用于非侵入性产前测试的基于微流体的胎儿细胞的检测和分离的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年1月23日提交的名称为“用于非侵入性产前测试的基于微流体的胎儿细胞的检测和分离”的美国临时申请第62/107,261号的优先权，将其内容通过引用整体并入本文。

背景技术：

发明领域

本文公开的实施方案涉及用于非侵入性产前诊断的基于微流体的来自母体血液的胎儿细胞的检测和分离的方法、装置以及试剂盒。

相关技术描述

用于非侵入性产前诊断的来自母体血液的胎儿细胞的分离由于此类细胞的稀缺性而呈现出多种挑战。已经尝试了多种方法以提取和分析此类细胞来用于下游遗传分析和诊断测定，但此类提取的成功率和纯度非常差。此外，基于facs的分析之外的此类检测和提取的通量仍然很低，从而在非侵入性产前检测领域呈现另一挑战。因此，迄今为止，非侵入性产前诊断主要依赖于分析来自母体血液的无细胞dna(cfdna)。但是，高度片段化的cfdna在分析该dna并提供完整的胎儿基因组异常(当存在时)的产前分析时呈现出许多挑战。

发明概述

本文公开的实施方案提供了分离用于非侵入性产前诊断的胎儿细胞的方法，其包括：提供母体血液样品；将母体血液样品施用于集成在微流体装置上的过滤器，从而从母体血液样品中富集有核血细胞；在微流体装置内，用特异性结合胎儿细胞特异性抗原或非胎儿细胞特异性抗原的荧光结合部分或亲和分子标记富集的有核血细胞；和分离胎儿细胞。在一些实施方案中，过滤器是透明的。在一些实施方案中，通过细胞的形态和/或其它物理特征富集有核血细胞。在一些实施方案中，方法还包括使微流体装置内显微镜可视化室中标记的有核血细胞可视化。在一些实施方案中，方法还包括选择性地固定配备有过滤器的微流体装置内标记的有核血细胞，用于可视化和/或显微镜分析。在一些实施方案中，可视化和/或显微镜分析是手动的。在一些实施方案中，可视化和/或显微镜分析是通过机器视觉自动化的。在一些实施方案中，胎儿细胞是有核红细胞(nrbc)。在一些实施方案中，胎儿细胞特异性抗原选自cd45、转铁蛋白受体(cd71)、血型糖蛋白a(gpa)、hla-g、egfr、血小板反应蛋白受体(cd36)、cd34、hbf、hae9、fb3-2、h3-3、红细胞生成素受体、hbe、afp、apoc3、serpinc1、ambp、cpb2、itih1、apoh、hpx、β-hcg、ahsg、apob、j42-4-d、2,3-二磷酸甘油酸(bpg)、碳酸酐酶(ca)、胸苷激酶(tk)、mmp14(基质金属蛋白酶14)和胎儿血红蛋白。在一些实施方案中，过滤器被配置为富集有核血细胞和/或去除成熟红细胞(rbc)。在一些实施方案中，方法还包括去除非胎儿细胞。在一些实施方案中，去除非胎儿细胞包括固定非胎儿细胞。在一些实施方案中，方法还包括固定胎儿细胞。在一些实施方案中，固定胎儿细胞包括将胎儿细胞与特异性结合胎儿细胞特异性抗原的结合部分或亲和分子接触。在一些实施方案中，胎儿细胞特异性抗原选自cd45、转铁蛋白受体(cd71)、血型糖蛋白a(gpa)、hla-g、egfr、血小板反应蛋白受体(cd36)、cd34、hbf、hae9、fb3-2、h3-3、红细胞生成素受体、hbe、afp、apoc3、serpinc1、ambp、cpb2、itih1、apoh、hpx、β-hcg、ahsg、apob、j42-4-d、2,3-二磷酸甘油酸(bpg)、碳酸酐酶(ca)、胸苷激酶(tk)、mmp14(基质金属蛋白酶14)和胎儿血红蛋白。在一些实施方案中，方法还包括使用其它常用方法如fish或dna微阵列通过测序或者检测分离的胎儿细胞中的遗传异常来分析分离的胎儿细胞的核酸序列。在一些实施方案中，分析核酸分子的核苷酸序列包括将可检测的探针与一个或多个分离的胎儿细胞的基因组dna杂交。在一些实施方案中，分析核酸分子的核苷酸序列包括对一个或多个分离的胎儿细胞的基因组dna进行测序。在一些实施方案中，对基因组dna进行测序包括对单个细胞的dna进行测序，并且其中对一个或多个分离的胎儿细胞进行单个细胞的dna测序。在一些实施方案中，分析基因的表达包括将可检测的抗体与一个或多个分离的胎儿细胞的表面杂交。在一些实施方案中，分析分离的胎儿细胞的遗传缺陷。

本文公开的实施方案提供了用于非侵入性分离胎儿细胞的集成微流体装置，其包括：过滤器；结合部分或亲和分子，其特异性结合胎儿细胞特异性抗原或非胎儿细胞特异性抗原；和显微镜可视化室。在一些实施方案中，集成微流体装置还包括试剂，所述试剂被配置为检测分离的胎儿细胞的一个或多个核苷酸序列。

本文公开的实施方案还提供了试剂盒，其包含：用于非侵入性分离胎儿细胞的集成微流体装置，所述微流体装置包括：过滤器；结合部分或亲和分子，其特异性结合胎儿细胞特异性抗原或非胎儿细胞特异性抗原；和显微镜可视化室，以及试剂，其被配置为检测分离的胎儿细胞的一个或多个核苷酸序列。

附图简述

图1描绘了在一个实施方案中从母体血液样品中分离胎儿细胞的示例性过程。

图2描绘了针对分离的胎儿细胞的下游分析的示例性过程。

优选实施方案的详述

本文公开的用于胎儿细胞分离的方法和装置将基于亲和和/或生物标志物的分离与基于形态学的分离相结合。通过将这些过程结合到集成微流体装置，本文公开的方法和装置解决了从母体血液样品分离胎儿细胞的通量的存在已久的挑战。与facs不同，本文公开的是基于可视化的方法，其类似于在显微镜平台上进行的成像细胞计数。本文描述的方法可以是部分或全部自动化的，这为本发明增添了另一个好处。

优选地，本文公开的方法和装置利用集成在微流体芯片上的过滤器。这用于分离过程的早期步骤，其允许从母体血液样品中富集有核血细胞。例如，基于形态学的选择过滤器允许大多数或全部成熟红细胞(rbc)通过过滤器上的开口并捕获大部分的有核血细胞。然后，用核染色和/或特异性生物标志物来对有核血细胞进行染色和/或标记，用以对感兴趣的有核血细胞亚群进行阳性或阴性选择。用于非侵入性产前诊断的特别感兴趣的是胎儿有核红细胞(fnrbc)群。

因此，本文公开的方法和装置允许：1)在一个集成平台上进行细胞过滤、染色、富集(如果需要的话)以使人工劳动和干预最小化；2)使用自动化以精简母体血液加工；3)使用微流体用以试剂递送，降低试剂的用量和成本；4)使用密封的微流体室以降低污染和样品混合；以及5)可用于其它功能如细胞裂解的柔性平台。

定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。将本文引用的所有专利、申请、公开的申请和其它出版物通过引用整体并入本文。如果本部分中所阐述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其它出版物中所阐述的定义相反或不一致，则本部分中所阐述的定义优先于通过引用并入本文的定义。

如本文所用，除非另有说明，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一种/一种(an)”和“该(the)”包括复数指代物。例如，“一个”二聚体包括一个或多个二聚体。

如本文所用，术语“微流体装置”通常是指这样的装置，通过其可以传输材料，尤其是承载流体的材料如液体，在一些实施方案中，其是微米级的，且在一些实施方案中，其是纳米级的。因此，由本发明公开的主题描述的微流体装置可以包括微米级特征、纳米级特征及其组合。在此类装置上递送的样品可以是单独的流体或具有悬浮组分如细胞和颗粒的流体。

因此，示例性微流体装置通常包括尺寸在毫米级或更小的量级的结构或功能特征，其能够以大约5ml/min或更小的流速操纵流体。通常，此类特征包括但不限于通道、流体储存器、反应室、混合室和分离区。在一些实例中，通道包括至少一个在约0.1μm至约10mm的截面尺寸。在此量级上使用的尺寸允许将更多数量的通道并入较小的区域，并且使用较小体积的流体。

微流体装置可以单独存在或可以是微流体系统的一部分，所述微流体系统(例如但不限于)可以包括：用于将流体如样品、试剂、缓冲液等引入系统和/或使其通过系统的泵和阀；检测设备或系统；数据存储系统；以及控制系统，所述控制系统用于控制装置内的流体传输和/或方向，使用传感器(在适用的情况下)来监测和控制装置中的流体经受的环境条件，如温度、电流等。此类系统中的阀可以是压力或真空驱动的。

如本文所用，术语“通道”，“微通道”和“微流体通道”可互换使用，并且可以意指通过将来自图案化基底的图案赋予材料或通过任何合适的材料去除技术在材料中所形成的凹部或空腔，或者可以意指与安装在凹部或空腔中的任何合适的流体传导结构(如管、毛细管等)组合的凹部或空腔。

如本文所用，术语“流动通道”和“控制通道”可互换使用，并且可以意指微流体装置中的通道，其中材料(如流体，例如气体或液体)可以流过。更具体地，术语“流动通道”是指其中感兴趣的材料，如任何流体(具有或不具有悬浮材料)或化学试剂可以流过的通道。此外，术语“控制通道”是指其中材料(如流体，例如气体或液体)可以流过，以此方式以驱动阀或泵的流动通道。此类通道中的流体流动可以是压力或真空驱动的以主动流动或者通过表面张力被动驱动的。

如本文所用，“芯片”是指具有多个一维、二维或三维微结构或微米级结构的固体基底，在其上可以进行某些过程如物理、化学、生物学、生物物理学或生物化学过程等。将微结构或微米级结构(如通道和孔、电极元件、电磁元件)并入、组装或以其它方式连接到基底以促进芯片上的物理、生物物理学、生物学、生物化学、化学反应或过程。芯片可以在一个维度上是薄的，并且在其它维度上可以具有各种形状，例如矩形、圆形、椭圆形或其它不规则形状。本发明的芯片的主要表面的尺寸可以显著变化，例如约1mm²至约0.25m²。优选地，芯片的尺寸为约4mm²至约25cm²，其中特征尺寸为约1mm至约5cm。芯片表面可以是平坦的或非平坦的。具有非平坦表面的芯片可以包括组装在表面上的通道或孔。

微流体芯片可以由任何合适的材料制成，所述材料例如pdms(聚二甲基硅氧烷)、玻璃、pmma(聚甲基丙烯酸甲酯)、pet(聚对苯二甲酸乙二酯)、pc(聚碳酸酯)等或其组合。集成在芯片中的过滤器可以由相似的材料或不同的材料制成。

“抗体”是能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点与靶标，如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等特异性结合的免疫球蛋白分子，并且其可以是任何类别的免疫球蛋白，例如igg、igm、iga、igd和ige。igy是禽类(例如鸡)中主要的抗体类型，其也包括在定义中。本文所用的术语不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，而且还包括其片段(例如fab、fab'、f(ab')2、fv)、单链(scfv)、其突变体、天然存在的变体、包含具有所需特异性的抗原识别位点的抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体以及包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。

如本文所用，术语“特异性结合”是指特异性结合对的结合特异性。在存在其它潜在靶标的情况下，特定靶标的抗体的识别是此类结合的一个特征。特异性结合涉及两种不同的分子，其中一种分子通过化学或物理方式与第二分子特异性结合。两种分子在这样的意义中为相关的：它们彼此结合使得它们能够将其结合伴侣与具有相似特征的其它测定成分区分开。结合组分对的成员被称为配体和受体(抗配体)、特异性结合对(sbp)成员和sbp伴侣、抗体-抗原等。分子也可以是用于分子聚集的sbp成员；例如针对第二抗体及其相应的抗原的免疫复合物产生的抗体可被认为是免疫复合物的sbp成员。

应当理解，本文描述的本发明的方面和实施方案包括“由......组成”和/或“基本上由......组成”的方面和实施方案。

本发明的其它目的、优点和特征将通过结合附图从下述说明书中显而易见。

分离胎儿细胞的方法

本文公开的实施方案提供了分离用于非侵入性产前诊断的胎儿细胞的方法。从生物样品(如母体血液样品)中分离胎儿细胞。在一些实施方案中，方法可以包括将母体血液样品施用于集成在微流体装置上的过滤器，从而从母体血液样品中富集有核血细胞。在一些实施方案中，方法可以包括，例如，在微流体装置内，用特异性结合胎儿细胞特异性抗原或非胎儿细胞特异性抗原的荧光结合部分或亲和分子标记富集的有核血细胞，用于阳性选择或阴性选择。

图1所示的流程图中示出了根据所公开的实施方案的用于分离胎儿细胞的方法100的非限制性实例。如图1所示，方法100可以包括如一个或多个操作110-150所示的一个或多个功能、操作或动作。

方法100可以开始于操作110，“提供母体样品”。操作110之后可以进行操作120，“将母体样品施用于集成在微流体装置上的过滤器”。操作120之后可以进行操作130，“标记富集的有核血细胞”。操作130之后可以进行可选操作140，“去除非胎儿细胞”。操作130或操作140之后可以进行操作150，“分离胎儿细胞”。

在图1中，示出了操作110-150按首先是操作110且最后是操作150顺序进行。然而，应当理解，这些操作可以合适地进行组合和/或分成额外的或不同的操作以适合特定的实施方案。例如，可以在一个或多个操作110-150之前、期间或之后添加额外操作。在一些实施方案中，可以在大约相同的时间进行一个或多个操作。在一些实施方案中，方法仅由操作110、120、130和150组成，而没有任何其它操作。在一些实施方案中，方法基本上由操作110、120、130和150组成。在一些实施方案中，方法仅由操作110、120、130和150以及操作140组成，而没有任何其它操作。

在操作110，“提供母体样品”中，可以使用标准抽血从怀孕的人类母亲获得含有一个或多个有核胎儿细胞的母体样品。可以在妊娠早期(怀孕的约前三个月)、妊娠中期(怀孕的约4-6个月)或妊娠晚期(怀孕的约7-9个月)获得母体样品。通常，获得的样品是血液样品。

当从人获得母体样品(例如血液样品)时，样品量可以根据大小、妊娠期和被筛选的病况而变化。在一个实施方案中，获得多达200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或5ml样品。在一个实施方案中，获得5-200、10-100或30-50ml样品。在一个实施方案中，获得多于1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或150ml样品。在一个实施方案中，从孕妇获得约10-100或30-50ml外周血样品。在一些实施方案中，在怀孕36、24、22、20、18、16、14、12、10、8周内或在任何的上述值之间的范围内从怀孕的人类母亲获得血液样品。例如，早在怀孕8周时，从怀孕的人类母亲获得血液样品。在一些实施方案中，甚至在怀孕终止后，从怀孕的人类母亲获得血液样品。

对样品实施一个或多个步骤，所述步骤相对于样品的总组分富集有核胎儿细胞和/或相对于样品中的总细胞富集有核胎儿细胞。在将母体样品施用于过滤器之前，如果需要，母体样品可以按原样使用、预先稀释于期望的缓冲液中或在芯片上稀释。

在一些实施方案中，使用一种或多种基于尺寸的分离方法发生有核胎儿细胞富集。基于尺寸的分离模块的实例包括过滤膜、分子筛和基质。本发明考虑的基于尺寸的分离模块的实例包括国际公开第wo2004/113877号中公开的那些，将其通过引用整体并入本文。其它基于尺寸的分离方法公开于国际公开第wo2004/0144651号和美国专利申请公开第us20080138809a1和us20080220422a1中，将其通过引用整体并入本文。

在操作120，“将母体样品施用于集成在微流体装置上的过滤器”中，可以使用适合于选择有核血细胞和/或成熟红细胞(rbc)的任何过滤器。在一些实施方案中，过滤器可以包括具有允许rbc通过但保留有核血细胞的尺寸和/或形状的开口。例如，开口的尺寸可以为约或小于4.0μm、4.1μm、4.2μm、4.3μm、4.4μm、4.5μm、4.6μm、4.7μm、4.8μm、4.9μm、5.0μm、6.0μm、7.0μm、8.0μm、9.0μm、10.0μm、11.0μm、12.0μm、13.0μm、14.0μm、15.0μm、16.0μm、17.0μm、18.0μm、19.0μm、20.0μm、21.0μm、22.0μm、23.0μm、24.0μm、25.0μm、26.0μm、27.0μm、28.0μm、29.0μm、30.0μm，或任何两个上述值之间的范围，例如2.0μm至2.5μm、1.8μm至3.0μm等。在一些实施方案中，开口的形状可以是矩形、圆形、椭圆形、三角形等或不规则形状。如本文所用，开口的“尺寸”是指过滤器的最小有效开口。因此，在一些实施方案中，当rbc通过具有允许rbc通过而不允许有核血细胞通过的尺寸和/或形状的过滤器上的开口时，可以富集有核血细胞。

在一些实施方案中，可以用选择性结合有核血细胞或rbc的结合部分或亲和分子包被过滤器。例如，可以使用特异性结合有核血细胞的抗体来包被过滤器，使得当rbc通过过滤器时，保留有核血细胞。

在一些实施方案中，即使富集后的产物也能被不感兴趣的细胞(例如，有核母体红细胞)主导(>50％)。在一些情况下，富集的样品的有核胎儿细胞占富集的样品中的所有细胞的至少2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或95％。例如，使用本文描述的方法和系统，可以富集来自怀孕人类的10-20ml母体血液样品的一个或多个有核胎儿细胞，例如有核红细胞，使得富集的样品具有总共约1000个至约1000万个细胞，其中2％的细胞为有核胎儿细胞，其余细胞为母体的。在一些实施方案中，进行的富集步骤已从样品中去除所有不需要的分析物(例如，母体细胞如血小板和白细胞、成熟rbc)的至少50、60、70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.8或99.9％。

在操作130，“标记富集的有核血细胞”中，可以用染料直接或间接地标记富集的有核血细胞。在一些实施方案中，可以使用给dna染色的染料，例如吖啶橙(ao)、溴化乙锭、苏木精、尼罗蓝、赫斯特、番红精或dapi。在一些实施方案中，可以使用细胞类型特异性染料，例如特异性标记胎儿细胞或非胎儿细胞的染料。细胞类型特异性染料可用于例如通过细胞类型特异性抗体直接或间接标记细胞。所涉及的标记策略可以依次进行或同时进行。

在一些实施方案中，可以进行可选操作140，“去除非胎儿细胞”，以富集胎儿细胞。在这一任选操作中，可以通过多种技术从富集的有核血细胞中去除非胎儿细胞。例如，在一些实施方案中，可以通过差别裂解以裂解成熟rbc、或密度梯度离心以富集有核级分、或通过在微流体装置上将非胎儿细胞固定在不同于胎儿细胞所在的微通道或室的微通道或室中，来去除大部分非胎儿细胞。这些富集步骤可以使用上述技术中的一种或组合。也可以在富集的样品加载到芯片上用于胎儿细胞分离之前，在芯片外进行部分富集步骤。例如，非胎儿细胞可以被固定在用特异性结合非胎儿细胞的结合部分或亲和分子包被的微通道或室中。在一些实施方案中，可以通过荧光激活过程去除非胎儿细胞。

基于亲和的富集

在一些实施方案中，可以基于有核胎儿细胞对结合部分或亲和分子的亲和力而对其进行富集。在此类实施方案中，适当地标记结合部分以促进有核胎儿细胞与母体样品的不期望组分相分离。例如，对有核胎儿细胞具有亲和力的结合部分可以结合有核胎儿细胞，并且可以通过与固体支持物(例如磁珠或层析材料的非磁性固相)结合用以分离有核胎儿细胞，或者可以可检测地标记结合部分，使得可以通过检测辅助的有核胎儿细胞的富集、基于可视化或其它方式，将有核胎儿细胞与其它样品组分相区分。

在一些实施方案中，亲和方法包括使用对胎儿细胞表面标志物具有亲和力的直接或间接标记的结合部分或亲和分子。例如，可以将结合部分或亲和分子连接到固定相、荧光团、放射性核素或其它可检测部分，并且可以在允许胎儿有核细胞特异性结合结合部分或亲和分子而样品的其它组分不特异性结合结合部分或亲和分子的条件下，将样品与标记的结合部分或亲和分子接触。然后可以例如使用流式细胞术、成像细胞计数法、显微操纵器、光学镊子、dep、磁捕获、密度离心机以及基于尺寸的液相色谱法来处理标记的结合部分或亲和分子，以将结合标记的结合部分或亲和分子的母体样品的组分与未结合标记的结合部分或亲和分子的母体样品的组分相分离。任选地，可以洗涤母体样品的结合的组分以去除非特异性结合的组分。然后，可以保留或收获结合标记的结合部分或亲和分子的样品组分(其包含胎儿有核细胞)，用以进一步富集或用于分析。

结合部分可以包括例如特异性结合有核胎儿细胞的蛋白质、核酸和碳水化合物。在一个实施方案中，结合部分对一种或多种碳水化合物如半乳糖具有亲和力。例如，结合部分可以是凝集素。在其它实施方案中，结合部分是抗体。此类结合部分抗体的实例包括：抗基质金属蛋白酶14(抗mmp14)、抗转铁蛋白受体(抗cd71)、抗血型糖蛋白a(抗gpa)、抗血小板反应蛋白受体(抗cd36)、抗cd34、抗hbf、抗hae9、抗fb3-2、抗h3-3、抗红细胞生成素受体、抗cd235a、抗碳水化合物、抗选择素、抗cd45、抗gpa、抗抗原-i、抗epcam、抗e-钙粘蛋白、抗muc-1、抗hpl、抗chs2、抗kiss1、抗gdf15、抗crh、抗tfp12、抗cgb、抗loc90625、抗fn1、抗col1a2、抗psg9、抗psg1、抗hbe、抗afp、抗apoc3、抗serpinc1、抗ambp、抗cpb2、抗itih1、抗apoh、抗hpx、抗β-hcg、抗ahsg、抗apob、抗j42-4-d、抗2,3-二磷酸甘油酸(抗bpg)、抗碳酸酐酶(抗ca)、或抗胸苷激酶(抗tk)。

在一个实施方案中，使用抗mmp14、抗cd71和/或抗gpa选择来富集有核胎儿细胞。在另一个实施方案中，使用可以结合由基因mmp14、cd71、gpa、hla-g、egfr、cd36、cd34、hbf、hae9、fb3-2、h3-3、红细胞生成素受体、hbe、afp、apoc3、serpinc1、ambp、cpb2、itih1、apoh、hpx、β-hcg、ahsg、apob、j42-4-d、bpg、ca或tk表达的蛋白质的一种或多种抗体或抗体片段，来富集有核胎儿细胞。

基于固定相的富集

在一些实施方案中，可以使用亲和层析的方法。例如，结合部分或亲和分子可以连接到固定相，例如珠粒、柱或颗粒上，并且可以在允许胎儿有核细胞特异性结合结合部分或亲和分子而样品的其它组分不特异性结合结合部分或亲和分子的条件下，将样品与亲和分子连接的固定相相接触。然后可以例如使用流动相来处理所接触的固定相以将结合附有亲和分子的固定相的母体样品的组分与未结合附有亲和分子的固定相的母体样品的组分相分离。然后可以保留或收获结合附有亲和分子的固定相的样品的组分(其包含胎儿有核细胞)，用以进一步富集或用于分析。

在一个实施方案中，使用磁性颗粒来富集有核胎儿细胞。在一个实施方案中，结合部分(如抗体)可以与磁性颗粒(例如磁珠)偶联。在一个实施方案中，珠粒与抗体或抗体片段偶联，所述抗体或抗体片段是抗mmp14、抗cd71、抗gpa、抗cd36、抗cd34、抗hbf、抗hae9、抗fb3-2、抗h3-3、抗红细胞生成素受体、抗cd235a、抗碳水化合物、抗选择素、抗cd45、抗gpa、抗抗原-i、抗epcam、抗e-钙粘蛋白、抗muc-1、抗hpl、抗chs2、抗kiss1、抗gdf15、抗crh、抗tfp12、抗cgb、抗loc90625、抗fn1、抗col1a2、抗psg9、抗psg1、抗hbe、抗afp、抗apoc3、抗serpinc1、抗ambp、抗cpb2、抗itih1、抗apoh、抗hpx、抗β-hcg、抗ahsg、抗apob、抗j42-4-d、抗bpg、抗ca或抗tk抗体或抗体片段。

可以与本文提供的核酸、抗体或基于抗体片段的探针一起使用的多种荧光分子或染料的任一种包括但不限于alexafluor350、amca、alexafluor488、异硫氰酸荧光素(fitc)、gfp、rfp、yfp、bfp、cfse、cfda-se、dylight288、spectrumgreen、alexafluor532、罗丹明、罗丹明6g、alexafluor546、cy3染料、四甲基罗丹明(tritc)、spectrumorange、alexafluor555、alexafluor568、丽丝胺罗丹明b染料、alexafluor594、德克萨斯红染料、spectrumred、alexafluor647、cy5染料、alexafluor660、cy5.5染料、alexafluor680、藻红蛋白(pe)、碘化丙啶(pi)、多甲藻黄素叶绿素蛋白(percp)、pe-alexafluor700、pe-cy5(tri-color)、pe-alexafluor750、pe-cy7、apc、apc-cy7、draq-5、pacificorange、amineaqua、pacificblue、alexafluor405、alexafluor430、alexafluor500、alexafluor514、alexafluor-555、alexafluor-568、alexafluor-610、alexafluor-633、dylight405、dylight488、dylight549、dylight594、dylight633、dylight649、dylight680、dylight750或dylight800。

胎儿生物标志物

在一些实施方案中，胎儿生物标志物可用于检测和/或分离一种或多种胎儿细胞。例如，这可以通过基于胎儿发育期间差异表达的基因(例如dys1、dyz、cd-71、mmp14)的相对表达来区分胎儿和母体有核细胞进行。在所提供的发明的一个实施方案中，一种或多种基因的转录物或蛋白质表达的检测被用于富集、纯化、计数、鉴定、检测或区分胎儿细胞，所述基因包括mmp14、cd71、gpa、hla-g、egfr、cd36、cd34、hbf、hae9、fb3-2、h3-3、红细胞生成素受体、hbe、afp、apoc3、serpinc1、ambp、cpb2、itih1、apoh、hpx、β-hcg、ahsg、apob、j42-4-d、2,3-二磷酸甘油酸(bpg)、碳酸酐酶(ca)或胸苷激酶(tk)。表达可以包括由这些基因表达的转录物或蛋白质。在所提供的发明的一个实施方案中，一种或多种基因的表达被用于鉴定、纯化、富集或计数有核胎儿细胞如有核胎儿红细胞，所述基因包括mmp14、cd71、gpa、hla-g、egfr、cd36、cd34、hbf、hae9、fb3-2、h3-3、红细胞生成素受体、hbe、afp、ahsg、j42-4-d、bpg、ca或tk。

β-hcg(也被称为b-hcg、hcg、cgb、cgb3和hcgb)是糖蛋白激素β链家族的成员，并且编码绒毛膜促性腺激素(cg)的β3亚基。糖蛋白激素是由共有的α亚基和赋予生物学特异性的独特的β亚基组成的异二聚体。cg由胚盘的滋养层的细胞产生，并且刺激卵巢合成对维持怀孕必需的类固醇。cg的β亚基由6个基因编码，这些基因在染色体19q13.3上串联排列且倒转成对，并且与促黄体激素β亚基基因毗邻。

apob(也被称为载脂蛋白b(其包括ag(x)抗原)和fldb)是乳糜微粒以及低密度脂蛋白的主要载脂蛋白。其以两个主要的同种型apob-48和apob-100的形式在血浆中存在：前者仅在肠中合成，而后者在肝脏中合成。肠形式和肝形式的apob由来自单条、非常长的mrna的单一基因编码。两个同种型共有共同的n-端序列。apob-100的转录物在残基2180处的rna编辑(caa->uaa)后(其导致终止密码子的形成以及早期翻译终止)产生较短的apob-48蛋白。该基因或其调节区的突变引起由于配体缺陷的apob的低β脂蛋白血症、甘油三酯水平正常的低β脂蛋白血症和高胆固醇血症，影响血浆胆固醇和apob水平的疾病。

ahsg(也被称为α-2-hs-糖蛋白；ahs；a2hs；hsga和fetua)为存在于血清中的糖蛋白，并且可由肝细胞合成。ahsg分子由两条多肽链组成，其均切割自单一mrna所编码的原蛋白。ahsg参与多种功能，如胞吞作用、大脑发育和骨组织的形成。该蛋白通常存在于未成熟的大脑皮层的皮层板和骨髓造血基质中，并且因此假定其参与组织的发育。

hpx(也被称为血色素结合蛋白)可结合血红素。hpx通过清除由血红素蛋白质，如血红蛋白的更新所释放或损失的血红素，可保护机体免受由游离血红素引起的氧化性损伤。为了保存机体的铁，当血色素结合蛋白与位于肝细胞表面的特异性受体相互作用时，其能释放其结合配体用于内化。

cpb2(也被称为羧肽酶b2(血浆)；cpu；pcpb和tafi)为能使c-端肽键水解的酶。羧肽酶家族包括金属羧肽酶、丝氨酸羧肽酶和半胱氨酸羧肽酶。根据它们的底物特异性，这些酶被称为羧肽酶a(其切割脂肪族残基)或羧肽酶b(其切割碱性氨基残基)。该基因所编码的蛋白由胰蛋白酶激活，并且作用于羧肽酶b的底物。凝血酶激活后，成熟的蛋白质下调纤维蛋白溶解。已描述了该基因及其启动子区的多态性。可用的序列数据分析指示编码不同同种型的剪接变体。

itih1(也被称为间-α(球蛋白)抑制剂h1；h1p；itih；latih和mgc126415)为丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员。其由两种前体蛋白装配：轻链和一条或两条重链。itih1能增加体外的细胞附着。

apoh(也被称为载脂蛋白h(β-2-糖蛋白i)；bg和b2g1)参与多种生理途径，包括脂蛋白代谢、凝血以及抗磷脂自身抗体的产生。apoh可为在患有狼疮和原发性抗磷脂综合征的许多患者的血清中发现的抗磷脂自身抗体结合阴离子磷脂的必需的辅因子。

ambp(也被称为α-1-微球蛋白/双库尼茨抑制剂前体；hcp；iti；uti；edc1；hi30；itil；iatil和itilc)编码血浆中所分泌的复合糖蛋白。前体被以蛋白水解的方式加工为不同的功能蛋白：α-1-微球蛋白和双库尼茨抑制剂，α-1-微球蛋白属于脂质运载(lipocalin)转运蛋白的超家族并且可在炎症过程的调节中发挥作用，双库尼茨抑制剂为属于库尼型蛋白酶抑制剂超家族的尿胰蛋白酶抑制剂并且在许多生理和病理过程中发挥重要作用。该基因位于9号染色体上的脂质运载基因簇中。

j42-4-d也被称为t-复合物11(小鼠)样2；mgc40368和tcp11l2。

在操作150，“分离胎儿细胞”中，可以使用人工或自动化方法分离胎儿细胞。例如，可以通过选择胎儿细胞和/或不选择非胎儿细胞来分离胎儿细胞。在一些实施方案中，通过单细胞捕获分离胎儿细胞。在一些实施方案中，可以在显微镜平台上可视化时分离胎儿细胞。

在各种实施方案中，在操作之前、期间或之后的某一时刻，可以使洗涤缓冲液流到微通道和/或室以洗去多余的试剂，如缓冲液、染料、抗体、核酸、细胞、细胞碎片等。

评估分离的胎儿细胞

本文公开的实施方案进一步提供了对分离的胎儿细胞进行一次或多次分析用于产前测试和/或诊断的灵活性。图2所示的图表中示出了根据所公开的实施方案的分离的胎儿细胞的下游分析200的非限制性实例。在图2中，分离的胎儿细胞可以经历细胞裂解和dna提取的步骤用于下游遗传分析。在一些实施方案中，可以在配备细胞分选芯片的相同或单独的微流体芯片上进行细胞裂解和/或dna提取。在一些实施方案中，可以使用可能不基于芯片的标准方法进行细胞裂解和/或dna提取。

在一些实施方案中，可以评估分离的胎儿细胞的核酸分子的核苷酸序列或基因的表达。例如，可以通过如snp检测、靶向测序、用于非整倍体分析的全基因组扩增(wga)和/或测序、对携带此类遗传缺陷的个体具有有害影响的基因上的某些区域的插入和缺失分析、用于染色体异常(例如18、21或13三体)的基于微阵列的分析来分析分离的胎儿细胞的遗传缺陷。

术语“染色体异常”是指主题染色体与正常的同源染色体的结构之间的偏差。术语“正常”是指在特定物种的健康个体中发现的主要核型或带型。染色体异常可以是数值上的或结构上的，并且包括但不限于非整倍体、多倍体、倒置、三体、单体、重复、缺失、部分染色体缺失、添加、部分染色体添加、插入、染色体片段、染色体区域、染色体重排和易位。染色体异常可能与存在病理状况或倾向于发生病理状况相关。如本文所定义，单核苷酸多态性(“snp”)不是染色体异常。

单体x(xo，缺少整条x染色体)是特纳综合征中最常见的类型，在2500个至3000个活产女婴中发生1例(sybert和mccauleynengljmed(2004)351：1227-1238)。xxy综合征是人类男性有额外的x染色体的一种病况，每1000名男性中大约存在1例(bock，understandingklinefeltersyndrome：aguideforxxymalesandtheirfamilies.nihpubno.93-3202(1993))。xyy综合征是性染色体的非整倍性，其中男性得到额外的y染色体，产生总共47条染色体而不是更常见的46条染色体，影响男性出生中的一千分之一，同时潜在地导致男性不育(aksglaede等人，jclinendocrinolmetab(2008)93：169-176)。

特纳综合征包括数个条件，其中单体x(xo，缺少整条性染色体，巴尔体)是最常见的。典型的女性有两条x染色体，但在特纳综合征中，其中一条性染色体缺失。在2000至5000个表型女性中发生1例，该综合征以多种方式表现。克氏综合征是一种其中人类男性有额外的x染色体的病况。在人类中，克氏综合征是最常见的性染色体病症，并且是由存在额外的染色体引起的第二常见病况。每1000名男性中约存在1例此种病况。xyy综合征是性染色体的非整倍性，其中男性得到额外的y染色体，产生总共47条染色体而不是更常见的46条染色体。这产生了47，xyy核型。这种病况通常是无症状的，影响男性出生中的一千分之一，同时潜在地导致男性不育。

13三体(patau综合征)、18三体(爱德华综合征)和21三体(唐氏综合征)是临床上最重要的常染色体三体，并且如何检测它们一直是热门话题。以上胎儿染色体畸变的检测在产前诊断中具有重要意义(ostler，diseasesoftheeyeandskin:acoloratlas.lippincottwilliams&wilkins，pp.72isbn9780781749992(2004)；driscoll和gross，nengljmed(2009)360：2556-2562；kagan等人，humanreproduction(2008)23：1968-1975)。

在一些实施方案中，分析核酸分子的核苷酸序列包括将可检测的探针与一个或多个分离的胎儿细胞的基因组dna杂交。该方法可以是fish(荧光原位杂交)法。在一些实施方案中，分析核酸分子的核苷酸序列包括对一个或多个分离的胎儿细胞的基因组dna进行测序。在一些实施方案中，对基因组dna进行测序包括对单个或一些细胞的dna进行测序，并且其中对一个或多个分离的胎儿细胞进行单个细胞的dna测序。

本领域技术人员显而易见的是，可以使用许多不同的测序方法和变型。在一个实施方案中，使用大规模平行测序来进行测序。“大规模平行测序”意指对数百万个核酸片段进行测序的技术，例如，其使用将随机片段化的基因组dna连接到平的、光学透明的表面并固相扩增，以创建具有数百万簇的高密度测序流动池，其每个于每平方厘米含有约1,000拷贝的模板。将这些模板使用四色dna测序合成技术进行测序。例如在454平台(roche)(margulies等人，nature(2005)437：376-380)、illuminagenomeanalyzer(或solexa^tm平台)或solidsystem(appliedbiosystems)上可完成大规模平行测序或helicostruesinglemoleculedna测序技术(harris等人，science(2008)320：106-109)、pacificbiosciences的单分子实时(smrt^tm)技术和纳米孔测序(soni和meller，clinchem(2007)53：1996-2001)允许以平行方式以高阶多重方式对分离自样本的许多核酸分子进行测序(dear，brieffunctgenomicproteomic(2003)1：397-416)。这些平台中的每一个都能对克隆扩增的或甚至未扩增的单分子核酸片段进行测序。可以使用市售的测序设备来获得多核苷酸片段的序列信息。目前使用的测序优选在没有预扩增或克隆步骤的情况下进行，但可以在具有用于pcr和基于微观模板的测序的反应室的微流体芯片中与基于扩增的方法组合。仅需要约30bp的随机序列信息以鉴定属于特定人染色体的序列。更长的序列可以唯一地鉴定更特定的靶标。在目前的实例中，获得大量的35bp的读数。大规模平行测序方法的进一步描述见于rogers和ventner，nature(2005)437：326-327中。

集成微流体装置

本文公开的实施方案提供了用于非侵入性分离胎儿细胞的集成微流体装置，其包括：过滤器；结合部分或亲和分子，其特异性结合胎儿细胞特异性抗原或非胎儿细胞特异性抗原，用于胎儿细胞的阳性选择或不需要的细胞的阴性选择；以及基于显微镜的可视化室。

在一些实施方案中，集成微流体装置可被配置为在显微镜平台上是可视化的。例如，在一些实施方案中，集成微流体装置可以包括在显微镜下透明且可视化的过滤器。在一些实施方案中，集成微流体装置可以包括在显微镜下透明且可视化的微通道和/或室。

在一些实施方案中，集成微流体装置可包括由相似材料或不同材料制成且通过多种可用的粘合技术装配的多个层。

在一些实施方案中，集成微流体装置可以包括这样的泵，其被配置为驱动流体从血液容器流动到集成微流体装置上的微通道或室。在一些实施方案中，集成微流体装置可以包括这样的泵，其被配置为使用充当阀以调节液体向芯片的不同区域流动的柔性膜的组合调节微流体装置的微通道和/或室中的流体流动。

在一些实施方案中，集成微流体装置可包括在微通道和/或室之间的交叉处的微型阀，以控制流体流动。在一些实施方案中，可以在微通道和/或室之间的多个交叉处形成多于一个微型阀。在一些实施方案中，微型阀可以由控制通道控制。为了激活微型阀，控制通道的开口端可以连接到压力源，例如泵、注射器、高压缸。在某些实施方案中，液体流可以由真空引导。

在一些实施方案中，微流体装置中可以包括多于一个控制通道。在其中微流体装置中包括多于一个控制通道的实施方案中，每个控制通道可一起操作或分别操作。例如，一些控制通道可以被加压，而另一些控制通道释放压力。在某些实施方案中，分别操作控制通道可允许将样品和/或试剂加入到一些反应室中而不是其它反应室中。

任何合适的材料都可用于柔性膜。例如，弹性膜的材料可以是pdms、硅橡胶、记忆合金或ptfe(聚四氟乙烯)等或其组合。

示例性微流体装置可以包括中心主体结构，其中设置有多种微流体元件。主体结构包括外部部分或表面，以及限定了整个微流体装置的多种微米级通道和/或室的内部部分。例如，示例性微流体装置的主体结构通常采用结构上可以是平面(即基本上平的或具有至少一个平的表面)的固体或半固体基底。可以由多种材料中的任一种或材料的组合来制备合适的基底。通常，使用在微细加工领域中常见的固体基底，例如基于二氧化硅的基底，如玻璃、石英、硅或多晶硅，以及其它已知的基底，即砷化镓制造平面基底。在这些基底的情况下，常用的微细加工技术，如光刻技术、湿法化学蚀刻、微机械加工(即钻孔、铣削等)可以容易地施用于微流体装置和基底的制造中。或者，可以使用聚合基底材料制造本发明的装置，所述聚合基底材料包括例如聚二甲基硅氧烷(pdms)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚氨酯、聚氯乙烯(pvc)、聚苯乙烯、聚砜、聚碳酸酯等。在此类聚合材料的情况下，可以使用注塑成型或压花的方法以形成具有如本文所述的通道和储存器几何形状的基底。在此情况下，可以使用任何上述材料和方法来制造原始模具。可以用等离子体处理组装的芯片以改变表面湿润性能，当需要时，可以在组装后用等离子体处理或优选先用等离子体处理，然后进行组装。

试剂盒

本文公开的实施方案进一步提供了试剂盒，所述试剂盒包含：用于非侵入性分离胎儿细胞的集成微流体装置，所述装置包括：过滤器；结合部分或亲和分子，其特异性结合胎儿细胞特异性抗原或非胎儿细胞特异性抗原；和光学透明室，其允许显微镜可视化以进行确认，以及试剂，其被配置成检测分离的胎儿细胞的一个或多个核苷酸和/或多肽序列。

可以使用任何合适的试剂，例如凝胶电泳试剂、色谱试剂、分光光度法试剂等，用于检测分离的胎儿细胞的一个或多个核苷酸和/或多肽序列。在一些实施方案中，用于检测分离的胎儿细胞的一个或多个核苷酸和/或多肽序列的试剂可以是测序装置。

在一些实施方案中，试剂盒可以包含引物和引物对(其允许多核苷酸的特异性扩增)，以及与分离的胎儿细胞的核酸分子选择性或特异性杂交的探针。探针可以用可检测的标志物来标记，所述标志物例如荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。此类探针和引物可用于检测分离的胎儿细胞中多核苷酸的存在。

在一些实施方案中，试剂盒可以包含用于检测多肽存在的试剂。此类试剂可以是特异性结合多肽的抗体或其它结合分子。在一些实施方案中，此类抗体或结合分子能够区分因多态性导致的多肽的结构变异，并因此可用于基因分型。抗体或结合分子可以用可检测的标志物，例如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂、酶或颗粒进行标记。用于进行结合测定(如elisa)的其它试剂也可以包括在试剂盒中。

在一些实施方案中，试剂盒包含用于对至少两种、至少三种、至少五种、至少十种或十五种生物标志物进行基因分型的试剂。在一些实施方案中，试剂盒还可包含用于检测扩增的核酸的捕获探针的表面或基底(如微阵列)。

试剂盒还可以包含载体装置，其被分区以严格限制地接收一个或多个容器装置如小瓶、管等，各个容器装置包括在方法中使用的单独元件中的一个。例如，容器装置中的一个可以包括探针，所述探针被可检测地标记或可以被可检测地标记。此类探针可以是对生物标志物特异的多核苷酸。当试剂盒利用核酸杂交以检测靶核酸时，试剂盒还可以具有容纳用于扩增靶核酸序列的核苷酸的容器和/或包含结合报告物分子(如酶、荧光或放射性同位素标记)的报告物-装置(如生物素结合蛋白，如亲和素或链霉亲和素)的容器。

试剂盒通常将包含上述容器以及一个或多个其它容器，所述其它容器包含从商业和用户角度可取的材料，所述材料包括缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有使用说明的包装插页。可以在容器上存在标签以指示组合物用于特定治疗或非治疗应用，并且还可以指示体内或体外使用的用法说明，如上述那些用法说明。

试剂盒还可以包含用于制备组织或细胞样品并从样品中制备核酸(如基因组dna)的一套说明书和材料。

本文公开的实施方案提供了适用于实施本发明方法的多种组合物，其可用于试剂盒中。例如，本文公开的实施方案提供了表面，如可用于此类方法中的阵列。在一些实施方案中，本发明的阵列包含可用于检测本发明的生物标志物的核酸分子的个体或集合。例如，本发明的阵列可以包括一系列分散放置的单个核酸寡核苷酸或可与包含靶核酸的样品杂交的一组核酸寡核苷酸组合，据此，此类杂交指示出本发明的生物标志物的基因型。

将核酸连接到固体基底如载玻片的数种技术是本领域公知的。一种方法是将修饰的碱基或类似物掺入到合成的核酸分子中，所述碱基或类似物含有能够与固体基底连接的部分，如胺基团、胺基团的衍生物或另外带有正电荷的基团。然后将合成的产物与固体基底如载玻片接触，所述载玻片包被有醛或另外反应性基团，其将与扩增产物上的反应性基团形成共价连接并共价连接到载玻片上。

实施例

在怀孕的早期或中期较早时自孕妇采集母体血液样品。收集后48小时内处理血液样品。用磷酸盐缓冲盐水(pbs)以1:2-1:20稀释血液样品至适当的体积。通过注射器或自动移液器样系统将稀释的血液样品施用于具有集成过滤器的微流体芯片。过滤器具有5μm的最小有效开口且在开口模式和结构方面有多种其它的实施方案。在血液样品通过过滤器后，通常将2ml洗涤缓冲液在室温下施用于微流体芯片3次。通过由导管连接到溶液储存器的微通道施加染色溶液，用dapi标记富集的有核血细胞。通过多种荧光标记策略鉴定胎儿细胞，所述荧光标记策略包括用结合有抗cd71抗体和/或抗gpa抗体的fitc或pe进行标记。通过用荧光标记的cd45抗体染色，去除或排斥大部分母体有核血细胞。通过将芯片放置在微观平台上来将标记的胎儿细胞可视化。通过从顶部直接照射或从底部经落射式照射，使用摄像机捕获标记的胎儿细胞的荧光图像。(此配置的确切性质仍待决定)。

将10mg蛋白质a/g磁珠混合物(lifetechnologiescorporation)用pbs+吐温-20悬浮并洗涤两次。将50μgcd45抗体加入到在pbs+吐温-20中稀释的400μl珠粒混合物中，在室温下孵育并旋转30分钟。用磁力支架分离与cd45抗体偶联的珠粒，并在pbs+吐温-20中洗涤3次。cd45靶向白细胞并去除收集的血液样品中的大部分非胎儿细胞群，以降低检测和分离的细胞负载并提高通量。将抗体包被的珠粒加入到富集的有核血细胞中并孵育30分钟。通过对芯片施加磁力以将珠粒移动到芯片的收集室，用以从胎儿细胞中去除附着于珠粒上的非胎儿细胞。该步骤也可以在将部分富集的血液样品加载到芯片上之前作为芯片外用于负消耗的较早步骤来进行。

将芯片的顶层与底层分离，暴露含有标记的胎儿细胞的室。使用自动机器人移液器将胎儿细胞分离到由计算机控制的微量滴定板上，使用摄像机获得荧光图像。从收集的胎儿细胞中纯化基因组dna，并通过下一代测序(ngs)法、微阵列分析、基于fish或snp的基因组分析来分析21、18或13三体或其它遗传异常。