示不同的基线杂交强度，所述基线杂交强度在某种程度上可以通过改变MB探针浓度来加以调节。
实施例5
在本实施例中，比较包含无模板对照的装置与包含阳性对照的装置的荧光。
在两种装置中的孔2–3、孔5–6和孔8–9中预加载对应于mecA、nuc和blaZ靶基因的1.6皮摩尔冻干的序列特异性MB探针。
如所预期的，阳性对照相较于无模板对照于对应孔处显示显著更高的荧光信号(参见图12)。因此，可以容易地限定合适阈值以区别有效的杂交信号与假阳性。
实施例6
在本实施例中，DNA模板浓度是变化的。
mecA DNA模板浓度以0ng/μL(无模板对照(NTC))、2×10-5ng/μL、2×10-3ng/μL、2×10-1ng/μL和2×101ng/μL变化。以1.6pmol/孔加载MB探针。
图13显示所公开的装置可以检测低到2×10-3ng/μL的检测极限的mecA靶基因。
作为金标准比较，使用从Bio-Rad Laboratories公司，CA,USA获得的CFX96机器在实时设置中检测相同的靶基因。使用相同的引物对和MB探针。mecA DNA模板浓度以0ng/μL(NTC)、2×10-11ng/μL、2×10-9ng/μL、2×10-7ng/μL、2×10-5ng/μL、2×10-3ng/μL、2×10-1ng/μL和2×101ng/μL变化。一式三份(各25μL)进行实时PCR。
图14显示CFX96机器可以检测低到2×10-3ng/μL的检测极限的mecA靶基因。在图14中，“*”表示p≤0.05。
因此，所公开装置的检测灵敏度与CFX96机器的检测灵敏度相当。