用于过滤器和过滤过程的过程控制系统和方法与流程

本发明主张2014年5月13日提交的第61/992,595号美国临时申请案的优先权，并且所述美国临时申请案的全部内容并入本文中。

技术领域

本专利涉及过程控制系统和方法，并且具体来说，涉及用于过滤器和过滤过程的过程控制系统和方法。

背景技术：

许多产品，例如抗体，更具体地说单克隆抗体，源于细胞。为了制备源于细胞的产品，可以执行一个或多个初始单元操作以去除细胞和任何相关联的细胞碎片从而实现纯化。在纯化之后，可以执行一个或多个后续单元操作以制备用于给药的产品。初始和后续单元操作中均可包含过滤，如下文将在制备源于细胞的产品的整体过程的一般描述的上下文中所阐述。

参考可以用于制备抗体或免疫球蛋白等医用级细胞外表达产品的商业规模的单元操作，可以使用离心或过滤等初始分离操作来去除细胞和细胞碎片。离心涉及对液体溶液或悬浮液应用离心力(相对于轴线)，以使溶液或悬浮液的较稠密的组分更远离轴线转移，而溶液或悬浮液的不那么稠密的组分朝向轴线转移(或至少远离轴线转移得不如稠密的组分那么远)。过滤是压力驱动的过程，根据组分之间的大小差异使用薄膜来分离液体溶液或悬浮液中的组分。当在细胞分离采集应用中使用时，过滤可以被称为微滤。取决于溶液或悬浮液中最初的细胞和/或细胞碎片的量，或取决于离心或初级过滤过程已经分离开细胞和/或细胞碎片的程度，上文提及的离心或过滤中的任一者可以前接或后接一个或多个(额外)过滤单元操作。

一旦已经令人满意地去除了细胞和细胞碎片，就可以使用被称为层析的过程在一个或多个装置(所述装置可以呈一列或多列的形式)中执行纯化。层析包括在被称为流动相的第一相与被称为固定相的第二相之间的相互作用。时常，流动相中的所关注产品结合到固定相，且接着使用溶剂(被称为洗脱液)将产品从固定相分离。其它时候，所关注产品在流动相中流过，而污染物结合到固定相。

流动相与固定相之间的相互作用的确切性质与所使用的层析类型不同。离子交换层析依靠所关注产品的带电分子(或污染物)与带反向电荷的固相之间的吸引力。例如，在阳离子交换层析中，带正电分子附着到带负电固相。亲和性层析包括使用特异性结合到产品(即，靶分子)或污染物的配体。关于所关注的抗体或免疫球蛋白产品，配体可以是相关联抗原。

一旦已经完成纯化，就可以在将从层析装置洗脱的产品给药至患者之前输送进行进一步处理，包含例如以药学上可接受的赋形剂形式配制蛋白和/或执行过滤。例如，可以执行过滤以去除存在的任何病毒，从而确保源于生物技术的治疗剂的病毒安全性。另外，可以对产品执行过滤以将产品浓缩成医用等级并将产品脱盐。虽然过滤的目的仍旧是分离较大组分与较小组分，但是与所执行的用于从产品中去除细胞和细胞碎片的预纯化过滤不同，后纯化过滤从产品中去除小型肽和盐以便增加产品的浓度。还可以使用此过滤将产品脱盐，或引入稳定的药物配方用于在填充之前存储产品(即，缓冲液更换或替换)。当在此背景中使用时，过滤可以被称为超过滤。

上文描述的过滤可以是死端过程或交叉流或切向流过程。在死端过滤器中，待分离的液体溶液或悬浮液(或供液)的流动垂直于薄膜。交叉流过滤器中的大多数供液流动与薄膜表面相切或跨过所述表面。

切向流过滤(或TFF)相对于死端过滤具有某些优点。具体来说，在切向流过滤期间薄膜表面上积聚的材料(也被称为滞留膜层)减到最少，从而增加了过滤器可以运作的时间长度。因此，切向流过滤可以应用于连续过程应用，原因在于供液可以被连续地供应到过滤器中并通过过滤器。

在某些应用中可以使用被称为单程切向流过滤的特定类型的切向流过滤。传统TFF包括引导供液多次通过过滤装置(或平行布置的多个过滤装置)，而SPTFF包括以单程引导供液通过过滤装置。根据某些实施例，SPTFF过滤装置可以包含单个薄膜。根据其它实施例，SPTFF过滤装置可以由串联连接的多个薄膜卡盒界定，一个阶段的滞留液作为供液被引导到接下来的阶段中。卡盒可以与多个支架或分流器板相连接。替代地，可以设计外壳以接收多个薄膜，所述外壳提供用于连接个别薄膜的途径。

如下文详细阐述，本发明阐述用于过滤器和过滤(具体地说，切向流过滤器和过滤)的改进的过程控制系统和方法，包含传统装置和方法的有利替代方案。

技术实现要素：

根据本发明的方面，一种过程控制系统包含：一个或多个上游处理单元，其各自操作流速；连接到所述一个或多个上游处理单元的贮槽；具有进口、渗透液出口和连接到贮槽的滞留液出口的过滤器；具有连接到贮槽的进口和连接到过滤器的进口的出口的供液泵；以及设置在渗透液出口处用于确定渗透液出口处的流速的传感器。所述系统还包含控制系统，其耦合到传感器和上游过程，并且经调适以根据渗透液出口处的流速控制所述一个或多个上游处理单元中的一个或多个的流速。

根据本发明的另一方面，提供一种结合一个或多个上游处理单元、连接到所述一个或多个上游处理单元的贮槽、以及具有进口、渗透液出口和连接到贮槽的滞留液出口的切向流过滤器使用的过程控制方法。所述方法包含感测渗透液出口处的流速，并且根据渗透液出口处的流速控制所述一个或多个上游处理单元中的一个或多个的流速。

根据本发明的又一方面，一种过程控制系统包含：一个或多个上游处理单元，其各自操作流速；连接到所述一个或多个上游处理单元的贮槽；具有进口、渗透液出口和连接到贮槽的滞留液出口的过滤器；具有连接到贮槽的进口和连接到过滤器的进口的出口的供液泵；以及设置在渗透液出口处用于确定渗透液出口处的流速的传感器。所述系统还包含控制系统，其耦合到传感器和供液泵，并且经调适以根据渗透液出口处的流速控制供液泵。

根据本发明的又一方面，提供一种结合一个或多个上游处理单元、连接到所述一个或多个上游处理单元的贮槽、以及具有进口、渗透液出口和连接到贮槽的滞留液出口的切向流过滤器使用的过程控制方法。所述方法包含感测渗透液出口处的流速，并且根据渗透液出口处的流速将材料从贮槽泵送到过滤器中。

根据本发明的再一方面，一种过程控制系统包含：一个或多个上游处理单元，其各自操作流速；连接到所述一个或多个上游处理单元的贮槽；具有进口、渗透液出口和连接到贮槽的滞留液出口的过滤器；具有连接到贮槽的进口和连接到过滤器的进口的出口的供液泵；以及设置在渗透液出口处用于确定渗透液出口处的流速的传感器。所述系统还包含控制系统，其耦合到传感器和供液泵，并且经调适以根据渗透液出口处的流速控制供液泵直到达到针对供液泵的预定流速，并且经调适以在达到针对供液泵的预定流速之后根据渗透液出口处的流速控制所述一个或多个上游处理单元中的一个或多个的流速。

根据本发明的另一方面，提供一种结合各自具有流速的一个或多个上游处理单元、连接到所述一个或多个上游处理单元的贮槽、以及具有进口、渗透液出口和连接到贮槽的滞留液出口的过滤器使用的过程控制方法。所述方法包含感测渗透液出口处的流速，根据渗透液出口处的流速将材料从贮槽泵送到过滤器中直到达到预定泵送流速，并且随后一旦达到预定泵送流速就控制所述一个或多个上游处理单元中的一个或多个的流速。

根据本发明的又一方面，一种过程控制系统包含：一个或多个上游处理单元，其各自操作流速；连接到所述一个或多个上游处理单元的贮槽；具有进口、渗透液出口和连接到贮槽的滞留液出口的过滤器；具有连接到贮槽的进口和连接到过滤器的进口的出口的供液泵；以及设置在渗透液出口处用于确定渗透液出口处的流速的传感器。所述系统还包含控制系统，其耦合到传感器和供液泵，并且经调适以根据渗透液出口处的流速控制供液泵直到达到针对供液泵的预定流速，并且经调适以在达到针对供液泵的预定流速之后允许所述一个或多个上游处理单元的流速与供液泵的流速之间的不匹配。

根据本发明的又一方面，提供一种结合一个或多个上游处理单元、连接到所述一个或多个上游处理单元的贮槽、以及具有进口、渗透液出口和连接到贮槽的滞留液出口的过滤器使用的过程控制方法。所述方法包含感测渗透液出口处的流速，根据渗透液出口处的流速将材料从贮槽泵送到过滤器中直到达到预定泵送流速，并且随后根据预定泵送流速将材料从贮槽泵送到过滤器中，由此允许贮槽中的体积改变。

根据本发明的再一方面，一种过程控制系统包含：微滤单元；单程切向流过滤器，其具有进口、渗透液出口和滞留液出口；供液泵，其具有连接到微滤单元的进口和连接到过滤器的进口的出口；以及渗透液泵，其具有连接到过滤器的渗透液出口的进口。所述系统还包含控制系统，其耦合到渗透液泵，并且经调适以控制渗透液泵以改变流速减小系数，其中流速减小系数是供液流速与滞留液流速的比率。

根据本发明的另一方面，一种过程控制方法包含通过具有进口、渗透液出口和滞留液出口的单程切向流过滤器泵送材料；以及从过滤器的渗透液出口泵送渗透液以改变流速减小系数，其中流速减小系数是供液流速与滞留液流速的比率。

根据本发明的另一方面，提供一种纯化蛋白的过程。所述过程利用一个或多个上游处理单元、连接到所述一个或多个上游处理单元的贮槽、以及具有进口、渗透液出口和连接到贮槽的滞留液出口的切向流过滤器。所述过程包含当蛋白从滞留液出口流回至贮槽时感测渗透液出口处的流速。接着，所述过程包含执行(i)到(iv)之一。根据(i)，所述过程可以包含根据渗透液出口处的流速控制所述一个或多个上游处理单元中的一个或多个的流速，所述流速是至少部分包含蛋白的材料的流速。根据(ii)，所述过程可以包含根据渗透液出口处的流速将至少部分包含蛋白的材料从贮槽泵送到过滤器中。根据(iii)，所述过程可以包含根据渗透液出口处的流速将至少部分包含蛋白的材料从贮槽泵送到过滤器中直到达到预定泵送流速，并且随后一旦达到预定泵送流速就控制所述一个或多个上游处理单元中的一个或多个的流速。根据(iv)，所述过程可以包含根据渗透液出口处的流速将至少部分包含蛋白的材料从贮槽泵送到过滤器中直到达到预定泵送流速，并且随后根据预定泵送流速将材料从贮槽泵送到过滤器中，由此允许贮槽中的体积改变。最后，在(i)到(iv)中的任一者之后，所述过程包含在洗脱液中纯化蛋白，以及任选地以药学上可接受的赋形剂形式配制蛋白。

附图说明

相信从结合附图的以下描述中将能更全面地理解本发明。一些图可能已经通过省略所选元件而经过简化，这是为了更清楚地示出其它元件。一些图中这样省略元件未必指示特定元件在任何示例性实施例中的存在或不存在，除非可能在相应文字描述中明确如此叙述。图式均未必按比例绘制。

图1是结合连续单程切向流过滤(SPTFF)使用的控制系统的示意图；

图2是由图1的控制系统实施的阶梯式或分层控制方法的方块图；

图3是对于根据图2的实施例的阶梯式控制方法的实例，体积减小因子(VRF)随时间推移的曲线图；

图4是对于阶梯式控制方法和可连续变化的控制方法的实例，体积减小因子(VRF)随时间推移的曲线图；

图5是结合连接处理系统使用的控制系统的示意图；

图6是可由图5的控制系统实施的可变流速控制方法的方块图；

图7是可由图5的控制系统实施的恒定流速控制方法的方块图；

图8是可由图5的控制系统实施的混合控制方法的方块图；

图9是可由图5的控制系统实施的浪涌控制方法的方块图；

图10是可由图5的控制系统实施的高体积设定值、固定通量控制方法的方块图；

图11示出三个柱的mAb纯化过程，其中柱2和3为精制步骤，其中柱2典型地是以粘合和洗脱模式操作的阳离子交换层析，并且柱3通常指定为以流通模式操作的阴离子交换层析，并且其中方框指示在连接过程中同时操作的步骤，在连接过程中可以将大池槽转换成小的缓冲容器；

图12是连接过程设计的示意性图解，示出操作顺序、步骤的连通性、缓冲容器的位置、分流采样和线上滴定；

图13是展示用于连接下游过程的TFF控制策略的表；

图14a是示出在进行STIC薄膜层析(mAb A)时负荷电导率对CHOp去除的影响的数据图，其中限盐实验和高盐实验分别具有16mS/cm和28mS/cm的负荷电导率，所述数据图显示出负荷电导率对池中的CHOp水平(垂直条)和％CHOp减小(倾斜线)的影响最小；

图14b是示出在进行mAb A的STIC薄膜层析时pH值对CHOp减小的影响的数据图，其中通过将具有2M三羟甲基氨基甲烷的CEX池(pH值5.0，电导率16mS/cm)滴定至其相应pH值来制备用于这四个实验的负荷材料，池中的CHOp水平(垂直条)和％CHOp减小(曲线)的显示结果显示出在STIC的更高pH值处获得更佳的宿主细胞蛋白去除；

图15是示出以400mM三羟甲基氨基甲烷的滴定剂、pH值8.3、在0.1的体积比下进行的mAb A CEX洗脱的从pH值5.0到pH值8.0的线上pH值滴定的数据图，结果显示遍及洗脱峰值(蛋白浓度、钟形曲线；电导率，倾斜线)获得目标pH值(水平直线)；

图16展示两个数据图(上图：Viresolve Shield；下图：Viresolve预滤器)，以mAb D使用用于Viresolve Pro的两个不同预滤器评估分批模式的负荷pH值的影响，其中测试条件为25g/L的蛋白浓度、0.1M NaAcetate 0.15M NaCl、30psi恒定压力，并且其中条件描绘为：pH值5.0(菱形)、pH值6.5(正方形)、pH值7.5(三角形)；

图17a和17b是示出对于以mAb C(0.1M NaAcetate，pH值5)进行的所连接CEX-VF(VPF-VPro)操作的病毒过滤分布的图，中间缓冲容器的停留时间为：17a)5分钟，17b)25分钟，其中针对蛋白浓度(菱形)、电导率(正方形)、压力(三角形)、渗透率(Xs)示出趋势图；

图18是示出以mAb C(0.1M NaAcetate，pH值5)使用VPF-VPro的对于分批对比连接(CEX-VF)模式的VF渗透率趋势的比较图，其中连接数据示出为沿着对角线聚集，分批数据示出为位于聚集线下方的正方形、圆形和菱形，其中分批数据示出为针对每个独立实验的平均渗透率：正方形表示高压，圆形表示低压，菱形表示中心点，并且开放形状表示低盐条件，而填充形状表示高盐条件；

图19是示出以mAb C(100mM醋酸，pH值5，具有开放符号表示的低盐30mM NaCl，或密闭符号表示的高盐150mM NaCl)针对低盐条件和高盐条件在20PSI TMP下的TFF渗透通量对比浓度的图，其中通过符号表示数据点，线条表示模型匹配，箭头表示到连接过程结束(UF1a结束)时维持38LMH的恒定渗透通量所需的供液交叉流速斜升；

图20展示开发的连接过程的实例的表；

图21a是示出整个mAb B所连接下游过程期间质量的进展的数据图，具有以下依序操作的步骤：CEX粘合/洗脱层析(CEX)、HIC流通层析(HIC FT)、病毒过滤(VF)和TFF(UF1a)，其中过程的所连接部分在UF1a处结束；以离散模式操作UF1b、DF 和OC；

图21b是示出连接的病毒过滤趋势的数据图，其中关于设定值(虚线)的流速变化(菱形)以及因此跨Viresolve Pro的压降(三角形)是TFF滞留液槽的自动液位控制的结果，并且VPro过滤器渗透率(正方形)的下降对应于过滤器上峰值蛋白浓度(Xs)的增加；

图21c是示出连接的TFF趋势(图20的表2中示出的运行参数)的数据图，其中在UF1a期间供液交叉流速(三角形)和TMP(正方形)增加以维持恒定渗透液流速(*s)，并且VF流速设定值和TFF渗透液流速设定值匹配且由略高于8LPM的水平虚线表示，VF流速(+s)和TFF槽液位(Xs)的轻微浮动是归因于自动化控制；以及

图22是示出针对以离散模式操作的mAb A-E与使用100L缓冲槽的连接过程相比的用于B/E(每三个的集群中最左边的垂直条)、FT(每三个的集群中中间的垂直条)和VF(每三个的集群中最右边的垂直条)步骤的投影池体积的图。

具体实施方式

本发明使用以下术语，下文提供这些术语的定义：

过滤：压力驱动的分离过程，根据组分之间的大小差异使用薄膜来分离液体溶液或悬浮液中的组分。

供液：进入过滤器的液体溶液或悬浮液。

滤液：穿过薄膜的一个或多个组分。也称为渗透液。

滞留液：未穿过薄膜而是实际上由薄膜截留的一个或多个组分。

切向流过滤(TFF)：在TFF中，沿着薄膜的表面沿切线方向泵送液体溶液或悬浮液。也称为交叉流过滤。

单程切向流过滤(SPTFF)：一种类型的TFF，其中以单程引导供液通过过滤装置而不再循环。

微滤：用于使完整的细胞和相对大的细胞碎片/裂解物与组分的其余部分分离的过滤，所述其余部分例如胶体材料、蛋白(包含所关注产品)和盐。对于这种类型的分离，薄膜孔径可以在例如0.05μm到1.0μm的范围内。来自微滤过程的滤液或渗透液可以被称为微滤采集流体。

超滤：用于例如在脱盐或浓缩时使蛋白(包含所关注产品)与例如相对小的肽和缓冲液组分分离的过滤。用于这种类型的分离的薄膜等级可以用标称分子量极限来表达，并可以在例如1kD到1000kD的范围内。

透滤：可以结合其它分离类别执行以增强例如产品良率或纯度的过滤过程。将缓冲液引入到再循环贮槽中，而从单元操作中去除滤液。

跨膜压(TMP)：TMP是从供液到薄膜的滤液侧的平均施加压力。

连接过程：连接上游过程和下游过程，其中与上游过程同时使用下游过程。也就是说，上游过程和下游过程的操作至少在时间上重叠。

本发明涉及用于过滤器和过滤系统的各种过程控制方法和系统。首先，描述针对使用具有滤液(渗透液)流速控制的单程切向流过滤的微滤采集流体的浓缩的过程控制方法和系统。另外，本文中描述了用于与一个或多个上游单元操作同时使用(即，连接)的超滤元件的操作的过程控制方法和系统。

如上所述，使用微滤从所关注产品中分离细胞和细胞碎片。具体来说，微滤元件经安置与来自生物反应器的采集液流成一直线。微滤元件将细胞和细胞碎片返回到生物反应器，同时收集滤液用于进一步的下游处理。

微滤可以结合透滤来提高产品良率。然而，透滤会增加从微滤元件收集的滤液的液体体积。为了获得大于80％到90％的产品良率，从微滤元件收集的滤液的液体体积可以是生物反应器的工作体积的至少三倍。所收集的大量液体体积可能随着规模的增大而限制透滤的实用性。

为了允许结合微滤使用透滤以提高大规模操作的产品良率，本文中描述了用于来自微滤元件的渗透液(在本文中称为微滤采集流体)的浓缩的过程控制方法和系统。具体来说，这些过程控制方法和系统使用具有渗透液流速控制的单程切向流过滤(SPTFF)。

在恒定体积透滤模式中的微滤操作期间，归因于制造阶段期间产品在生物反应器中的积累，产品浓度一开始较高。也就是说，产品浓度一开始较高是因为目前为止尚不存在产品的去除，并且作为透滤过程的一部分尚未添加缓冲液。在产品穿过微滤元件并且作为透滤过程的一部分添加介质时，生物反应器中(以及微滤元件的滤液中)的产品浓度将减小。变化的产品浓度将对浓缩微滤采集流体下游的SPTFF的使用起作用，因为供液经SPTFF转换为渗透液取决于供液浓度以及跨流速和跨膜压。微滤元件滤液中变化的产品浓度将导致改变SPTFF中供液至渗透液的转换。

根据本发明，结合控制系统和方法使用单程切向流过滤(SPTFF)以实现微滤采集流体的浓缩。

关于硬件，图1示出了处理系统50，其包含微滤单元51、任选的接收来自微滤单元51的滤液的第一贮槽52、供液泵54(其根据其它实施例可以直接耦合到微滤单元51，并起到从微滤单元51去除滤液并驱动供液穿过SPTFF 56等下游元件的双重作用)、SPTFF 56、渗透液(或滤液)泵58以及容纳滞留液的第二贮槽60。管线62将第一贮槽52的出口64连接到供液泵54的进口66，并且管线68连接供液泵54的出口70与SPTFF56的进口72。管线74将滞留液出口76连接到第二贮槽60，而管线78将渗透液出口80连接到渗透液泵58的进口。在滞留液出口76与第二贮槽60之间的管线74中可以设置反压控制阀82。管线62、68、74和78可以进一步包含图1中未示出的连接件、夹具和其它设备。

还如图1中所示，提供控制系统120。可以手动地设置供液泵54和阀82，而根据图2中示出的控制方法通过控制系统120控制渗透液泵58。根据其它实施例，控制系统120可以耦合到供液泵54、渗透液泵58和阀82，并且可以经配置或调适以控制供液泵54、渗透液泵58和阀82。

根据某些实施例，控制系统120可以包含一个或多个处理器122以及存储器124，存储器124耦合到一个或多个处理器122。一个或多个处理器122可以经编程以根据图2中示出的控制方法控制渗透液泵58以及任选地供液泵54和阀82。由一个或多个处理器122执行的指令可以存储在存储器124上，所述存储器124可以包括有形的、非暂时性的计算机可读媒体或存储媒体，例如呈各种形式(例如，硬盘、光学/磁性媒体等)的只读存储器(ROM)或随机存取存储器(RAM)。

根据本发明的控制系统和方法利用可变流速减小因子(FRF)的策略来实现目标体积减小因子(VRF)。FRF定义为供液流速与滞留液流速的比率(供液流速/滞留液流速)。VRF定义为累计供液体积与累计滞留液体积的比率(供液体积/滞留液体积)。为了实现具有可变流速转换的所要目标VRF，根据本发明的控制系统和方法实施渗透液流速控制策略，其中在采集过程中FRF发生变化。具体来说，当产品浓度高时(即，在采集过程开始时)利用较低目标FRF。相反，当产品浓度低时使用较高目标FRF。当产品浓度从高到低变化时，改变目标FRF。

根据本发明的第一实施例，在一系列逐步变化中改变目标FRF。渗透液流速控制策略可以表达为如下：

总VRF＝ΔT_total/(Δt₁/FRF₁+…Δt_n/FRF_n) (方程式1)

其中总VRF＝累计体积减小因子；

ΔT_total＝总处理时间；

Δt＝步骤的时间间隔；以及

FRF＝步骤的体积减小因子。

图2示出控制方法的实施例，表示为控制方法150。方法150开始于方块152，其中设置供液泵54以在所需生物反应器灌注速率下运行。方法150继续到方块154，其中将反压控制阀82设置到SPTFF 56的所需反压。应认识到，可以连续地或同时地执行方块152、154处的动作。方法150继续到方块156，其中将渗透液泵58设置在指定泵速下以实现目标FRF。方法150接着继续到方块158，其中在指定泵速下操作渗透液泵58。所述方法转到方块160，其中进行是否应调整渗透液泵58的操作以改变目标FRF的确定。如果在方块160处确定尚未到改变渗透液泵速以使目标FRF改变(并且参考具体实施例，使其增加)的时间，那么方法150返回到158。如果在方块160处确定应改变泵速，那么方法150转到方块162，其中改变泵速以实现新的目标FRF。

图3示出可通过结合阶梯式控制系统和方法使用根据本发明的SPTFF系统实现的FRF的实例。应认识到，历时72个小时的时间段以三个步骤实施所述方法。每个为执行24个小时的时间段。根据以上论述，当产品浓度高时用于第一步骤的FRF低，并且当产品浓度低时用于第三且最后一个步骤的FRF高。具体来说，用于第一步骤的FRF是2.1，用于第二步骤的FRF是2.7，且用于第三步骤的FRF是3.4。使用上文的方程式1，总VRF因此是2.6。

虽然图3的实例包含三个步骤，但应认识到，可以使用更少或更多数目的步骤(例如，两个步骤、四个步骤)。实际上，图4示出了本发明的实施例，其中将比较以逐步方式实施FRF的实施例与连续地改变FRF的实施例。此外，虽然历时相同时间段执行每个步骤，但是可以改变其中可以保持渗透液泵速以实现目标FRF的时间段，使得第一步骤可以长于接续的步骤，或反之亦然。此外，虽然在图3的实例中目标FRF中的变化(在这种情况下，增加)大体上相等，但是应认识到，接续的步骤的目标FRF之间的差异不必大体上相同。

通过根据供液流速设定薄膜区域大小并在系统的压力限制内指定FRF可以获得目标VRF。可以指定FRF的每个逐步变化以在一定跨膜压(TMP)窗内操作从而提供所要的总VRF。

已经论述了用于浓缩微滤采集流体的过程控制系统和方法，可以参考图5到10论述用于超滤和连接过程的其它过程控制系统和方法。具体来说，图5示出了可以实施图6到10的方法的连接过程系统(与相关联的控制系统)。

如上文所论述，超滤是使用薄膜来分离所关注产品(例如，蛋白)与例如较小的肽和盐的分离过程。在超滤的情况下，收集滞留液用于可能的进一步处理、包装等，同时去除渗透液或滤液。超滤形成具有更低盐分的浓缩产品。因此，超滤也可以被称为脱盐过程。

在典型的超滤过程中，例如对于单克隆抗体(mAb)，超滤过程执行为在固定供液交叉流速下以分批模式进行的离散单元操作。所述过程是离散的是指所述单元不直接连接到上游或下游过程，而是实际上以分批模式操作。所选择的固定供液交叉流速是典型地由系统设计允许的使过程效率达到最大的最大供液交叉流速。

当产品浓度增加时，渗透通量减少。这种减少通常归因于浓度极化梯度。也就是说，随着过滤过程的进行，被截留的基本上高浓度的物质的边界层在薄膜表面上或在薄膜表面附近积聚。边界层阻碍材料流过薄膜，并因此影响了渗透液的产生。

实际上，如果在供液贮槽附接到过滤器的情况下以分批模式操作超滤过程，那么从供液贮槽到过滤器的进口流速典型地将减小以匹配渗透液流速，从而维持每单位时间恒定的滞留液体积。由于作为离散单元操作来操作超滤，所以不会因为这种流速减小而影响到任何其它单元操作。

然而，图5示出了系统200，其中超滤处理单元202连接到上游处理单元204(例如，层析处理单元、病毒过滤处理单元)。超滤处理单元202包含上游过程的产品供应到其中的贮槽(或再循环容器)206、供液泵208、切向流过滤器(TFF)210以及反压阀212。管线214连接到供液贮槽206的出口216和泵208的进口218。另一管线220 连接到泵208的出口222和过滤器210的进口224。另一滞留液回流管线226连接到过滤器210的出口228和供液贮槽206。渗透液在过滤器210的渗透液出口230处离开超滤处理单元202。

当如图5中超滤处理单元202连接到上游过程时，渗透液流速的任何减小(即，出口230处)都将对上游操作产生影响。也就是说，典型的是减小至过滤器的进口流速以匹配渗透液流速的减小。另一方面，典型地在恒定流速下进行上游处理操作，例如层析和病毒过滤。如果上游处理操作连接到超滤处理单元202，那么必须提供溶液以解决超滤处理单元202与上游操作204之间的操作差异问题。根据本发明的实施例，需要一种控制系统和方法，以满足在恒定流速下运行上游过程204(例如，层析处理单元)并将那些过程连接(直接连接或通过病毒过滤处理单元间接连接)到具有可变渗透液流速的超滤处理单元202的需要。

如图5中所示，可以提供控制系统240。控制系统240可以耦合到上游过程204和/或供液泵208。控制系统240可以经配置或调适以控制上游过程204和/或泵208，从而实施图6到10中描述的控制方法中的一个或多个。控制系统240还可以耦合到至少一个传感器246，从所述至少一个传感器可以确定渗透液流速。

根据某些实施例，控制系统240可以包含一个或多个处理器242以及存储器244，存储器244耦合到一个或多个处理器242。根据图6到10中的一个或多个图示出的控制方法，一个或多个处理器242可以经编程以控制上游过程204和泵208。由一个或多个处理器242执行的指令可以存储在存储器244上，所述存储器244可以包括有形的、非暂时性的计算机可读媒体或存储媒体，例如呈各种形式(例如，硬盘、光学/磁性媒体等)的只读存储器(ROM)或随机存取存储器(RAM)。

根据图6中示出的且被称为可变流速策略的第一方法250，控制系统240改变上游过程204的操作。具体来说，方法250开始于方块252，其中控制系统240例如响应于从传感器246接收到的信号确定渗透液流速减小。方法250继续到方块254，其中根据感测到的渗透液流速的减小确定上游过程的变化。换句话说，方法250在方块254处确定对于感测到的渗透液流速的减小的适当响应。例如，所确定的变化可以是预定减小上游过程204的流速(例如，层析处理单元的流速)以维持恒定滞留液体积。根据其它实施例，所述变化可以是根据将渗透液流速与上游过程204的流速关联的公式计算的减小。接着方法252根据在方块254处确定的变化在方块256处控制上游过程204。

根据图7中示出的且被称为恒定流速策略的第二方法260，控制系统240改变泵208的操作。具体来说，方法260开始于方块262，其中控制系统240例如响应于从传感器246接收到的信号确定渗透液流速减小。方法260继续到方块264，其中根据感测到的渗透液流速的减小确定泵208的操作的变化(即，泵208出口处流速的增加或减小)。例如，所述变化可以是将渗透液流速改变为恒定流速的供液交叉流速的改变，所述恒定流速与上游过程204的流速匹配，其还应提供贮槽206中的恒定体积。就此而言，应注意，渗透通量主要取决于供液交叉流速；其中更高的供液交叉流速产生更高的质量交换系数，因此实现更高的渗透通量。方法260接着可继续到方块266，其中控制系统240根据在方块264处确定的变化控制泵208的操作。

解决冲突的另一方法还可以是允许上游过程204的流速与出口230的渗透液的流速不匹配。根据还被称为可变容积策略的此方法，贮槽206必须经过充分设定大小以容纳由不匹配造成的滞留液体积的起伏(即，增加或减小)。与图6和7中描述的方法250、260不同，此方法不是主动控制方法，而是被动控制方法。

图8到10示出可以通过控制系统240实施的三个额外控制方法，其中图8的控制方法被称为混合策略，图9的控制方法被称为浪涌策略(其不同于简单地允许浪涌在贮槽206中出现)，并且图10的控制方法被称为高体积设定值、固定通量策略。

根据图8中示出的方法270，方法270最初使用方法260的步骤。也就是说，方法270在方块272处确定是否已经存在渗透液流速的变化、在方块274处确定泵208的变化并且在方块276处实施所述变化。方法270接着在方块278处确定对于泵208的操作是否已经达到预定流速，方法270前进到方块280、282、284，其中方法270确定是否已经存在渗透液流速的减小、确定上游过程204的变化并且实施所述变化。根据某些实施例，预定流速可以是最大系统流速。由于根据预定流速(且具体来说，最大系统流速)限制泵208的操作，因此相对于方法250减少了在方块282处确定并且在方块284处实施的变化。此外，维持了固定的滞留液体积，从而实现较小贮槽的要求。

根据图9中示出的方法290，方法290最初也使用方法260的步骤。也就是说，方法290在方块292处确定是否已经存在渗透液流速的变化、在方块294处确定泵208的变化并且在方块296处实施所述变化。方法290接着在方块298处确定对于泵208的操作是否已经达到预定流速，方法270前进到方块300，其中根据上文描述的被动方法允许贮槽体积激增。根据某些实施例，预定流速可以是最大系统流速。方法290具有允许上游过程204继续在恒定流速下操作的优势。

根据图10中示出的方法310，使用较大贮槽206将超滤处理单元202中的浓度减到最小。如上所述，产品浓度是极化梯度形成的主要原因。通过相对于传统TFF分批超滤处理单元限制单元202中的最大浓度，相对于传统分批处理单元提高可以获得的最大渗透通量率。较高的最大渗透通量率的结果是可以将上游处理单元维持在使其性能最佳化所需的恒定流速下。

因此，根据图10中示出的方法310，控制系统240改变泵208的操作。具体来说，方法310开始于方块312，其中控制系统240例如响应于从传感器246接收到的信号确定渗透液流速减小。方法310继续到方块314，其中根据感测到的渗透液流速的减小确定泵208的操作的变化。例如，所述变化可以是将渗透液流速改变为恒定流速的供液交叉流速的改变，所述恒定流速与上游过程204的流速匹配，其还应提供恒定体积。然而，所述变化还取决于维持贮槽206的体积，所述体积大于图8中的方法260所维持的体积。方法310接着可继续到方块316，其中控制系统240根据在方块314处确定的变化控制泵208的操作。

应进一步认识到，对于在连接系统200的整个操作期间将连续使用的图6到10中示出的方法，上游处理单元204可能不提供用于处理单元204的每次循环的足够质量。实际上，可以使用上文描述的可变容积策略来引起贮槽206的体积激增，由此收集并组合来自上游处理单元204的多个连接循环。

将认识到，如上文已经阐述，根据本发明的系统和方法相对于传统技术可以具有一个或多个优点。根据特定实施例中包含的本发明的特征，这些优点中的任何一个或多个可以存于所述实施例中。同样还可以存在本文中未确切描述的其它优点。

实验测试

借助于实例，已经通过以下实验活动实现各种优点和优势。具体来说，以下描述展示从精制柱连接到最终切向流过滤(TFF)步骤的一个实验mAb下游过程。图11中描述了典型的mAb平台过程，其以采集开始，接着是用于撷取的蛋白A亲和性层析、低pH值病毒灭活步骤、直到用于精制的两个额外层析步骤、病毒过滤(VF)步骤，以及最后用于配制的执行超滤/透滤(UF/DF)的TFF步骤。精制柱(在这种情况下是粘合/洗脱(B/E)和流通(FT)步骤以及TFF)之间的中间的池通常是最稀释的池，并且因此具有其体积超出池罐的大小的最大可能性。通过连接B/E柱、FT柱、VF和TFF步骤，可以减少或除去三个大池罐。本文件报告了连接过程的所提出配置和流速控制策略以实现单元操作的连通性。提供对如何实现连接过程的发展以及对于额外过程监测要求的考虑的详细描述。

方法和材料

材料

通过标准CHO细胞培养方法制造五个mAb产品(mAb A、mAb B、mAb C、mAb D、mAb E)。

小规模和大规模使用的层析树脂包含EMD SO₃^-(EMD Millipore公司，马萨诸塞州比勒利卡)和Phenyl Sepharose^TM6Fast Flow High Sub(通用电气医疗集团(GE Healthcare)，新泽西州皮斯卡塔韦)。小规模层析柱以1.15cm的EMD Millipore公司的Vantage^TML实验室柱包装，并且大规模层析以通用电气医疗集团的Axichrom 60或80cm柱包装。以毫微(1mL)或10”(180mL)大小使用AEX membranes Sartobind (Sartorius Stedim公司，德国哥廷根)。Prefilter(5cm²、0.55m²和1.1m²)、Viresolve Shield(3.1cm²和0.51m²)、Viresolve Pro(3.1cm²和0.51m²)以及330kDa(0.0088m²和1.14m²)过滤器购自EMD Millipore公司。

在通用电气医疗集团AKTAexplorer^TM100系统上执行小规模层析和连接过程实验。对于连接过程实验，多个AKTA经由P-900泵后面的远程连接件而彼此连接以允许辅助输入和输出信号在仪器之间传递。通过(SciLog，威斯康星州麦迪逊)压力传感器和压力监测器执行小规模预滤器和病毒过滤器的压力监测。EMD Millipore公司的搅拌槽(50mL)用作缓冲容器；在不使用顶盖和薄膜的情况下使用所述缓冲容器，因此其可以作为放置在磁性搅拌板上的连续搅拌槽通向大气压力操作。

通过恒定压力设备执行小规模的离散病毒过滤实验，所述恒定压力设备包含压力调节器、压力容器(300或600mL的聚碳酸酯)、压力计、串联连接到计算机用于数据采集的天平以及压缩空气供应。在AKTAcrossflow^TM系统上执行小规模TFF实验。

在定制自动化层析、病毒过滤和TFF栈板上执行大规模运行。层析栈板包含用于梯度和稀释能力的三级泵，在线监测压力、流速、pH值、电导率和UV。栈板还配备有用于收集产品池的伪产品池样本的分流阀和泵。病毒过滤栈板包含用于预滤器和病毒过滤器的支架，并且在线监测压力、流速、pH值、电导率、UV。TFF栈板包含200L的滞留液槽、用于系统供液的隔膜泵和用于透滤缓冲液的蠕动泵、自动TMP控制阀，在线监测滞留液槽上的压力、流速、pH值、电导率和液位感测。缓冲槽配备有液位感测。

方法

Sartobind STIC薄膜层析

在具有旁通的混合器的AKTAexplorer上执行Sartobind STIC实验。在STIC薄膜的上游使用内嵌过滤器(0.2μm的Sartorius公司的Minisart)，以通过过滤掉由AKTA泵可能产生的颗粒而防止压力积聚。加载材料被过滤、经过低pH值病毒灭活回收(FVIP)或CEX回收。在流过和洗涤过程中产品池作为单个主馏分或以多个馏分收集。对STIC池执行的测定包含CHOp ELISA(对于CHO宿主细胞蛋白)、DNA QPCR和浓度UV A280。

线上pH值滴定

CEX洗脱馏分由通过自动化程序运行整个CEX操作序列的AKTAexplorer形成。接着每个馏分用于手动地筛选pH值滴定剂。在发现适当的滴定剂之后，执行采用两个AKTAexplorer的实验，以确认所选择的滴定剂可以向目标提供准确的线上pH值滴定。第一AKTA运行CEX，并且其洗脱物被收集到作为缓冲容器的烧杯中保持5分钟的停留时间。第二AKTA通过泵A从烧杯中加载产品并通过泵B加载滴定剂。两个液流在混合器中混合，然后通过第二AKTA上的内嵌pH值探针测量pH值。第二AKTA还进行分馏并使用Orion双星离线pH值计(赛默科技公司(Thermo Scientific)，马萨诸塞州沃尔瑟姆)验证每个馏分的pH值。

病毒过滤

以离散或连接模式进行病毒过滤测试，其中预滤器和病毒过滤器串联放置。使用在材料部分中描述的恒压设备进行离散测试，通过加载到过滤器上的均质供液收集随着时间推移过滤的体积。使用所连接的AKTAexplorer设备进行连接测试，其中一个AKTA 上的预滤器和病毒过滤器连接到另外的AKTA上的先前层析步骤，并且在每个步骤之间有一个缓冲容器。以固定的停留时间以及因此体积操作缓冲容器，典型地5到7分钟。Unicorn方法经编程以允许在AKTA之间开始自动化信令并且结束加载和洗脱。使用AKTA B-泵进行内嵌滴定、调节或稀释，与AKTA A-泵上加载的供液流混合。由于小规模设备使用固定柱直径和基于商业可用性的过滤器面积，为了实现与大规模操作类似的中间连接单元操作的目标加载和流速，采用分流，其中在层析步骤之后及在缓冲容器之前使用AKTA样品泵。此分流使得能够控制后续单元操作的流速，并且由于质量和流速在连接过程中得到关联，因此还控制成批装入。从分流收集的材料被用来产生伪产品池，用于评估每个连接步骤的良率和杂质去除性能。

TFF通量偏移

通过在蛋白浓度范围(典型地10到80g/L)、供液交叉流速范围(1到6L/min/m²或LMM)和TMP范围(10到25psi)内获得渗透通量测量在AKTAcrossflow上进行通量偏移实验，从而凭经验确定滞留膜模型参数(见以下方程式)。使用来自先前单元操作的盐缓冲液中的蛋白进行通量偏移以最佳模拟连接UF阶段(UF1a)的性能。允许产物在每个浓度、TMP和供液交叉流速下再循环，直到获得稳定的渗透通量和Delta压力(供液-滞留液)。其中渗透压力大于4psi的数据点不包括在分析之列。在每组TMP测量之后，在渗透液出口闭合的情况下通过再循环将薄膜去极化。然后，就通量(J)对比C_b的自然对数(测试的蛋白浓度)方面绘制此数据。

过滤器大小设定

病毒过滤器面积大小设定取决于连接过程的流速和最大可允许操作压力。在蛋白浓度的峰值处发生最低的观察到的病毒过滤器渗透率(规格化以用于压降的过滤通量)。此最低的观察到的渗透率(k_VF,min)可以用于设置可以在最高压力限制(P_VF,max)内操作的最大通量(J_VF,max)，如J_VF,max＝k_VF,min×P_VF,max所描述。可以通过方程式1确定所需过滤器面积(A_VF)，其中Q_VF是过程流速。

关于TFF建模，Ng P、Lundblad J、Mitra G，1976年，《通过透滤进行的溶质分离的优化(Optimization of solute separation by diafiltration)》，《分离科学(Separation Science)》11(5)：499-502页的研究描述了基于滞留膜模型的TFF渗透通量。滞留膜模型可经修改以包含与质量交换系数相关的供液交叉流速(k＝k_ovⁿ)，其中k_o是经验常数，v是供液交叉流速，并且n是用于供液交叉流速相关的功率项。此修改后的滞留膜模型在方程式2中示出，其中J_TFF是渗透通量，C_w是接近薄膜壁的蛋白的浓度，并且C_b是体积蛋白浓度。

源于通量偏移并与从过程获得的输入参数组合的参数用于通过求解关于C_b的方程式2确定在处理的连接部分结束(UF1a结束)时目标的最佳最终浓度。根据进口的过程流速和TFF过滤器面积确定所需渗透通量。供液交叉流速设置在系统和薄膜的性能上限，典型地为6LMM。接着可以使用方程式3基于关于过程的总预期质量m确定目标滞留液槽液位设定值。

结果

连接过程的设计和流速控制

连接系统的总体设计类似于离散系统，类似之处在于标准单元操作的主要组件和功能很大程度上保持一样。在连接系统中，大的池罐由具有短停留时间(典型地5到7分钟)的小缓冲容器替代，所述小缓冲容器用作单元操作之间的压裂(图12)。分批稀释和滴定由线上添加替代。设计连接系统的过程控制的关键在于确定如何管理单元操作之间的流速差别。在最终TFF步骤中，将产品初始地浓缩成所需滴定终点以用于执行透滤。管理随着当质量添加到滞留液槽时产品浓度增加而出现的渗透通量减小存在挑战；渗透通量的这种减小归因于薄膜的浓度极化作用。对于离散分批进料TFF，滞留液槽的进口流速将减小以匹配渗透液流速从而维持恒定滞留液体积。由于以离散单元操作来操作TFF步骤，因此不存在因这种流速减小而对任何其它单元操作产生影响。然而，在连接过程中，进口液流直接连接到先前上游操作，并且渗透液流速的任何减小都将引起流速差别。对于直接或通过病毒过滤步骤连接恒定流速层析步骤与可变渗透通量TFF步骤的过程顺序，需要主动地管理不匹配流速。这可以使用三个不同策略在TFF操作期间完成：1)可变流速策略、2)恒定流速策略、或3)浪涌策略(图13，表1)。应注意，初始浓度是在最终TFF步骤中连接的唯一阶段，因为一旦产品质量完全包含在滞留液槽中，就可以标准离散过程进行透滤和最终浓度步骤的其余部分。

在可变流速策略中，类似于离散分批进料操作来操作TFF，类似之处在于随着质量在滞留液槽中积聚，渗透通量降低。为了平衡系统流速，上游单元操作的流速也减小以匹配渗透通量。这维持恒定滞留液体积，但是导致层析步骤的可变流速。流速变化的幅度可能导致至少两倍减小，这会对层析步骤的性能产生潜在影响。

替代方案是恒定流速策略，其中渗透液流速和进口流速均维持在恒定值，以贯穿先前单元操作维持恒定滞留液体积和恒定流速这两者。为了获得恒定渗透液流速和进口流速，使用TFF供液交叉流速和跨膜压(TMP)两者开发新颖策略以主动控制渗透通量。TFF供液交叉流速能够直接影响质量交换率并因此影响跨薄膜通量。跨膜压(TMP)还控制渗透通量，但是当达到通量受限模式时，在较高蛋白浓度和较高TMP下此参数已经降低控制性。在此控制策略中，当贮槽中的产品浓度低时从连接过程一开始就使用较低交叉流速和TMP，随着产品浓度增加而逐渐增加这两个参数以维持恒定渗透液流速。这种方法被开发到自动化控制系统中，所述自动化控制系统同时调制供液交叉流速和TMP两者的输入参数以实现恒定渗透液出口流速，因此使连接的过程系统能够在没有流速差别的情况下进行操作。

最终控制策略，即浪涌策略，几乎可以被描述为不存在主动流速控制。在此策略中，当渗透通量出现下降时，进口流速仍旧维持在恒定速率下，这接着诱发TFF滞留液槽中的体积激增。在实践中，TFF系统将出现一些自调制，因为当贮槽中的体积激增时，产品浓度的增加速率将减慢，正如通量下降。

这三个描述的控制策略表示针对流速控制的可用选择，当然最终可以混合使用这些策略来实现最佳的总体过程，所述过程平衡对于薄膜面积和处理时间的要求、对于影响先前单元操作的流速下降的要求以及对于滞留液容器体积的要求。以下部分描述使用恒定流速策略的连接过程的开发，重点描述连接过程特有的方面和参数。选择此策略是因为其操作和过程开发的方便性，因为其维持层析和病毒过滤步骤的恒定流速，并将需要研究的动态影响的减到最少。

连接过程的开发

开发连接两个精制柱、病毒过滤和TFF的过程与个别地开发这些单元操作相比要求进行额外考虑。这些考虑包含：1)估计B/E柱洗脱对后续步骤的影响；2)当需要在与B/E池的pH值不同的pH值下操作后续步骤时开发线上pH值滴定方法；3)以可变供液组成物开发流速驱动的病毒过滤步骤；4)在连接过程期间以恒定渗透通量开发TFF步骤。

第一层析步骤的开发

由于连接过程链中的第一步骤呈现均匀的负荷，过滤的病毒在蛋白A产品池灭活，因此其可以独立开发为离散的过程，因此这里将不详细讨论。然而，对于连接过程存在两个重要考虑。首先，当具有梯度洗脱的B/E步骤(例如，CEX)用作连接过程的第一步骤时，所有后续步骤经历由第一步骤洗脱产生的产品浓度峰值以及盐浓度梯度。取决于所获得的最大产品浓度，此类浓度峰值会给下游带来挑战，特别是对于病毒过滤步骤。为了减轻高峰值浓度对后续步骤的影响，可以采用较浅的盐洗脱梯度。这将减小峰值浓度并且允许产品以可接受的反压流经其余的步骤。其次，由于所有步骤都连接起来，因此需要基于其余步骤的性能优化第一步骤洗脱的体积流速。

第二层析步骤的开发

以流通模式操作连接过程示意图中说明的第二步骤，所述第二步骤可以是基于树脂或基于薄膜的层析。此第二步骤通常是针对整个下游过程的第三且最后一个层析步骤，然而，当双柱过程展现出足够的杂质和病毒去除能力时可不需要这一步骤。用于典型mAb纯化过程的此步骤的目的是去除宿主细胞蛋白并且潜在地进一步减小高分子量(HMW)和DNA。当此流通步骤连接到B/E步骤作为第一步骤时，其供液不再如以离散模式所操作的那样均匀，但在蛋白浓度和电导率方面呈现动态。由于先前的盐梯度洗脱，在装入期间流通步骤的供液流的电导率增加，并且在装入结束时达到最大。因为这一点，重要的是选择维持广泛范围电导率内稳定的杂质清除率的树脂或吸附薄膜；AEX薄膜STIC层析是耐盐吸附基质的一个实例。为了估计负荷电导率对宿主细胞蛋白去除的影响，负荷电导率变化的几个离散流通实验足以评估所述影响。图14a将进行流通STIC步骤时负荷电导率对CHOp去除的影响进行比较。结果表明，电导率对于CHOp去除而言并未起显著作用，正如基于针对此装置优化的配体的高耐盐性所预期。因此，来自第一步骤的洗脱物可在不稀释的情况下直接供应到第二连接步骤中。

为了更有效地去除宿主细胞蛋白，例如对于AEX FT步骤，可能需要在比B/E步骤的pH值更高的pH值下操作流通步骤。需要几个不同的pH值侦察实验以找到对于此流通步骤最佳的操作pH值。图14b示出在较高pH值下经由AEX薄膜层析进行的宿主细胞蛋白去除提供了更佳清除率。关于这个实例，由于所有四个测试的pH值均提供可接受的清除率，因此选择pH值5用于STIC操作，这样的优势在于在连接处理期间能避免滴定步骤。当然，对于其中需要pH值滴定以实现所需宿主细胞蛋白去除的情况，需要进行线上pH值滴定方法。

线上pH值滴定步骤的开发

当先前步骤使用不同于后续步骤的可操作pH值时需要中间产品池的pH值滴定。在离散模式中，可以易于通过将规定量的滴定剂添加到均匀产品池中来执行pH值滴定从而实现目标pH值。然而，在连接过程的情况下，需要线上pH值滴定以改变来自先前步骤的产品流的pH值，因为所述产品是连续地装入到接下来的步骤。潜在地需要连接过程中的pH值滴定的产品流是用于流通或病毒过滤步骤的供液流，有时是用于UF步骤的负荷。如果用于每个步骤的栈板或系统最少具有用于同时输送供液和滴定剂流的双泵设计，那么可以在不具有额外泵的情况下调节用于流通和病毒过滤步骤的供液流的线上pH值滴定，后续经由被动混合器进行混合。当UF负荷要求滴定时可能需要额外泵将滴定剂输送到TFF滞留液槽中。

不论引入线上pH值滴定的位置，当选择滴定剂时需要考虑来自粘合和洗脱步骤的洗脱液中的蛋白浓度和电导率的变化。此外，当在恒定的滴定剂与产品体积比下引入滴定剂到产品流中时，过程和系统设计得以简化。此体积比应较低以避免产品流的过度稀释，但是在泵流速线性范围内足够高。基于这一点，通常建议0.1到0.2的体积或流速比。

线上pH值滴定开发开始于跨粘合和洗脱步骤的洗脱的多个馏分的离线pH值滴定。筛选经过滴定的馏分的产品浓度和pH值以确保在添加相同体积比下的滴定剂的情况下每个馏分达到目标pH值。在确认滴定剂之后，采用实验室规模的连接运行来验证结果。图15示出以400mM三羟甲基氨基甲烷的滴定剂、pH值8.3、在0.1的体积比下进行的CEX洗脱的从pH值5.0到pH值8.0的线上pH值滴定。在线上滴定之后，产品流经过分馏，并且使用离线pH值探针分析每个馏分。如图15中所示，贯穿洗脱峰值获得目标pH值。

病毒过滤步骤的开发

连接的病毒过滤步骤的初步开发与离散步骤开发的类似之处在于分子和溶液特性驱动适当病毒过滤器和预滤器的选择并且指定薄膜的液压渗透性能。由于病毒过滤器连接到指定通过过滤器的流速的先前单元操作，因此有利的是选择具有高膜渗透率的病毒过滤器以减少所需的薄膜面积。另外，病毒过滤器在暴露于变压以及在产品浓度和电导率两者上随时间推移而变化的供液组成物时必须能够有效地操作。此处，使用Viresolve Pro(VPro)过滤器作为一实例。此过滤器具有高膜渗透率并且总体上展现稳定操作而不论分子、供液组成物和压力变化，尤其在使用预滤器时。常用预滤器包含深度过滤器和基于电荷的预滤器(Ng P、Lundblad J、Mitra G，1976年，《通过透滤进行的溶质分离的优化(Optimization of solute separation by diafiltration)》，《分离科学(Separation Science)》11(5)：499-502页；Brown A、Bechtel C、Bill J、Liu H、Liu J、McDonald D、Pai S、Radhamohan A、Renslow R、Thayer B、Yohe S、Dowd C，2010年，《使用吸附离子交换薄膜的预滤提高单克隆抗体的小病毒过滤器通过量(Increasing parvovirus filter throughput of monoclonal antibodies using ion exchange membrane adsorptive pre-filtration)》，《生物技术和生物工程文摘(Biotechnol and Bioeng)》106(4)：627-637页)。

使用均匀供液的分批过滤实验可以提供具有不同吸附特性的预滤器之间的相对性能比较。另外，分批实验可以用于筛选病毒过滤器负荷的最佳pH值设定值。图16示出当使用两个不同预滤器时pH值对VPro通量的影响：1)Viresolve预滤器(VPF)，由具有带电粘合剂的硅藻土组成；和2)Viresolve Shield，由带负电的薄膜组成。对于mAb D，带负电的Shield预滤器在低pH值处显示出更佳性能，正如基于mAb的高pI所预期，或更确切地说，mAb聚合杂质以及相互作用的阳离子交换机制。相反，VPF预滤器在高pH值处显示出更佳性能。这可以表明在更接近分子的pI的pH值处且在高盐溶液条件下更疏水性的相互作用机制。此实例说明执行分批研究来评估预滤器和pH值条件的相对性能的优势。

为了评估用于连接过程的病毒过滤器的性能，可以考虑两种不同的方法。如在先前实例中，可以在病毒过滤器上单独以分批模式进行实验；这可以通过形成具有改变的产品和盐浓度的多个供液材料来完成。这些实验可以作为实验设计(DoE)来进行以研究蛋白浓度、盐浓度以及甚至压力或流速对薄膜性能的相对影响。可以选择范围以估计从先前层析步骤观察到的产品和盐浓度的端值，并且支持病毒过滤器所经历的压力范围。用于估计连接性能的第二方法是以规模缩小的系统模拟实际连接过程。此类方法将产生改变先前层析步骤的蛋白和盐浓度的代表性的时间可变供液，其将直接装入到病毒过滤器上。图17a中示出连接到具有预滤器的VPro的具有CEX梯度洗脱的连接运行过程的实例。病毒过滤器上蛋白浓度和电导率的变化是从CEX梯度洗脱的结果，在装入过程结束时的平线区是归因于缓冲容器的排空。由于在恒定流速下操作所述运行过程，蛋白浓度的增加会导致病毒过滤器上压力的增加，这对应于膜渗透率的最初减小以及后续当蛋白浓度下降时渗透率的恢复。最终渗透率类似于开始渗透率，这表示在运行期间积垢最少。

图18中示出连接模式和分批模式中的病毒过滤器性能的比较结果。使用VPF和VPro过滤器用mAb C进行这两组实验。以5或40g/L的蛋白浓度、0或250mM的氯化钠浓度以及15或45psi的压力(那些参数的中间点处具有重复中心点)进行具有10次运行过程(以2个中心点重复)的分批析因设计实验。所进行的连接实验类似于图17a中示出的实验，其中转换的数据显示取决于瞬时蛋白浓度的VPro渗透率。选择分批条件以涵盖连接过程中所呈现的范围条件(图17a)。分批结果表明测试范围内的盐浓度和压力对渗透率具有极少影响，而增加的蛋白浓度显示出降低渗透率的明显趋势。来自连接实验的结果遵循了与分批实验类似的渗透率趋势，然而，分批模式中的过滤器渗透率整体比连接模式中的渗透率更低。这些结果并非意料之外，只要CEX和VF步骤的同时操作将保持CEX池的持续时间减到最少并且因此将病毒过滤器积垢组分的形成减到最少。这些结果表明，分批实验可以提供对于操作参数的相对影响的定向趋势，以及初步指示取决于蛋白浓度的最小预期膜渗透率。最终，应针对最终过程标准使用代表性的连接运行过程。

一旦已经确定病毒过滤器的液压膜渗透率特性，就可以针对连接过程恰当地设定病毒过滤器面积大小。通过先前层析步骤的流速设定值预先确定整个病毒过滤器的流速。由于操作模式是恒定流速，因此病毒过滤器的大小设定是基于维持供液压力低于指定的最大限制。可以通过病毒过滤器、预滤器、或甚至操作系统指定限制。例如，制造商设置的VPro滤波器的最大压力限制是60psi，并且VPF的最大压力限制是50psi，因此可需要对病毒过滤器施加40到45psi的操作压力限制以便满足预滤器限制。以分批或连接模式进行的实验可以提供基于最大预期蛋白浓度的最小预期渗透率。在已知流速、最大压力和最小渗透率的输入的情况下，可以使用方程式1计算病毒过滤器面积。图20的表2中示出了各种连接过程的病毒过滤器大小设定。

在离散病毒过滤过程中，通过估计正常操作范围内供液组成物的变化来评估稳定性。连接过程中可能影响装入到病毒过滤器上的供液分布的一个参数是病毒过滤器之前的缓冲容器的停留时间。将缓冲容器停留时间减到最少将使得先前层析洗脱分布几乎直接传送到病毒过滤器上。相比而言，将缓冲容器停留时间增至最多将使得整个层析洗脱池汇集，并且因此实质上致使病毒过滤步骤成为离散操作。进行实验以比较5分钟和25分钟的缓冲容器停留时间(分别为图17a和17b)。正如期望，短停留时间对应于最大的观测到的峰值变化，而长停留时间产生相对均匀的池。

连接切向流过滤步骤的开发

如引言中所描述，可以用来将先前下游单元操作连接到切向流过滤(TFF)步骤的一个控制策略是恒定流速策略，其中在整个连接操作期间TFF滞留液槽体积和渗透通量均维持恒定。在连接处理过程期间质量在TFF滞留液槽中积累，并且当在连接过程结束时所有质量均处于TFF滞留液槽中时达到最高蛋白浓度。为了在连接过程结束时维持恒定渗透通量，需要指定TFF滞留液体积设定值和薄膜面积以适应连接的进口流速和最高预期蛋白浓度。执行实验室规模的通量偏移研究以映射出TFF渗透通量对改变的供液交叉流速、跨膜压(TMP)和供液浓度的响应，并拟合模型参数与滞留膜模型(方程式2)。此模型可以用来计算连接过程的指定参数。

图19中示出针对来自先前单元操作的盐缓冲液中的mAb C的实例通量偏移数据集。以低盐(30mM NaCl)和高盐(150mM NaCl)条件两者执行通量偏移，从而估计归因于先前CEX盐梯度洗脱的盐浓度变化的影响。对于此通量偏移研究，将9-88g/L的浓度范围定为目标，其中TMP范围为5-20psi并且供液交叉流速范围为1-6LMM；图19中示出20psi TMP数据。对于此实例和后续实例使用Pellicon 3 30kDa再生纤维素薄膜。结果显示出高盐条件与低盐条件之间类似的性能，这表示TFF薄膜的性能受可变盐浓度的影响最小。对于多个分子已观测到此相同的趋势(数据未示出)。图19中基于高盐的通量偏移数据的渗透通量模型参数是：k_o＝8.47、C_w＝175以及n＝0.73。对于连接过程，可以使用方程式2和3以及模型参数，基于渗透通量的已知输入(连接进口流速/TFF面积)来计算TFF滞留液体积设定值，基于泵或系统压力限制计算最大供液交叉流速，以及计算最大预期质量。如引言部分中所描述，一旦达到滞留液体积设定值就开始连接的TFF过程。最初供液交叉流速和TMP在低设定值，以便实现低蛋白浓度下的恒定渗透通量目标。随着质量积累以及蛋白浓度增加，供液交叉流速和TMP斜升以维持恒定通量目标，其中最大供液交叉流速维持在低于系统限制。图19中的叠加箭头在概念上示出了供液交叉流速的斜升；在38LMH的恒定渗透通量处，供液交叉流速将在大约120LMH时起始并在连接过程结束时(UF1a结束)在大约300LMH时结束。图20的表2中示出使用每个分子过程的滞留膜模型参数(未示出)和方程式2计算得出的各种连接过程的UF1a蛋白浓度的目标端值。

一旦确定TFF步骤的初始填充体积参数，单元操作开发的其余部分(例如，透滤和过度浓缩/产品恢复步骤)与对于标准分批TFF过程的开发相同，并且因此在此不再论述。可以从多个方面评估TFF步骤的连接部分的过程稳定性。可以使用模型拟合参数和输入条件的变化经由灵敏度分析来研究预期质量或蛋白浓度、供液交叉流速、TMP和进口流速的变化的影响。通常，应使用安全系数以允许输入条件的变化并且仍然维持恒定渗透通量，即，设置更保守或更高的滞留液体积设定值标准。渗透通量还可受操作的固有膜渗透率和温度影响；可以关于这些输入参数进行实验。

过程监测

与离散模式相比，连接过程中的单元操作需要额外的过程监测以促进单元操作过渡、协助压力控制，并且提供关于运行本身性能的必需信息。缓冲槽液位监测提供重要的过渡信号，所述信号被实时地传送到相应单元操作。例如，当后置CEX层析缓冲槽液位达到其预定值时，控制系统发送此信号到流通层析栈板以开始从缓冲槽的装入。当后置CEX层析缓冲槽液位达到零时，流通栈板上的装入阶段停止并且洗涤阶段开始。对于病毒过滤步骤，在恒定流速下进行操作并且监测过滤器进口压力。当峰值浓度的产品经过病毒过滤器时进口压力波动。如果达到最大压力限制，则触发控制系统降低病毒过滤流速并且允许提高流通缓冲槽的液位。在TFF步骤中，在连接过程期间通过流速计测量渗透液流速，所述流速计不仅提供通量信息，而且还与控制系统通信以通过调整供液交叉流速和TMP将渗透通量维持在预设值。另外，控制系统监控TFF滞留液槽的液位并且通过调节进口或病毒过滤步骤流速维持恒定体积。

通常通过测量整个均匀产品池的产品浓度并将所述浓度与均匀供液以及相应体积进行比较来获得离散过程的步骤良率信息。由于所连接单元操作的同时操作不允许收集整个池，因此在池收集期间小的分流从主要产品流中分流出。这种伪产品池接着提供样本用于浓度测量和产品质量测定。还可以通过整合UV A280nm或A300nm信号并使用以实验方式确定的产品特定的消光系数在栈板上实时获得良率信息。可以在紧接在TFF步骤前的VF步骤上使用UV整合方法以计算在所连接过程结束时TFF滞留液槽中积累的质量。此积累的质量相当于以离散模式操作时的TFF负荷质量，这是用于确定透滤和过度浓缩的滞留液槽体积水平的重要参数。

大规模的性能

如先前的部分中所描述，主要以离散模式开发连接过程中的每个单元操作，且接着以实验室规模将所述单元操作连接在一起用于测试和进一步优化。接着扩大所述过程并转入试验工厂用于证实和确认。表2列出对于使用连接过程CEX-AEX(FT)-VF-UF及已经在试验工厂成功执行的其变化形式的5种不同分子的运行参数。缓冲槽位于层析步骤与VF前方之间，具有100L的大小，并且以5到7分钟的停留时间设定值操作。图20的表2中列出的良率已经以试验规模展示并且与离散模式的操作类似(离散数据未示出)。

图21中示出对于mAb B的连接下游过程(CEX-HIC(FT)-VF-UF)的可操作趋势的实例。图21a示出历时70分钟的所连接下游过程期间产品质量的时间进展。以离散模式执行UF步骤的其余部分，并且在这段时间期间，其它单元操作完成其清除和平衡步骤以准备好接下来的所连接循环。HIC(FT)和VF步骤的浓度分布对应于CEX步骤的洗脱峰值，其中归因于负荷的线上滴定稀释在HIC(FT)步骤具有较低浓度，并且归因于管线滞留量和缓冲槽混合体积在VF步骤具有略微更低的浓度。HIC(FT)和VF步骤的浓度分布的后半部分趋平；这表示当先前的所连接单元操作已经完成并且缓冲槽排空时的操作阶段。

图21b示出了所连接VF分布，包含流速设定值、流速、渗透率、Vpro压降(dP)和蛋白浓度。VF流速设置为8.1L/min，对应于HIC(FT)步骤的流速，然而一旦开始了UF步骤，就允许VF流速从其设定值开始变化以维持恒定的UF滞留液槽水平(图21b)。跨VF的压降对应于流速变化，但是当流速经压降规格化时，过滤器的渗透率分布相对平缓。当过滤器上蛋白浓度增加时渗透率存在轻微下降，且接着当蛋白浓度减小时其恢复到初始渗透率。

图21c示出所连接UF1a趋势，以及操作的UF1b(分批浓度到DF设定值)和DF阶段的离散趋势。如先前所描述，VF流速围绕其设定值变化以维持滞留液槽水平设定值；在图21c中可以观测到这种过程控制的结果。UF渗透液流速设定值与VF流速设定值相同，其中供液交叉流速和TMP控制UF渗透液流速。观测到当贮槽中的蛋白浓度增加时供液交叉流速和TMP均逐渐增加，并且控制策略能够将渗透液流速维持在其设定值。

如引言中所论述，连接下游单元操作的主要优点之一是中间池槽体积的减小以及因此制造厂占用面积的减小。图22示出了针对图20的表2中描述的过程中的每一者对于离散过程的贮槽体积要求对比连接过程的贮槽体积要求的比较。由于制造厂将需要设计针对最大预期池体积的池槽大小，因此离散过程将需要至少1000L的贮槽。这明显大于用于连接过程的以5到7分钟停留时间操作的100L的缓冲槽。另外，因为VF池槽可以直接连接到UF滞留液槽，因此在连接过程中完全排除了VF池槽。

论述和结论

以上实验研究概述了通过最终TFF步骤从精制层析步骤连接的下游过程的概念并证实了其在试验规模的成功执行。可以使用多个流速控制策略来管理单元操作(确切地说，层析步骤)之间的流速差别以及TFF步骤的可变渗透液流速。提出恒定流速策略作为维持恒定的TFF渗透液流速以及因此层析和病毒过滤步骤的恒定流速的方式。这将所连接过程的开发期间需要研究的动态影响的数目减到最少。此控制策略还形成所连接操作的整个过程中的恒定缓冲槽和TFF滞留液槽体积，这允许更简单的过程、设备和自动化设计。

所连接下游过程的开发在许多方面类似于离散过程的开发。树脂选择、病毒和预滤器选择、以及pH值、电导率和产品浓度等负荷条件都可以通过标准分批实验来研究。然而，在连接过程的开发中存在要考虑的多个独特方面。作为一个实例，当第一所连接步骤是具有盐梯度洗脱的B/E层析步骤时，较浅的梯度斜率可对病毒过滤等后续单元操作有利，能管理传导通过所述过程的峰值产品浓度。较浅的梯度斜率可具有的一个优点是B/E层析步骤上杂质分离的选择性提高；基于过程要求而不是贮槽体积限制的约束选择梯度斜率具有灵活性。第一层析步骤还在设置整个所连接过程的流速时具有重要性，并且因此可能需要经过优化以实现过滤步骤的更经济的大小设定。对于中间层析步骤，需要评估梯度洗脱的影响。应进行实验以研究电导率对步骤性能的影响。虽然本文将中并未呈现数据，但是可以进行额外实验以研究由梯度洗脱引起的产品浓度和杂质分布的变化的影响。还可以筛选可操作pH值，并且在单元操作之间的pH值改变的情况下，可以针对所连接处理开发并实施线上pH值滴定。

此处突出显示的实例说明用于开发所连接过滤步骤的途径。一旦选择了预滤器和病毒过滤器，并确定供液条件，就需要相对较少的连接过程实验以确定过滤器大小设定要求并评估病毒过滤器针对供液组成物变化的稳定性。对于TFF步骤，自动化控制策略的开发和实施是管理恒定渗透液流速操作所必需的，然而，所述步骤的开发可以大部分通过离散实验完成。以实验室规模进行的通量偏移研究以及相应通量模型用于指定以恒定通量模式操作所连接步骤所需的参数。这些可以直接应用于扩大的连接过程，绕过小规模的所连接运行过程。

针对连接过程必须考虑额外处理监测能力，例如，用于开始和结束单元操作的载入的缓冲槽液位控制。可以实施线上UV整合以确定TFF步骤的质量输入，因此允许针对透滤和过度浓缩设置体积目标并且确定步骤良率。还应将分流泵并入到栈板设计中以允许评估个别步骤性能和杂质清除率。

如所描述，处理整个采集批次需要连接过程的多个层析循环，每个所连接循环耗时1到2小时。通常循环层析步骤以减少柱大小要求和树脂成本，并且通常清洁并重复使用TFF薄膜，因此使用这些步骤的连接过程的多个循环是简单明了的。相比而言，在离散过程中，常规地采用病毒过滤器用于产品装入的单个循环并接着进行单个缓冲液冲洗。对于连接过程，对于单个连接循环未充分利用病毒过滤器上的装入。图20的表2中示出的实例表明2到4kg/m²的负荷对于连接的病毒过滤步骤是典型的，而对于此过滤器类型可实现至少20kg/m²的负荷(Bolton G、Basha J、LaCasse D，2010年，《通过小病毒保持过滤器实现医用蛋白的高质量通过量(Achieving high mass-throughput of therapeutic proteins through parvovirus retentive filters)》，《生物技术进展(Biotech Progress)》26(6)：1671-1677页)。为了提高病毒过滤器用于所连接过程的效率，可以针对整个采集批次使用同一病毒过滤器，其中对于每个连续循环产品装入阶段后接缓冲液冲洗阶段。病毒过滤器将经历产品和缓冲液的交替循环，但是过滤器性能预期由所有循环的总产品装入决定。在完成所有循环之后将进行后续使用的过滤器完整性测试以确认过滤器仍保持整合。这种方法通过减少过滤器面积以及因此制品成本的要求提供了明显优势，消除了与过滤器更换相关联的耗时的安装和制备步骤，并且通过在病毒过滤器之后保持系统关闭将外来介质引至过程流中的风险减到最小。由于在多循环的所连接处理的情况下工厂调度和设备利用的复杂度增加，因此将需要模拟工厂资源以确保设备维修周期限制内的适当设施配合。另外，评估连接过程中的个别步骤的病毒清除能力，包含病毒过滤器的循环，值得认真考虑。例如开发合格的规模缩小的模型和引入病毒掺加到连接过程中等方面将作为后续文件的主题来解决。

此处呈现的所连接下游过程提供减小池槽体积的直接优势，因此产生更新型的设施设计。贮槽大小的减小开拓了使用移动贮槽的可能性，移动贮槽可易于针对具有不同过程要求的多个产品重新配置。这使得资金成本降低并且提供制造灵活性。最终目标是为了完全连接采集、蛋白A和下游步骤以用于完全连续的制造。这将需要实施连续蛋白A撷取步骤，利用连续多柱层析法(SMCC)或模拟移动床(SMB)技术，开发低pH值病毒灭活分批操作的替代方案，并实施所有流通精制步骤。这在近期可以是可实行的，如近期集中讨论连续制造和过程整合的评论文章所证明(Konstantinov K和Cooney C，2014年，《关于连续生物处理的白皮书(White paper on continuous bioprocessing)》，《药学杂志DOI(J Pharm Sci DOI)：10.1002/jps.24268；Jungbauer A，2013年，《生物药品的连续下游处理(Continuous downstream processing of biopharmaceuticals)》，《生物技术趋势(Trends in biotechnology)》，31(8)：479-492页)。本文件中呈现的通过最终TFF步骤连接下游精制步骤的概念和控制策略推动这一技术向其目标又迈进了一步。

虽然前述文字阐述本发明的不同实施例的详细描述，但是应理解，本发明的法律范围由本专利的所附权利要求书的言辞来限定。所述详细描述应理解为仅示例性的而不是描述本发明的每一个可能实施例，因为描述每一个可能实施例即使并非不可能也是不切实际的。可以使用现有技术或在本专利的申请日之后开发的技术实施多个替代实施例，且所述替代实施例仍落入限定本发明的权利要求书的范围之内。

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