鱼鳞制备肽的前处理脱钙方法与流程

本发明涉及水产品加工领域，具体的说是一种鱼鳞制备肽的前处理脱钙方法。

背景技术：

我国是世界上最大的淡水鱼养殖国，随着淡水鱼类加工业的快速发展，加工过程中产生大量的废弃物，如鱼鳞。通常鱼鳞加工利用程度很低，绝大部分被直接丢弃，造成了资源的浪费。其实，鱼鳞富含胶原蛋白，从中提取胶原蛋白肽不仅能够充分利用资源，提高鱼类加工的附加值，而且可以减少环境负担，对促进鱼类加工业的良性发展具有重要意义。

鱼鳞主要由羟基磷灰石ca5(po4)3(oh)和i型胶原质组成，羟基磷灰石主要附着在鱼鳞表面。鱼鳞在酶解制备胶原蛋白肽之前，脱杂脱矿是必不可少的环节，它对后续酶解效率和产物纯度的影响很大。目前，国内学者和生产厂家主要采用强酸、强碱或有机螯合盐(如edta二钠)脱杂脱矿，这种方法虽然具有脱钙效果，但同时也会导致鱼鳞胶原的分解溶出，也不利于后续酶解的进行，滤液呈现高酸碱度，外加盐离子多也会导致后续废水处理环节增多，达标排放成本高昂。若中和或稀释后排放，日积月累也会对土壤、水质和环境造成严重污染，因此急需一种脱钙效率高、胶原溶出少、尾水酸碱度低的处理方法。

等离子体活化水(plasma-activatedwater，paw)是通过在水中或水表面进行等离子体放电而得到的液体，是一种高酸性、高氧化还原电位的活化水，可被用于果蔬的杀菌保鲜，如107333870a公开了“一种大气压低温等离子体活化液保鲜水果的方法”，使用等离子活化液处理果蔬杀菌保鲜，有一定效果，但该方法中等离子体活化液需使用特殊气体和过氧化氢水辅助制备，成本较高，操作复杂。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种工艺简单、脱钙时间短、效率高，胶原损失低、操作简便、成本低、对环境友好的鱼鳞制备肽的前处理脱钙方法。

技术将鱼鳞预处理后与等离子体活化水均匀混合，然后立即进行超声波处理，将超声处理后的混合物过滤、清洗沥干得到脱钙鱼鳞，过滤后的滤液静置至ph达6.8～7.4后进行废水后续处理。

所述等离子体活化水的ph值2.0～3.5，电导率600～1400μs/cm，orp值450～650mv，温度30～45℃。

采用等离子液体处理发生器制备纯水的等离子体活化水，设置电流0.01～0.5a，放电反应30～60min。

所述鱼鳞和离子体活化水按料液比(g:ml)1:9～15进行混合。

所述超声功率100～150w，时间40～60min。

所述鱼鳞为淡水鱼鳞，控制预处理后鱼鳞水分10～20％重量百分数。

所述鱼鳞为鲢鱼鱼鳞。

所述预处理包括鱼鳞清洗、沥水、晾干表面水分。

所述滤液的静置时间为24～48h。

针对背景技术中存在的问题，发明人对paw进行深入研究，发现paw具有低ph、高电导率、orp高等特性，含有大量激发态的、亚稳态的活性粒子、带电粒子、酸根离子等的特点，除了具有对果蔬杀菌作用外，在用于鱼鳞处理时，由于其中激发态的、亚稳态的活性粒子、带电电荷等可攻击羟基磷灰石ca5(po4)3(oh)晶格结构中的不稳定价键，如ca＝o键，ca-oh键，促进paw中onoo^－、no2^－、no3^－等离子与羟基磷灰石ca5(po4)3(oh)晶格结构中的ca迅速反应，生成钙盐使之脱离鱼鳞表面。并且作为附加技术效果，paw在一段时间后ph会自动恢复至中性，利用该特性，通过控制合适的放电参数，可以有效控制paw的ph自动恢复至中性的时间，既满足脱钙的需求，同时又能使脱钙过滤后的滤液恢复至中性，减少废水处理环节，可减少常规强酸碱和鳌合盐的使用，满足废水排放的ph要求，减少废液处理工序和污染排放，对环境友好。

这里，不同参数下的paw用于鱼鳞脱钙的效率也不尽相同，优选等离子体活化水的ph值2.0～3.5，电导率600～1400μs/cm，orp值450～650mv，温度30～45℃；更为优选ph值2.5～3.2，温度38～45℃，电导率600～1250μs/cm，orp值520～650mv。采用等离子液体处理发生器制备纯水的等离子体活化水，设置电流0.01～0.5a，放电反应30～60min，优选电流0.1～0.2a，放电反应30～45min。

进一步的，超声波单独使用并不能与鱼鳞表面的羟基磷灰石反应，起到脱钙的效果，但与paw同时使用时，可以在paw与羟基磷灰石反应后，辅助加速洗脱钙质，大大提高脱钙效率。

本发明原料选用淡水鱼鳞，因为海水鱼鳞盐分高，不利于脱钙处理，并会影响鱼鳞酶解肽的得率和纯度。更为优选为鲢鱼鱼鳞，因为鱼鳞本身胶质含量高粘度大难以打碎，而鲢鱼鳞细小、无需粉碎。鱼鳞水分控制10～20％重量份，可避免因水分大而稀释paw中各种亚稳态粒子、酸根离子等的浓度。

本发明将鱼鳞和paw按料液比(g:ml)1:9～15进行混合，优选为1:9～10。1:9～15是较低的料液比范围，而1:9～10是鱼鳞与液体混合的极限值，溶液少于这个比例就会无法覆盖和浸润鱼鳞，导致脱钙失败。本发明中料液比低至1:9～10也可以有效脱钙，可大大节省后续废水处理或干燥的时间，降低生产成本。

本发明采用超声功率100～150w，时间40～60min，优选为130～150w，时间40～50min。在针对鱼鳞脱钙使用paw与超声波协同处理时，超声功率和时间过高会导致鱼鳞大量酸溶，胶原质损失；超声功率和时间过低会导致鱼鳞脱钙不完全，降低后续酶解效率和肽得率。此外，超声处理时间仅需40～60min，相比盐酸、硫酸、柠檬酸等完全脱钙所需6～12h，效率已然大大提高。

采用本发明方法对鱼鳞处理后，鱼鳞脱钙率达到95％以上，滤液中hyp浓度低于9μg/ml，滤液静置24～48h后ph恢复可恢至6.8～7.4，满足废水排放的ph值要求。采用本发明所述的前处理脱钙方法，工艺简单、生产周期短，不仅脱钙率高，而且胶原损失低，无外加盐离子，没有后续酸碱溶液处理的负担，废水处理工艺环节减少，可有效降低生产成本。

附图说明

图1放电过程中paw的ph值(a)、温度(b)、电导率(c)和orp值(d)的变化曲线

图2放电停止后paw的ph值(a)、温度(b)、电导率(c)和orp值(d)变化曲线

图3不同方法处理鱼鳞1h的脱钙率和滤液中的hyp浓度。

图4paw+超声波法处理鱼鳞的脱钙曲线。

图5处理前鱼鳞照片。

图6处理后鱼鳞照片。

具体实施方式

下面通过实例进一步说明本发明的技术内容和效果。

paw的制备实施例：

利用低温等离子双介质阻挡液体处理发生器处理获得paw，设定设备电流为钳形表实测电流0.0、0.05、0.10、0.20a，根据功率计算公式：p＝u×i×cosφ(其中u为电压2000v，i为实测电流，cosφ为功率因数按0.85计)，得到档位相对应的功率分别为0、0.085、0.17、0.34kw。准备去离子纯净水30l，分别进行0.0、0.05、0.10、0.20a的外加电流循环处理，获得paw。分别用ph计、温度计、电导率仪、电位笔测定paw的ph值、温度、电导率和氧化还原电位(oxidation-reductionpotential，orp)值。测定持续49h，放电1h过程中，每5min测定1次，放电结束后的48h，每8h测定1次，每次平行测定3回，结果取平均值。检测结果如下：

表1不同制备时间和电流下paw的ph和温度

表2不同制备时间和电流下paw的电导率和orp值

表3不同放置时间下paw的ph和温度

表4不同放置时间下paw的电导率和orp值

表1～表4结果可见，总体来说，未加鱼鳞的paw在制备过程中ph下降，温度、电导率和orp值均上升；在放置过程中，ph上升，温度、电导率和orp值均下降。设置电流0.05～0.2a，放电反应30～45min，获得的paw其ph值2.6～3.6，温度35.0～45.2℃，电导率380～1205μs/cm，orp值536～613mv。放电结束后静置32～40h，paw的ph可自动恢复至6.87～7.22，温度恢复至室温，电导率恢复至576μs/cm以下，orp值恢复至360mv以下。paw的ph自动恢复，与paw中激发态的原子、亚稳态原子及活跃的带电粒子相互作用后趋于稳定有关。

实施例1:

将鱼鳞原料清洗、沥水、晾干表面水分至水含10％重量百分数备用。paw制备：设置电流0.20a，放电反应30min，获得paw其ph值2.49，温度44.3℃，电导率989μs/cm，orp值598mv。用容器将鱼鳞和paw按料液比(g:ml)1:10进行混合，混合液连同容器放入超声波仪中进行脱杂脱矿，设置超声功率140w，时间60min。然后过滤并用清洗鱼鳞，沥干水分即获得脱钙鱼鳞。

为了对比，同时进行hcl+超声的脱钙实验，及hcl和paw的震荡脱钙实验(震荡频率120转/min)，脱钙时间均为60min，脱钙后的鱼鳞进行脱钙率测定。由于酸性液体可能会导致鱼鳞胶原的分解溶出，其中羟脯氨酸(hyp)是鱼鳞肽的特征氨基酸，因此进行脱钙后所得滤液中hyp含量的测定，以评估鱼鳞在不同脱钙方法中胶原肽的损失。

测定方法：参考gb-t5009.92-2003食品中钙的测定的方法测定鱼鳞原料中的钙含量，并按如下公式计算脱钙率(％)：脱钙率(％)＝(鱼鳞质量-脱钙鱼鳞质量/鱼鳞中钙质量)×100。根据woessner比色法测定羟脯氨酸含量，配制0、0.5、1.0、1.5、2.0μg/mll(-)-羟脯氨酸标准液，显色反应后于560nm处测得吸光度，得标准曲线公式y＝0.2274x+0.0088r²＝0.9978。吸取脱钙后滤液lml于15ml的螺口试管中，加入9ml6mol/lhcl，125℃封管水解24h，取水解液5ml，调ph至6.0，定容至100ml。显色反应后于560nm处测得吸光度，根据标曲计算羟脯氨酸含量。此外，用ph计测定脱钙滤液放置24后的ph使。结果如下：

表5不同方法下的鱼鳞脱钙率、滤液hyp浓度及ph

表6paw+超声法不同时间下的鱼鳞脱钙率及滤液ph

表5和表6结果显示，单独使用超声波法并不能有效脱钙。paw法脱钙率高于hcl法，这跟paw溶液中含有大量带电粒子、酸根离子等有关。paw+超声波法的效果最好，处理40分钟即可达到95％以上的脱钙率；处理60分钟脱钙率达97％以上，比hcl+超声法提高28.62％，且滤液中hyp浓度比hcl+超声法降低12.34％。此外，paw+超声法处理鱼鳞后的滤液，ph值24h即可恢复至7左右，比纯paw液体的ph值恢复更快，可能跟少量胶原蛋白酸解后其碱性基团暴露与溶液中酸根离子中和有关。

实施例2

将鱼鳞原料清洗、沥水、晾干表面水分至水含20％重量百分数备用。paw制备过程同实施例1，不同的是设置电流0.01a，放电反应60min，获得的paw其初始ph值3.36，温度31.3℃，电导率736μs/cm，orp值502mv。用容器将鱼鳞和paw按料液比(g:ml)1:15进行混合。混合液连同容器放入超声波仪中进行脱杂脱矿，设置超声功率150w，时间60min。脱矿后，过滤并清洗鱼鳞，沥干水分即获得脱钙鱼鳞。该方法处理后，鱼鳞脱钙率为95.66％，滤液hyp浓度为7.58μg/ml，滤液放置24hph恢复至7.28。

实施例3

将鱼鳞原料清洗、沥水、晾干表面水分至水含15％重量百分数备用。paw制备过程同实施例1，不同的是设置电流0.03a，放电反应60min，获得的paw其初始ph值3.22，温度33.0℃，电导率752μs/cm，orp值535mv。用容器将鱼鳞和paw按料液比(g:ml)1:15进行混合。混合液连同容器放入超声波仪中进行脱杂脱矿，设置超声功率150w，时间50min。脱矿后，过滤并清洗鱼鳞，沥干水分即获得脱钙鱼鳞。该方法处理后，鱼鳞脱钙率为95.80％，滤液hyp浓度为7.66μg/ml，滤液放置24hph恢复至7.35。

实施例4

将鱼鳞原料清洗、沥水、晾干表面水分至水含17％重量百分数备用。paw制备过程同实施例1，不同的是设置电流0.07a，放电反应60min，获得的paw其初始ph值3.0，温度37.5℃，电导率952μs/cm，orp值593mv。用容器将鱼鳞和paw按料液比(g:ml)1:15进行混合。混合液连同容器放入超声波仪中进行脱杂脱矿，设置超声功率140w，时间60min。脱矿后，过滤并清洗鱼鳞，沥干水分即获得脱钙鱼鳞。该方法处理后，鱼鳞脱钙率为96.82％，滤液hyp浓度为8.21μg/ml，滤液放置24hph恢复至7.40。

实施例5

将鱼鳞原料清洗、沥水、晾干表面水分至水含12％重量百分数备用。paw制备过程同实施例1，不同的是设置电流0.15a，放电反应45min，获得的paw其初始ph值2.84，温度39.0℃，电导率1250μs/cm，orp值616mv。用容器将鱼鳞和paw按料液比(g:ml)1:15进行混合。混合液连同容器放入超声波仪中进行脱杂脱矿，设置超声功率120w，时间60min。脱矿后，过滤并清洗鱼鳞，沥干水分即获得脱钙鱼鳞。该方法处理后，鱼鳞脱钙率为97.10％，滤液hyp浓度为8.56μg/ml，滤液放置24hph恢复至7.25。

实施例6

将鱼鳞原料清洗、沥水、晾干表面水分至水含18％重量百分数备用。paw制备过程同实施例1，不同的是设置电流0.30a，放电反应50min，获得的paw其初始ph值2.73，温度39.6℃，电导率1280μs/cm，orp值620mv。用容器将鱼鳞和paw按料液比(g:ml)1:9进行混合。混合液连同容器放入超声波仪中进行脱杂脱矿，设置超声功率135w，时间40min。脱矿后，过滤并清洗鱼鳞，沥干水分即获得脱钙鱼鳞。该方法处理后，鱼鳞脱钙率为97.25％，滤液hyp浓度为8.48μg/ml，滤液放置24hph恢复至7.29。

实施例7

将鱼鳞原料清洗、沥水、晾干表面水分至水含15％重量百分数备用。paw制备过程同实施例1，不同的是设置电流0.40a，放电反应40min，获得的paw其初始ph值2.40，温度41.0℃，电导率1312μs/cm，orp值636mv。用容器将鱼鳞和paw按料液比(g:ml)1:12进行混合。混合液连同容器放入超声波仪中进行脱杂脱矿，设置超声功率140w，时间50min。脱矿后，过滤并清洗鱼鳞，沥干水分即获得脱钙鱼鳞。该方法处理后，鱼鳞脱钙率为96.80％，滤液hyp浓度为8.15μg/ml，滤液放置24hph恢复至7.11。

实施例8

将鱼鳞原料清洗、沥水、晾干表面水分至水含16％重量百分数备用。paw制备过程同实施例1，不同的是设置电流0.50a，放电反应30min，获得的paw其初始ph值2.25，温度45℃，电导率1350μs/cm，orp值642mv。用容器将鱼鳞和paw按料液比(g:ml)1:10进行混合。混合液连同容器放入超声波仪中进行脱杂脱矿，设置超声功率120w，时间60min。脱矿后，过滤并清洗鱼鳞，沥干水分即获得脱钙鱼鳞。该方法处理后，鱼鳞脱钙率为97.43％，滤液hyp浓度为8.76μg/ml，滤液放置24hph恢复至6.92。