等离激元正金字塔阵列基底及体外细胞内物质递送方法

1.本发明属于微结构加工与细胞生物学技术领域，涉及一种等离激元正金字塔阵列基底及利用该基底向体外细胞内递送物质的方法。


背景技术：

2.长期以来，人们一直追求向体外细胞内递送mirna等物质的有效方法，以便进行体外细胞实验、体外药效实验等。然而，由于mirna等物质的尺寸相对较大，对其有效的细胞内递送仍然具有挑战性。
3.目前，基于病毒的方法被广泛用于向细胞内递送mirna。然而，基于病毒的方法的生物安全性和成本限制了其进一步发展。此外，人们也开发出多种非病毒的体外细胞内mirna递送方法，如借助脂质体、聚合物、肽、异质系统等，但这些方法一般仅适用于处理特定种类的目标细胞，不具备普适性，应用受到限制。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种等离激元正金字塔阵列基底及体外细胞内物质递送方法。本发明结合多种微纳加工技术，在单晶硅表面刻蚀出周期和尺寸可调控的正金字塔阵列结构，实现对单晶硅表面金字塔阵列结构的精确控制，进而沉积金属层或其他复合材料层使其具备优异的原位等离激元性能和等离子光热转换性能。将体外细胞播种在该基底表面，通过光源辐照的方式可促进物质向细胞内的递送。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
6.等离激元正金字塔阵列基底的制备方法，该方法包括以下步骤：
7.1)在硅片表面依次涂覆粘结剂层及光刻胶层，之后将含有点阵图案的掩膜板置于光刻胶层上，并在光刻设备中曝光，曝光结束后移去掩膜板，并用正胶显影液对光刻胶层中未固化的部分进行冲洗，得到光刻后材料；
8.2)在光刻后材料的表面沉积二氧化硅层，之后除去光刻后材料中剩余的光刻胶，得到二氧化硅掩膜的无胶硅片；
9.3)将二氧化硅掩膜的无胶硅片置于硅各向异性刻蚀剂中进行湿法刻蚀，得到含有正金字塔阵列结构的硅片；
10.4)在含有正金字塔阵列结构的硅片表面沉积金属层或具有等离子性能的复合材料层，即得到所述的等离激元正金字塔阵列基底。
11.进一步地，步骤1)中，所述的硅片为抛光后的硅晶圆片，硅片厚度为100-1000微米；所述的粘结剂为六甲基二硅氮烷，粘结剂的涂覆方式为旋涂、喷涂或真空挥发；所述的光刻胶为正性光刻胶，光刻胶的涂覆方式为旋涂或喷涂；所述的掩膜板的点阵图案中，圆点的直径为1-5微米，相邻圆点的间距为3-15微米。
12.进一步地，步骤2)中，采用电镀、蒸镀或磁控溅射的方法沉积二氧化硅层，该二氧化硅层的厚度为10-1000纳米；采用有机溶剂浸泡的方法除去光刻后材料中剩余的光刻胶，
所述的有机溶剂包括丙酮、甲苯或二氯甲烷中的一种或更多种。
13.进一步地，步骤3)中，所述的硅各向异性刻蚀剂包括四甲基氢氧化铵溶液、koh的异丙醇溶液、edp刻蚀剂或水合肼刻蚀剂中的一种或更多种，湿法刻蚀的温度为50-100℃，刻蚀时间为1-120分钟。
14.进一步地，步骤4)中，采用电镀、蒸镀或磁控溅射的方法沉积金属层或具有等离子性能的复合材料层，沉积厚度为20-500纳米。
15.等离激元正金字塔阵列基底，该基底采用所述的方法制备而成。
16.等离激元正金字塔阵列基底的应用，在激光照射下，利用所述的基底向体外细胞内递送物质。
17.体外细胞内物质递送方法，基于所述的等离激元正金字塔阵列基底，所述的物质递送方法为：将体外细胞粘附在基底表面，之后向基底上加入含有待递送物质的分散液，再利用激光对基底进行照射，以将所述的物质递送至体外细胞内。
18.优选地，将体外细胞粘附在基底表面的方法为：将体外细胞以大约1
×
106的密度接种到等离激元正金字塔阵列基底表面，然后在完全培养基(rpmi1640：胎牛血清：青霉素-链霉素＝90：9：1)中培养；所有粘附的细胞在4℃下用4％多聚甲醛固定5-30分钟，然后在每个浓度梯度(50％、70％、90％、100％)下用酒精脱水3次，每次5分钟。随后，用六甲基二硅氮烷进行化学反应10分钟，去除微量的残留水分。
19.进一步地，所述的物质包括基因物质、生物大分子、纳米粒子或药物分子，所述的分散液为无核酸酶水(depc)，浓度优选为4-6nm。体外细胞可选为人食管鳞癌细胞(kyse30)、紫杉醇耐受性人食管鳞癌细胞(kyse30/taxol)、人神经胶质瘤细胞(u87)等。
20.进一步地，所述的激光的波长为400-3000nm，照射时间为1-10min。
21.基于膜破坏的方法主要通过挤压、流体剪切、电穿孔、微注射等物理手段刺穿细胞膜，以促进生物分子载体等物质向体外细胞内的递送。由于细胞膜上的瞬时孔洞能够自行愈合，因而该方法对细胞活力的影响很小。
22.等离激元现象是金属表面自由电子与入射光子相互耦合、集体相干振荡而产生的一种电磁波，所激发产生的局域倏逝场强度相比入射光有极大增强。等离激元结构在适当的光照下产生的光热效应有助于在细胞膜上产生瞬时孔隙。本发明通过等离激元正金字塔阵列诱导的光热效应对体外细胞进行即时和有效的物质递送，在短暂的激光照射后，单个等离子体金字塔上可以产生一个瞬间的高温，这个温度高到足以破坏细胞膜，以促进像mirna这样的大型生物颗粒向细胞内递送。在移除激光照射后，金字塔的温度会迅速下降以促进细胞膜的恢复。本发明中的方法能够在几分钟内成功地实现将物质向体外细胞内传递，提供了方便的细胞内物质递送方法。
23.与现有技术相比，本发明具有以下特点：
24.1)本发明利用光刻技术将掩膜板的图案精确地转移到硅片表面，适用于复杂图案的灵活加工，且掩膜板可重复利用，降低了生产成本。
25.2)本发明在单晶硅表面获得整齐均一的金字塔阵列结构，再通过沉积相关材料获得等离激元基底，得到的金字塔阵列结构排列整齐、尺寸可控，该方法加工方便、成本低廉，且基底可多次重复利用。
26.3)本发明能够在几分钟内实现将物质向体外细胞内递送，递送效率高，且递送后
细胞活性保持良好，为广谱和高通量的体外细胞内递送提供了一种新的思路，具有广泛的应用前景。
附图说明
27.图1为实施例中制备等离激元正金字塔阵列基底的过程示意图；
28.图2为实施例中制备得到的等离激元正金字塔阵列基底的扫描电镜照片；
29.图3为实施例中体外细胞内物质递送时的激光扫描示意图；
30.图4为实施例和对比例中5-fam标记的mir-185(绿色荧光)在kyse30/taxol细胞内的分布图。
具体实施方式
31.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
32.本发明提供了一种等离激元正金字塔阵列基底的制备方法，该方法包括以下步骤：
33.1)在硅片表面依次涂覆粘结剂层及光刻胶层，之后将含有点阵图案的掩膜板置于光刻胶层上，并在光刻设备中曝光，曝光结束后移去掩膜板，并用正胶显影液对光刻胶层中未固化的部分进行冲洗，得到光刻后材料；
34.2)在光刻后材料的表面沉积二氧化硅层，之后除去光刻后材料中剩余的光刻胶，得到二氧化硅掩膜的无胶硅片；
35.3)将二氧化硅掩膜的无胶硅片置于硅各向异性刻蚀剂中进行湿法刻蚀，得到含有正金字塔阵列结构的硅片；
36.4)在含有正金字塔阵列结构的硅片表面沉积金属层或具有等离子性能的复合材料层，即得到等离激元正金字塔阵列基底。
37.步骤1)中，硅片为抛光后的硅晶圆片，硅片厚度为100-1000微米；粘结剂为六甲基二硅氮烷，粘结剂的涂覆方式为旋涂、喷涂或真空挥发；光刻胶为正性光刻胶，光刻胶的涂覆方式为旋涂或喷涂；掩膜板的点阵图案中，圆点的直径为1-5微米，相邻圆点的间距为3-15微米。
38.步骤2)中，采用电镀、蒸镀或磁控溅射的方法沉积二氧化硅层，该二氧化硅层的厚度为10-1000纳米；采用有机溶剂浸泡的方法除去光刻后材料中剩余的光刻胶，有机溶剂包括丙酮、甲苯或二氯甲烷中的一种或更多种。
39.步骤3)中，硅各向异性刻蚀剂包括四甲基氢氧化铵溶液、koh的异丙醇溶液、edp刻蚀剂或水合肼刻蚀剂中的一种或更多种，湿法刻蚀的温度为50-100℃，刻蚀时间为1-120分钟。
40.步骤4)中，采用电镀、蒸镀或磁控溅射的方法沉积金属层或具有等离子性能的复合材料层，沉积厚度为20-500纳米。
41.本发明同时提供了一种等离激元正金字塔阵列基底，该基底采用上述方法制备而成。
42.本发明还提供了上述等离激元正金字塔阵列基底的应用，在激光照射下，利用上述基底向体外细胞内递送物质。
43.本发明进一步提供了一种体外细胞内物质递送方法，基于上述等离激元正金字塔阵列基底，物质递送方法为：将体外细胞粘附在基底表面，之后向基底上加入含有待递送物质的分散液，再利用激光对基底进行照射，以将所述的物质递送至体外细胞内。
44.其中，物质包括基因物质、生物大分子、纳米粒子或药物分子，分散液为无核酸酶水。激光波长为400-3000nm，照射时间为1-10min。
45.实施例：
46.一种利用等离激元正金字塔阵列向体外细胞内递送mirna的方法，其等离激元正金字塔阵列基底通过以下步骤制备：
47.1)将厚度600微米的干净硅晶圆片切割成边长3cm的正方形，浸入浓硫酸中，90℃下加热3h。随后将硅片依次在乙醇、丙酮和超纯水中超声15min，并用氮气吹干。在硅片表面滴加六甲基二硅氮烷，以1000rpm的转速旋涂2min，形成均匀的粘结剂层；将去除气泡的su-8光刻胶倒入硅片表面，以3000rpm的转速旋涂1min，形成均匀的光刻胶层。使用含有2微米点阵图案的铬板作为掩膜板对硅片进行掩膜，并在紫外灯下曝光120s；将曝光后的硅片浸入正胶显影液中，并不断使用显影液对表面未固化的光刻胶进行冲洗；
48.2)在步骤1)得到的材料表面采用磁控溅射的方式沉积100纳米厚二氧化硅层，随后将其放入丙酮中浸泡15分钟除去硅片表面剩余的光刻胶，得到二氧化硅掩膜的无胶硅片；
49.3)将二氧化硅掩膜的无胶硅片基底放入60℃的30wt％koh/异丙醇刻蚀剂中进行湿法刻蚀5分钟，得到含有金字塔阵列结构的硅片；
50.4)通过蒸镀的方式向含有金字塔阵列结构的硅片的表面沉积70纳米厚的金层。
51.将kyse30/taxol细胞以1
×
106的密度被接种到等离激元正金字塔基底表面，然后在完全培养基(rpmi1640：胎牛血清：青霉素-链霉素＝90：9：1)中培养。所有粘附的细胞在4℃下用4％多聚甲醛固定15分钟，然后在每个浓度梯度(50％、70％、90％、100％)下用酒精脱水3次各5分钟。随后，用六甲基二硅氮烷进行化学反应10分钟，去除微量的残留水分。
52.kyse30/taxol细胞粘附后，加入5-fam mir-185，并立即用640纳米的红激光照射20个周期，每个周期8s，最后用冷的pbs洗两次含有mir-185的介质。
53.对比例：
54.将厚度500微米的干净硅晶圆片切割成边长3cm的正方形，浸入浓硫酸中，90℃下加热3h。随后将硅片依次在乙醇、丙酮和超纯水中超声15min，并用氮气吹干。之后通过蒸镀的方式向干净硅片的表面沉积70纳米厚的金层。
55.细胞培养与mirna递送过程均与实施例相同。
56.图1为本实施例中制备等离激元正金字塔阵列基底的过程示意图，由图1可以看出，该硅基底的制备方法具有工艺简单、成本低廉等特点，有利于大规模商业化应用。
57.图2为本实施例中制备得到的等离激元正金字塔阵列基底的扫描电镜照片，由图2可以看出，所制备均匀的硅基底金字塔阵列，具有纳米级锋锐尖端。
58.图3为本实施例中体外细胞内物质递送时的激光扫描示意图，由图3可以看出，激光辐照的瞬间在金原位等离子体效应作用下，形成的气孔在细胞表面形成瞬态通道，促进
细胞外mi-rna递送到细胞内。
59.图4为本实施例和对比例中5-fam标记的mir-185(绿色荧光)在kyse30/taxol细胞内的分布图，由图4可以看出，在等离激元正金字塔阵列基底上贴附的细胞发生转染具有荧光，而平面基底上细胞荧光较弱，几乎不发生mi-rna递送。
60.上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。