专利名称:一种低尿酸分泌量益生菌及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域：
，更具体地讲，涉及一种通过基因工程方法制备低尿酸分泌量的益生菌制备方法及其应用。
背景技术：
人类胃肠道是IO14个细菌类生物的栖息地，这些栖息菌被称为共栖微生物 (commensal microbiota)。它们在婴儿出生后的最初几天即来到并建立起一种对宿主正常机能必需的重要共生关系。目前已知,人体共栖微生物种类达500余种，其中99. 9%是以双歧杆菌和类杆菌为主的专性厌氧菌，O. 1%是以肠杆菌科细菌为主的兼性厌氧菌。在成年个体中，这些微生物的总重量约1271克，相当于肝脏的重量。共栖微生物与人体的这种终生关系在人体抵抗病原体、营养吸收与代谢中起着重要作用。1989年，Fuller把这些对宿主起有益作用的活的微生物称为益生菌(Probiotics)。
目前对益生菌的研究表明，益生菌对机体的主要有益作用包括
I.代谢底物的消化(Digestion of metabolizable substrates)
分解食物来源的膳食纤维、淀粉、低聚糖、糖、脂肪和蛋白质。以及人体来源的内源性粘蛋白，脱落的上皮细胞和肠组织，细菌碎片，胆汁酸和胆固醇。对这些人体不吸收的底物分解后主要形成短链脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs),例如醋酸、丙酸和丁酸。 SCFAs可以刺激盐和水的吸收、提供能量、维持肠道上皮细胞层的完整性等功能。
2.定植抗力(Colonization resistance)
肠道菌群，以黏附、嵌合等方式，形成膜样结构，通过其定植抗力，阻止致病菌黏附到上皮细胞；益生菌在胃肠道内能产生有机酸、游离脂肪酸、过氧化氢和细菌素等具有不同程度抗菌活性的物质。
3.制造维生素(Production of vitamins)
包括制造维生素B5、B6、B12、K2、生物素、核黄素、烟酸和硫胺素等，以及将有些维生素加工成人体可吸收利用的形式。
4.形成粘附位点(Development of attachment sites)
益生菌能够刺激肠道上皮细胞合成糖复合物，这些复合物被认为是益生菌附着的受体。
5.诱导免疫系统发育(Induces development of the immune system)
肠道正常菌群能够刺激肠道相关淋巴系统(gut-associated lymphoid system, GALT)
的成熟。肠道菌群给GALT细胞提供了一系列的刺激性抗原，影响了局部和全身的淋巴细胞水平。
6.生产外源性酶类(Production of exogenous enzymes)
7.刺激肠道传输(Stimulation of intestinal transit)
已证明，肠道菌群能够刺激肠蠕动，并参与了肠神经系统。肠道菌群影响行为与中枢神经系统功能的证据越来越多。肠道菌群也影响能量平衡，并且不断涌现的证据证明肠道菌群在肥胖的病理生理学中具有重要作用。
8.肠细胞的成熟和更新(Maturation and turn-over of intestinal cells) 肠道菌群能够刺肠道上皮细胞的成熟和更新。
正是因为肠内菌群的上述重要功能，目前国内开发了众多益生菌制剂用以改善个体的健康状况，效果明显。目前世界上研究的功能最强大的产品主要是以上各类微生物组成的复合活性益生菌，包括①乳杆菌类(如嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、詹氏乳杆菌、拉曼乳杆菌等);②双歧杆菌类(如长双歧杆菌、短双歧杆菌、卵形双歧杆菌、嗜热双歧杆菌等);③革兰氏阳性球菌(如粪链球菌、乳球菌、中介链球菌等)。此外，还有一些酵母菌。
尽管益生菌对机体有必需的重要功能，但是作为活的生命体，益生菌也存在正常的繁殖和死亡的过程，并可产生诸多次级代谢产物。这其中，益生菌对机体尿酸水平的影响是需要考虑的重要问题之一，益生菌自身也具有分泌尿酸的能力，同时死亡菌体富含嘌呤， 嘌呤被机体吸收后最终会代谢成尿酸。两方面累计无疑会增加机体尿酸代谢的负担。
尽管人体内尿酸是一种天然的抗氧化物质，具有提高抗氧化活性、防止身体出现氧化应激的作用。但是，因为尿酸的溶解度低，所以当人体内的嘌呤代谢发生紊乱或食入过量尿酸后，引发血尿酸浓度过高时，尿酸会以钠盐的形式沉积在关节、软骨和肾脏中， 引起组织异物炎性反应进而引起高尿酸血症和痛风。在我国，人体血液中尿酸含量男性 >416. 5 μ mol/L,女性>357 μ mol/L被定义为高尿酸血症。目前，在我国高尿酸血症已经发病率较高且呈快速上升现状。
调查发现高尿酸血症的发病率已经相当普遍。据青岛大学医学院附属医院健康体检中心的公开统计资料显示，在1875例60 89岁老人中高血尿酸检出率达到了 23. 7%(青岛大学医学院学报，2012，47 (6) 520-522 )。江苏省省级机关医院社区体检中心公开资料显示，在年龄为48±15岁的5960例中青年中，高尿酸血症者患病率为10. 54%;在> 60岁的7860例老年人种，尿酸血症者患病率为13. 63% (实用老年医学，2011，25 (6) 454-456)0 广东省佛山市第一人民医院预防保健科体检中心统计结果发现，高尿酸血症是排在第4位的多发病，在1566名公安系统体检者中的发病率高达21. 78% (实用心脑肺血管病杂志， 2011，19(12)2195-2196)。上海市浦东新区北蔡社区卫生服务中心统计分析表明，在7516 位60岁以上的体检者中，高尿酸血症患者数占了 19. 50%，且无男女差别(实用心脑肺血管病杂志，2010，18 (11) 1597-1598)。
根据国内外文献资料，人体内的尿酸来源有两种一种是体内经由黄嘌呤分解代谢产生的，约占80% ;另一种是从食物中获取的，约占20%。体内尿酸大部分经由肾脏排泄， 25%经消化道排泄(实用医学杂志，2004，20(3) :337-338)。目前用于降低严重高尿酸血症和急性痛风病人血液中尿酸含量的治疗药物主要是通过(I)抑制肾小管对尿酸的重吸收 (如丙磺舒和苯澳香豆酮等)，或(2)通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性来阻止尿酸的生成(如别嘌呤醇)，或(3)通过静注尿酸氧化酶直接将尿酸氧化成比较容易排泄的尿囊素等三种方式。但此三种方式均有一定不良反应，如丙磺舒等排尿酸药物能引起尿酸盐晶体在尿路的沉积，引发肾绞痛和肾功能损害；别嘌呤醇则具有致敏性，对骨髓有抑制作用，还具有胃肠道刺激、皮疹、发热、肝损害等不良反应；尿酸氧化酶是异源蛋白，可引发机体免疫反应，出现发热，恶心，呕吐和皮疹等不良反应，不能够长期多次用药。这些方式不适合用于改善普通高尿酸血症群体使用。[0015]根据人体尿酸25%来源于肠道吸收，且有25%的尿酸经消化系统排泄的原理，有文献报道利用蒙脱石(J Pharm Pharmacol. 2009 61 (11) : 1499-504)和活性炭(中国现代医学杂志，2003 ,13(22): 117-118)灌胃的方式，利用吸附剂吸附消化道内的尿酸可使高尿酸血症小鼠体内的尿酸水平得到显著降低。但吸附剂的主要不良反应是久服引起便秘，吸附的特异性较差，对营养物质也有吸附作用等。有必要寻找一种安全可靠，可用于预防和早期降低血液尿酸水平的新措施。
人体内的益生菌是人体的共栖菌，可长期驻留在肠道内，数量庞大。这些益生菌本身就是机体尿酸的一个重要来源。日本明治乳业株式会社的一份专利中描述了通过突变筛选的方法，筛选出嘌呤体分解能力高的乳酸菌株，口服该菌的大鼠可以显著抑制血清尿酸的上升(专利公开号CN101932697A)。益生菌作为活的生命体也存在嘌呤代谢问题，自身也具有尿酸产生能力。本发明认为在益生菌中高效表达尿酸氧化酶，不仅可以降解自身所产生的尿酸，还可以分解肠道内食源性和血液渗透而来的尿酸，从而减少尿酸的吸收，加速尿酸经消化道的排泄，最终降低血尿酸的含量。此外，尿酸经尿酸氧化酶分解后形成的H2O2还是一种抗菌活性物质，有益于机体杀灭有害细菌。
由上可见，改造益生菌，增强菌体自身的尿酸分解能力，从而降低尿酸的产生量， 将可保留益生菌原有功效的同时改善益生菌引起血液尿酸水平升高的不利影响，为痛风病人、高血尿酸症患者以及潜在高血尿酸人群提供更好的福利。此外，通过长期口服或手术方法，将肠道内菌群部分或全部置换为低尿酸分泌的益生菌，将可长期降低尿酸经消化道吸收的量，最终降低血液尿酸水平。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种低尿酸分泌量益生菌的制备方法。
本发明的第二个目的在于提供一种可降低尿酸分泌量的基因工程干酪乳酸杆菌。
本发明的第三个目的在于提供一种降低尿酸产量的口服微生物制剂。
为实现本发明第一个目的，本发明公开以下技术方案一种低尿酸分泌量益生菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法包含如下步骤
(1)构建包含有尿酸酶基因开放阅读框的重组质粒；
(2)将(I)中所获得的重组质粒转染益生菌，筛选获得携带有该质粒的重组菌株；
(3)在(2)中所获得的重组菌株中筛选获得重组质粒可稳定存在、尿酸酶可持续表达并具有明显尿酸分解活性的低尿酸分泌的菌株。
所述的尿酸酶基因来自动物、植物、微生物的天然基因组序列或cDNA序列，或根据受体菌的密码子偏向性人工优化设计合成的序列。
在另一个优选例中，所述的尿酸酶来自于动物的天然基因组序列或cDNA序列，或根据受体菌的密码子偏向性人工优化设计合成的序列。
在另一个优选例中，所述的尿酸酶来自于猪的天然基因组序列或cDNA序列，或根据受体菌的密码子偏向性人工优化设计合成的序列。
所述的益生菌为乳酸菌、双歧杆菌、放线菌和酵母菌中的一种或几种。
在另一个优选例中，所述的益生菌为乳酸菌、双歧杆菌和酵母菌。
在另一个优选例中，所述的益生菌为乳酸菌和双歧杆菌。[0028]在另一个优选例中，所述的益生菌为乳酸菌。
所述的尿酸酶基因开放阅读框包含有能够指导尿酸酶编码基因实现组成性表达或瞬时表达的调控序列。
在另一个优选例中，所述的尿酸酶基因开放阅读框为组成型表达。
为实现本发明的第二个目的，本发明提供了利用上述制备方法获得的低尿酸分泌
量益生菌。
作为一个优选例，所述低尿酸分泌量益生菌为可降低尿酸分泌量的基因工程干酪乳酸杆菌，所述基因工程干酪乳酸杆菌中含有一种组成型表达人工合成的猪尿酸酶编码基因的表达框架，所述人工合成猪尿酸酶编码基因置于pMG36e表达载体内。
所述的基因工程干酪乳酸杆菌的体外尿酸分泌水平可较对照组降低10 50% ;更优的，该基因工程干酪乳酸杆菌的尿酸体外分泌水平可较对照组降低10 40%。
食用该基因工程干酪乳酸杆菌后体内血液中尿酸水平较野生菌组降低10 40% ； 更优的，食用该基因工程干酪乳酸杆菌后体内血液中尿酸水平较野生菌组降低10 30%。
为实现本发明第三个目的，本发明提供了一种降低尿酸产量的口服微生物制剂， 所述口服微生物制剂含有所述的低尿酸分泌量益生菌。通过长期口服所述微生物制剂或手术方法，将肠道内菌群部分或全部置换为低尿酸分泌的益生菌，从而长期降低经消化道吸收的尿酸量，最终降低血液尿酸水平。
本发明的优点在于本发明提供的低尿酸分泌量益生菌通过改造益生菌，增强菌体自身的尿酸分解能力，从而降低尿酸的产生量，将可保留益生菌原有功效的同时改善益生菌引起血液尿酸水平升高的不利影响，为痛风病人、高血尿酸症患者以及潜在高血尿酸人群提供更好的福利。此外，通过长期口服或手术方法，将肠道内菌群部分或全部置换为低尿酸分泌的益生菌，将可长期降低尿酸经消化道吸收的量，最终降低血液尿酸水平。
图I.猪尿酸氧化酶扩增载体pUC57_pU0。
图2.人工合成的猪尿酸氧化酶的编码序列和氨基酸序列；1-311为合成sUO翻译后的氨基酸序列，1-942为sUO的人工合成的DNA编码序列；下划线部分为pMG36e载体内的融合多肽；方框内为加入的限制性酶切位点，3’端为Sacl，5’端为Hindlll。
图3. pUC57-pU0质粒的酶切鉴定。A为酶切鉴定结果；B为MF13的部分测序结果。I为Ikb DNA分子量标记，各条带分子量为10000，8000, 6000, 5000, 4000, 3500， 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250bp ;2 为 Sacl+Hindlll 双酶切结果，可产生约O. 9kb和2. 7kb的预期条带；3为Sal I单切结果,可产生约3. 6kb的单一线性化条带。
图4. pMG36e的质粒图谱。Emr为红霉素抗性基因，来自金黄色葡萄球菌；箭头为 P32启动子；T为prtP的转录终止子。
图5.猪尿酸酶乳酸杆菌特异表达载体pMG-UO的鉴定。A为Sacl+Hindlll双酶切鉴定结果，可见所挑取的1-5个克隆均具有正确的酶切结果；6为I为Ikb DNA分子量标记，各条带分子量为 10000，8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000,2500, 2000, 1500， 1000，750，500，250bp。B为插入序列的5’和3’序列的测序结果，与理论序列一致。
图6. pMG-UO和pMG36e的转换菌落鉴定。M为Ikb DNA分子量标记，各条带分子量为 10000，8000，6000，5000，4000，3500，3000，2500，2000，1500，1000，750，500， 250bp ;1和2为pMG-UO转化的2个菌落，质粒经Sacl+Hindlll双酶切可获得预期O. 9kb 和3. 6kb的两条带。3和4为pMG36e的转化菌落，质粒经Sacl+Hindlll双酶切后，3号可获得预期3. 6kb的单一条，4号无质粒；+为阳性对照，是pMG-UO质粒经Sacl+Hindlll双酶切结果。
图7.重组尿酸氧化酶的表达分析。A为SDS-PAGE电泳结果，其中M为预染蛋白分子量标准，蛋白分子量为kDa ；UF0为UFO菌的裂解液；36e为36e菌的裂解产物；+为深圳迈瑞公司的尿酸测定试剂盒中的尿酸酶标准液(包含尿酸氧化酶和抗坏血酸氧化酶两种成分)。B 为 Western-blot 结果，一抗为 Santa Cruz 公司的 uricase (FL-303) Antibody (Cat. No. sc-33830)。
具体实施方式
本发明从众多益生菌中选择了乳酸杆菌作为研究对象。原因有如下几点(1)乳酸杆菌是唯一一种没有发现有致病性的菌；(2)乳酸杆菌是人和动物肠道中的最优势菌群之一，对于调节人和动物的生理和免疫起着至关重要的作用；(3)乳酸杆菌在益生菌中的粘附性是最好的，能很好地粘附在肠道或其它粘膜部位，终生发挥作用。
本发明检测了乳酸杆菌尿酸产生情况，发现在体外情况下，0D600=1时的乳酸杆菌，40°C静止孵育3小时，尿酸含量增加到了 881. 3± 12. 3 μ mol/L。分别稀释10倍和100 倍后，尿酸含量分别增加到了 590. 2±16. 3、192. I ±6. 2 μ mol/L。
体内进一步试验验证，采用小鼠灌胃的方式，0. 2ml/d，菌体浓度为0. lg/ml，分别灌胃I天和2天后检测小鼠血清中的尿酸含量，结果表明，小鼠血清中的尿酸水平分别从 179. 7 ±1.3 ymol/ml，增加到了 239. 8±19· 8 μ mol/L (I 天)和 285. 6 ±23. 8 μ mol/L (2 天)。
本发明根据GenBank公布的猪尿酸氧化酶基因序列(Accession No. M27697),通过乳酸菌密码子优化后，合成了猪尿酸氧化酶的全基因。将合成好的基因克隆入乳酸菌通用表达质粒pMG36e载体内，获得了猪尿酸氧化酶基因表达载体pMG36-puo。
将pMG36-pUO质粒导入了乳酸杆菌内，筛选获得了稳定遗传的重组乳酸杆菌。
蛋白表达检测表明，该菌株内可组成型的表达重组猪尿酸酶。
体外实验表明，起始OD=L O,分别稀释10倍和100倍后，40°C静止培养3小时， 该基因工程菌株的体外尿酸产量与不携带尿酸酶的菌株相比，尿酸水平分别下降了 23. 5%、 39. 9% 和 33. 3%ο
本发明开展了体内进一步验证，采用小鼠灌胃的方式，0. 2ml/d，浓度为0. lg/ml, 连续灌胃两天后检测小鼠血清中的尿酸含量，结果表明，表达尿酸酶和不表达尿酸酶相比， 血清尿酸含量降低了 19. 2%，差异显著。
由上述试验结果可见，在益生菌内高表达尿酸氧化酶是一种有效降低菌体自身尿酸产量的方法。
将这种低尿酸产量的益生菌制成口服微生物制剂，通过食入使工程菌驻留在消化道内并持续高效表达尿酸氧化酶。肠道内菌群不仅本身可大大降低尿酸的产量，还可以吸收和分解食源性与血液渗透而来的尿酸，从而减少尿酸的吸收，加速尿酸经消化道的排泄，降低血尿酸的含量。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Samtoook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例I、乳酸杆菌的体外尿酸生产情况检测
干酪乳酸杆菌(杭州味全食品有限公司)划线培养于MRS固体培养板(青岛海博生物技术有限公司)上，40°C培养30小时，取单菌落接种于IOml MRS液体培养基中，40 °C静置培养36 h。取5ml，8000g离心3分钟，收集菌体，用5ml生理盐水洗涤菌体3次。最后用新鲜的MRS液体培养基重悬菌体，调整菌体浓度至0D_=1. 0，然后用MRS液体培养液做10、100 倍稀释。上述各组设置重复3个重复，一同置于40°C静止培养3小时，然后SOOOg离心3分钟取上清进行尿酸含量检测。尿酸检测使用深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司BS-800 型生化分析仪测定,配套试剂盒为尿酸(UA)测定试剂盒(尿酸酶-过氧化物酶法)。
测定结果如表I.可见，干酪乳酸杆菌在生长期间有持续的尿酸产生。
表I.干酪乳酸杆菌培养期间尿酸产生情况单位μ mol/L
重复I重复2重复3平均值士标准差0D600=1899. 8878. 9865. 3881. 3±12. 310倍稀释604. 8600. I565. 7590. 2±16. 3100倍稀释183. 8191. 2201. 4192. 1±6. 2MRS液体培养基0. 00. 00. 00. 0
实施例2、口服乳酸杆菌对小鼠血清尿酸水平的影响
干酪乳酸杆菌，取单菌落接种于10ml MRS液体培养基中，40 1静置培养36 h。按照 I 100的比例，接种于新鲜的200ml MRS液体培养基中，持续培养24小时，8000g离心3分钟，收集菌体，用生理盐水洗涤菌体3次。最后一次离心后，除去上清后，准确称量菌体湿重，用按照加入适量生理盐水将菌体重新悬浮，终浓度为0. lg/ml。混匀后进行小鼠灌胃实验。
所用小鼠为体重18±lg的昆明白小鼠(购自中国军事医学科学院实验动物研究中心)，每组8只，雌雄各半。2次灌胃间隔24小时，最后I次灌胃12-15小时，摘眼球取血。 将血放入37°C培养箱放置半小时后，置4°C冰箱过夜。5000g，离心5分钟后，取血清测定尿酸含量。小鼠分组与结果情况如表2。
表2. 口服UFO菌和36e菌对小鼠血液尿酸含量的影响单位μ mol/L
灌胃I天平均值灌胃2天平均值乳酸杆菌 (n=8)218. 2,255. 3,243. 3,216. 8,256. 4,223. 6,270. 3,234. 6，239. 8±19. 8"325. 4,292. 3,255. 6,298. 6,253. 4,275. 6,296.8， 287. 2，285. 6±23. 8*生理盐水组 (n=8)178.4，181.3，179.5，177.4,180. 3，181. 0,179. 6,179.8179. 7±1. 3179. 4,177. 3,179. 5,177. 5，181. 3，180. 0,179.6， 179. 3179. 2±1. 3
*为与生理盐水相比具有显著性差异，P <0.01。
实施例3、猪尿酸氧化酶乳酸杆菌表达构件的制备
为了提高猪尿酸氧化酶(pig Urate oxidase, pUO)在乳酸杆菌中的表达量,本发明根据GenBank公开的猪尿酸氧化酶基因编码序列(NM_214270)和氨基酸序列，通过西班牙洛维拉·依维尔基里大学(UNIVERSITAT ROVIRAI VIRGILI)的在线密码子优化程序 (http://genomes, urv. es/OPTIMIZER/Form. php),对 pUO 的编码序列进行了针对嗜酸乳酸杆菌(lactobacillus bulgaricus)的密码子优化。同时,为方便克隆入乳酸杆菌表达载体 pMG36e，在所合成的序列的5’和3’端分别加入了 SacI和HindIII两个酶切位点。此外， 为了适应pMG36e载体内的读框顺序，合成序列的5 ’端做了调整，去除了前pUO蛋白N端的 10个氨基酸组成的信号肽。具体序列和载体情况见图2和图3，人工合成的猪尿酸氧化酶的编码序列和氨基酸序列参见SEQ ID NO. I所示，图2方框中的DNA序列没有编入序列表， 氨基酸序列用三联密码子表示，由DNA序列CDS获得。将设计好的序列送北京金唯智生物公司合成，合成序列装入了 PUC57载体内形成了 pUO基因的扩增载体，命名为pUC57-pU0 (图 I)。
将pUC57_pU0转化如DH5a菌内，大规模提取质粒，经Sacl+Hindlll双酶切后，琼脂糖凝胶电泳检测结果正确(图3)，同时经DNA测序表明pUO编码序列正确。
将pUO的编码框架用Sacl+Hindlll双酶切出后，定向插入经相同酶切的pMG36e 载体(图4)内，转化DH5a感受态细菌，挑取5个克隆，经质粒小提和酶切鉴定表明均为成功插入(图5A)，该质粒命名为pMG-UO载体。经测序表明，插入序列和读框完全正确(图5B)。
实施例4、特异表达猪尿酸氧化酶的乳酸杆菌的制备
本发明选择了市售味全优酪乳中的乳酸杆菌为受体菌。首先通过划线方法，将细菌划于MRS固体培养板上，40°C培养20-30小时，挑取单菌落，于MRS液体培养基中培养至饱和。 经pH值测定表明，饱和菌液(约培养30个小时)的pH为3. 2，表明改菌为可以产乳酸的嗜酸性乳酸杆菌。将饱和菌液用含有1%甘氨酸的MRS液体培养基稀释50倍后继续培养，进行感受态的制备。
通过电转化的方法，将pMG-UO转入乳酸杆菌内，同时设置空载体pMG36e质粒作为阴性对照。电转化后，约需在含有2 μ g/ml的MRS固体培养板上、40°C培养36-72小时，克隆方能长出。
两种转化体，各挑取2个克隆，提取质粒后进行酶切鉴定表明2个pMG-UO转化菌均与预期相符；pMG36e的2个转化菌落中有一个正确，另一个提取质粒失败(图6)。
将含有pMG-UO质粒的乳酸杆菌(以下简称UFO菌)和含有pMG36e质粒的乳酸杆菌(以下简称36e菌)饱和培养后，取5ml培养物离心收集菌落，用2mlPBS洗涤菌落2次，最终重悬于2mlPBS内，经研磨+超声破壁后，取200ul悬浮液，加入50ul的5 X SDS-PAGE上样缓冲液煮沸10分钟，然后取20ul进行SDS-PAGE电泳和Western-blot检测猪尿酸氧化酶的表达情况。经 Swiss Institute of Bioinformatics 的在线软件预测(http://web. expasy. org/compute_pi),本研究合成的重组猪尿酸氧化酶的分子量为35. 69kDa。图7表明，UFO菌中有明显的猪尿酸氧化酶的表达。
实施例5、重组乳酸杆菌的体外尿酸生产情况检测
分别挑取新鲜生长的UFO菌和36e菌单菌落，接种于IOml含有2 μ g/ml红霉素的MRS 培养基中过夜培养，8000rpm离心收集细菌，用PBS洗涤2次后，用添加有350 μ g/ml尿酸的 MRS液体培养基重新悬浮菌体。将两种菌液准确调制在600nm处的OD值为I. 0，并以此为母液，用添加有350 μ g/ml尿酸的MRS液体培养基做10倍和100倍稀释。将不加菌液的MRS、 OD600=L O的原液和稀释液每份3个重复，于40°C培养3个小时，离心取上清，利用深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司BS-800型生化分析仪测定上清中尿酸的含量，结果见表3。可见，转入pUO的乳酸杆菌的尿酸产量明显减少，三个组别菌与未转pUO的乳酸菌均有显著差异，尿酸产量最大降低了 39. 9%。值得注意的是，乳酸菌自身能够产生较大量的尿酸，提示高尿酸血症的病人不宜大量食用。
表3.转尿酸酶乳酸菌的体外尿酸代谢分析单位μ mol/L
权利要求
1.一种低尿酸分泌量益生菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法包含如下步骤(1)构建包含有尿酸酶基因开放阅读框的重组质粒；(2)将(I)中所获得的重组质粒转染益生菌，筛选获得携带有该质粒的重组菌株；(3)在(2)中所获得的重组菌株中筛选获得重组质粒可稳定存在、尿酸酶可持续表达并具有明显尿酸分解活性的低尿酸分泌的菌株。
2.根据权利要求
I所述的一种低尿酸分泌量益生菌的制备方法，其特征在于，所述尿酸酶基因来自动物、植物、微生物的天然基因组序列或cDNA序列，或根据受体菌的密码子偏向性人工优化设计合成的序列。
3.根据权利要求
2所述的一种低尿酸分泌量益生菌的制备方法，其特征在于，所述尿酸酶基因来自动物的天然基因组序列或cDNA序列，或根据受体菌的密码子偏向性人工优化设计合成的序列。
4.根据权利要求
3所述的一种低尿酸分泌量益生菌的制备方法，其特征在于，所述尿酸酶基因来自猪的天然基因组序列或cDNA序列，或根据受体菌的密码子偏向性人工优化设计合成的序列。
5.根据权利要求
I所述的一种低尿酸分泌量益生菌的制备方法，其特征在于，所述益生菌为乳酸菌、双歧杆菌、放线菌和酵母菌中的一种或几种。
6.根据权利要求
5所述的一种低尿酸分泌量益生菌的制备方法，其特征在于，所述益生菌为乳酸菌。
7.根据权利要求
I所述的一种低尿酸分泌量益生菌的制备方法，其特征在于，所述尿酸酶基因开放阅读框包含有能够指导尿酸酶编码基因实现组成性表达或瞬时表达的调控序列。
8.利用权利要求
I一7任一所述制备方法获得的低尿酸分泌量益生菌。
9.根据权利要求
8所述的低尿酸分泌量益生菌，其特征在于，所述益生菌是基因工程干酪乳酸杆菌，所述基因工程干酪乳酸杆菌中含有一种组成型表达人工合成的猪尿酸酶编码基因的表达框架，所述人工合成猪尿酸酶编码基因置于pMG36e表达载体内。
10.一种降低尿酸产量的口服微生物制剂，其特征在于，所述口服微生物制剂含有权利要求
8或9所述的低尿酸分泌量益生菌。
专利摘要
本发明公开了一种通过基因工程方法制备的低尿酸分泌量益生菌及其制备方法，利用本发明方法可制备获得尿酸分泌量明显降低的改良益生菌，保留益生菌原有功效的同时，改善益生菌引起血液尿酸水平升高的不利影响。本发明还公开了一种可显著降低尿酸分泌量的干酪乳酸杆菌及一种降低尿酸产量的口服微生物制剂及其应用，通过口服含有高表达重组尿酸酶的益生菌来降低血尿酸的方法，可为痛风病人、高血尿酸症患者以及潜在高血尿酸人群提供更好的福利。
文档编号C12N1/19GKCN102586315SQ201210039297
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月21日
发明者刘思国, 章泽人 申请人:刘思国, 章泽人导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan