专利名称：草药芯片的制作方法
技术领域：
本发明关于在塑料基质上以微数组的方式配置草药的分级液或成份。所述配置有草药分级液或成份的塑料基质是用于充作平台以筛选草药中具有特定药理活性或治疗功效的活性成份。
许多年来已知使用草药或其萃取液或分级液以充作药物。例如，使用柳树的树皮以充作抗发热剂和止痛剂已有2000年之久，及自公元17世纪已使用秘鲁金鸡纳(Cinchona)的树皮萃取液以治疗疟疾。
然而，迄今仅发现数种具有特定药理活性或治疗功效的草药活性成份。例如，于公元20世纪中期确认水杨醇(一种水杨醇葡糖苷)是柳树的树皮中具有抗发热活性和止痛活性的活性成份，及于公元1820年确认奎宁是秘鲁金鸡纳的树皮中具有治疗疟疾功效的活性成份。
自草药中发现具有特定药理活性或治疗功效的活性成份是相当费时且耗费人力的。例如，经自全世界收集超过35000个植物属种并筛选其超过110000个样品后，顷自北美红豆杉(Taxus brevifolia的树皮中分离出抗肿瘤药物—紫杉醇(taxol)。通常，找出存在于草药中的活性成份的一般模式是确认所述草药于人体中的功效，并藉由利用各种不同的物理和化学方法以分离草药的活性分级液，且随后分离及纯化其中的活性成份。分离并纯化出草药中所含有的活性成份并无一定的通则。虽然基于药理学，细胞生物学及分子生物学的发展已于分子或基因阶层上对致病原因的了解有显著的进展，且已发展出标的物筛选(shotgun screening)草药的萃取液的技术以期能直接命中得到存在于草药中所欲的活性成份，但是分离并纯化出草药中的活性成份仍然是耗费人力及尝试错误的工作，且其进展仍然缓慢。
此技艺已对能发展出一种新颖的方法及/或工具以自草药或其萃取液或分级液中迅速筛选出具有特定的药理活性或治疗功效的活性成份存有显著的需求。
固定大生物性分子于固体基质(例如，耐隆膜)上的技术已使用于此技艺中，例如西方吸渍法是用于固定耙或蛋白质，南方吸渍法是用于固定DNA片段，及北方吸渍法是用于固定RNA片段，并令固定化的分子与标记探针作用或反应，且随后显影所生成的经探针标记的分子。例如，连接免疫吸附分析法(ELISA)涉及固定化大生物分子于基质上，令所述固定化的分子与标记物作用或反应，及随后着色并显影所生成的标记分子。所述ELISA可于惯用的96孔槽微盘上进行。
近来，高密度栏格技术(High-density gridding technology)已使用于此技艺中以用于检测生物性样品(例如，DNA或蛋白质)中是否存有所需的标的物，其中样品是以预定的排列方式固定于固体基质(例如，玻璃载片)上，且利用标记探针进行杂交，随后进行冲洗及显影。于应用所述高密度栏格技术时，所述生物性样品是呈均一相的已知DNA或蛋白质库，且所述标记探针是呈不均相的未知或未经鉴定的物质。所述高密度栏格技术的优点是在于可将极少量体积的样品固定于基质表面的小栏格面积上，及可同时操作数千个样品。进一步，可使用计算机控制的3度空间自动机械装置及单一管尖组件(即微数组器)以于基质的表面上产生高密度栏格排列的生物性样品。
然而，迄今所述高密度栏格技术仅用于分析大分子，诸如蛋白质和核酸，其中固定于固体基质(例如，玻璃载片)的表面上的样品是呈均一相。此技艺并未教示或建议可将含有大生物活性分子(诸如，蛋白质或核酸)或小生物活性分子(诸如，二级代谢物)的不均相样品固定于固体基质(例如，塑料载片)的表面上。此技艺亦未教示或建议可将草药或其萃取液或分级液的均一相或不均相样品固定于固体基质(例如，塑料载片)的表面上，特别是所述样品是以微数组的方式排列。进一步，此技艺并未教示或建议藉由应用所述高密度栏格技术，令配置于固体基质(例如，塑料载片)的表面上的均一相或不均相未知样品与均一相或不均相的已知标记探针作用或反应，可进行草药中具生物活性的分子的高效筛选(high throughputscreening)。
据此，本发明的目的在于提供一种利用均一相或不均相的已知标记探针以筛选草药中的活性成份的新颖平台即草药芯片，其包含固定化于固体基质(例如，塑料载片)上的草药均一相或不均相分级液或成份。
本发明的另一目的是提供一种用于产制所述草药芯片的方法。
本发明的又一目的是提供一种利用所述草药芯片以筛选草药所含的活性成份的方法。
根据本发明本发明一方面的新颖的平台(称为草药芯片)，其包含塑料载片，于所述塑料载片上充作间隔子的涂层，及以微数组方式各别配置于所述涂层上的草药分级液或成份；本发明的草药芯片是用于筛选草药中具有特定药理活性或治疗功效的活性成份。
根据本发明的另一方面的制造所述的草药芯片的方法，它包含下列步骤制备塑料载片，利用多官能性分子涂覆所述塑料载片的表面，及于所述经涂覆的塑料载片上以微数组的方式于栏格面积上点配置及固定大量的样品，其特征在于，每一个样品含有均一相或不均相的草药分级液或成份。
根据本发明再一方面的利用所述的草药芯片以筛选草药中所含的活性成份的方法，它包含下列步骤加载含有标记探针的溶液至所述草药芯片上以进行杂交反应，及显影并鉴别出能与所述标记探针反应或结合的栏格样品。
为更清楚理解本发明的目的、特点和优点，下面将结合附图对本发明进行详细说明。
图1是说明用于制造本发明的草药芯片的塑料载片的透视图；图2A例示本发明的草药芯片的实例，其中样品是以6×10距阵的方式栏格于图1所示的塑料载片上；图2B显示于利用标记探针进行杂交反应前，图2A所示的草药芯片上的栏格样品所显现的内生性萤光；图2C显示于利用经Cy3标记的TNF-αR(肿瘤坏死因子α受体)及经Cy5标记的链球菌抗生物素蛋白进行杂交反应后，图2A所示的草药芯片上的栏格样品所显现的萤光影像；图3显示2个显现绿色萤光(Cy3)讯号的选择样品(草药C的分级液4和5，其分别对应于图2A所示的草药芯片上B7和B8，及B9和B10位置上的配置点)于竞争性抑制TNF-α/TNF-αR结合上的功效。
本发明揭示一种新颖的平台(称为草药芯片)，其是用于以标的物导向的方式标的物筛选草药所含有的活性成份以达到高效的结果。本发明的草药芯片包含塑料载片，于所述塑料载片上充作间隔子的涂层，及以微数组方式各别配置或固定于所述涂层上的草药分级液或成份。
于本发明的草药芯片中，每1个以微数组方式点配置的草药分级液或成份本质上是为得自于草药的未经界定，均一相或不均相，部份纯化的混合物。可藉由应用仪器(例如，HPLC)以分级分离草药的萃取液以得到所述分级液或成份。所述草药芯片上每一个配置点可包含草药的二级代谢物。
本发明的草药芯片是使用塑料载片以取代惯用的玻璃载片。所述塑料载片的材料可为同聚物或共聚物，其是由1种或多种单体所制备，所述单体是选自乙烯，卤乙烯，丙烯，卤丙烯，丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯，丁二烯，丙烯腈，原冰片烯或苯乙烯，其中苯乙烯的聚合物是适宜的。所述塑料载片的材料亦包括聚碳酸酯。所述塑料载片的大小是相当于微数组器或雷射扫描仪所惯用的载片大小。本发明的草药芯片使用塑料载片的优点是在于可使用各种不同的化学药剂以处理塑料载片的表面，使得不仅是大分子(诸如蛋白质和DNA)，也包括小分子(诸如草药的代谢物)可固定于塑料载片的表面上。此优点若对照惯用的玻璃载片仅能用于固定大分子(诸如蛋白质和DNA)的事实尤显得重要。再者，塑料载片可易于模制成所需的形状，且亦具有成本低的优异性。于本发明的较佳体是中，塑料载片是经模制以具有2个凹槽(如图1所示)，其中得自于草药的分级液或成份的样品可栏格化配置于所述凹槽的表面上，且随后可加载含有探针的溶液至所述凹槽上以进行杂交反应。所述2个凹槽的深度可为相同或不同，且是介于低于0.03mm至高达0.5mm的间。进一步，如示于图1，每1个凹槽的相对2边可分别模制栏杆以用于支撑玻璃盖，其中所述玻璃盖是用于防止蒸发或损失所述加载至所述凹槽上的含有探针的溶液。
于本发明的草药芯片中，利用多官能性醛及随后所浸没于提供NH2基团的前导物溶液中以先前处理所述塑料载片，使得所生成的塑料载片于其表面上含有具活性的胺基。所述提供NH2基团的前导物可为有机物或无机物，且可选自NH4OH，一级胺，二级胺或叔胺，其中所述一级胺，二级胺及叔胺的脂族及/或芳族部份可用于充作额外的间隔子。于所述提供NH2基团的前导物中，直接提供自由NH2基团的NH4OH是适宜的。
于本发明的草药芯片中，所述塑料载片上的涂层是由多官能性分子(例如，多官能性环氧化物)所构成，其是充作间隔子。所述多官能性环氧化物的作用是连接草药所含的成份至所述经先期处理的塑料载片上。所述多官能性环氧化物的一端的活性环氧基是与所述经先期处理的塑料载片的表面上的胺基反应，而所述多官能性环氧化物的另一端的活性环氧基是吸附或与草药所含的成份反应。详言的，草药成份中含有自由羟基，氢硫基及/或胺基的分子能与所述多官能性环氧化物的另一端的活性环氧基形成1个共价键，因而所述分子随后能连接至所述塑料载片上。所述多官能性环氧化物适宜地是含有6至24个碳原子长的化学链，使得草药所含的成份不会直接地结合或吸附至所述经先期处理的塑料载片上。于本发明的草药芯片中，每1个配置点对经涂覆的塑料载片的结合是牢固的，甚至经严厉的脱离冲洗后亦然。于本发明中，不仅是大分子(诸如蛋白质和DNA)，亦包括小分子(诸如草药的代谢物)皆可以均一相或不均相的方式固定于所述经涂覆的塑料载片的表面上。
制备本发明的草药芯片包含下列的步骤制备塑料载片(适宜地含有凹槽)，利用多官能性醛及随后浸没于提供NH2基团的前导物溶液(适宜地是NH4OH溶液)中以先期处理所述塑料载片，利用多官能性分子(适宜地是多官能性环氧化物)以涂覆所述经先期处理的塑料载片的表面，及于所述经涂覆的塑料载片的表面上，藉由应用高密度栏格技术，利用微数组器以微数组的方式于栏格面积上点配置且固定化大量的样品，其中每1个样品点含有呈均一相或不均相的草药分级液或成份。于制备本发明的草药芯片中，可使用整合性微小化技术(integratingminiaturization technology)以增加所述经涂覆的塑料载片上栏格样品的密度。
本发明还揭示一种利用所述草药芯片藉由标的物导向的方式以筛选草药所含的活性成份的方法，其包含下列的步骤将含有标记探针的溶液加载所述草药芯片(例如，所述草药芯片的凹槽)上以进行杂交反应(其中可藉由利用玻璃盖以盖住每一个凹槽以防止所述含有标记探针的溶液的蒸发)，及借助仪器(例如，雷射扫描仪)以显像并鉴识出能与所述标记探针结合或反应的配置点。所述连接探针的标记物可为染料或放射性物质。
本发明所使用的探针是基于已界定的分子机转而呈均一相或不均相的已知标的物，其可为，例如，拮抗诸如选择的细胞，受体，酶或蛋白质类的小分子化合物，竞争性配体，或抗体。于本发明的较佳体是中，是使用经Cy3标记的肿瘤壤死因子α受体(TNF-αR)和经Cy5标记的链球菌抗生物素蛋白(strepavidin)充作探针以进行杂交反应。因此，例如，若观察到显示所述草药芯片的配置点中的成份与经标记的TNF-αR结合的讯号，其显示所述配置点的成份中存有至少1种候选化合物，其具有类似于抗TNF-αR抗体的生物活性。所述等候选化合物可用于充作拮抗剂以降低发炎反应，因而可用于治疗自体免疫疾病，诸如类风湿性关节炎。
本发明的草药芯片可同时处理并检测数千个样品，因此能显著地增加标的物导向地筛选草药中生物活性成份的结果及效率。藉由使用本发明的草药芯片，能迅速地检测，分离并鉴定出任何存在于草药中具有潜在药理活性或治疗功效的成份。
本发明是以下述的实施例加以进一步的阐释和说明，但须明了的是本发明的范围并不以下述的实施例为限。
实施例先前处理塑料载片及制备经涂覆的塑料载片利用苯乙烯的聚合物制备如图1所示的模制塑料载片，其含有2个凹槽。所述模制塑料载片的大小是相当于微数组器或雷射扫描仪所使用的惯用玻璃载片，其中所述凹槽的深度是0.05mm。
首先，于室温下令所述模制塑料载片浸没于0.4％戊二醛溶液(pH5.0)中达4小时，随后经水冲洗并于60℃下浸渍于3M NH4OH(pH11.0)溶液中达4小时。于37℃下，利用100mM 1，4-丁二醇二缩水甘油醚(pH11.0)隔夜处理所生成的塑料载片。最终，利用0.1M NaHCO3溶液(pH8.0)冲洗所述塑料载片，并令其干燥。
利用微数组方式加载样品至经涂覆的塑料载片上利用微数组器BioGrid(购自BioRobotic，Cambridge，UK)点配置样品至所述上述经涂覆的塑料载片上。首先，令样品溶解并悬浮于96孔槽微盘上。利用4-针(0.2μm)管件连续地将样品自所述96孔槽微盘加载至所述经涂覆的塑料载片的凹槽表面上，其中图2A所示的草药样品是说明如下草药A和B的分级液是得自于蒲公英(Taraxacum mongolicum)的不同分级液，草药G是蒲公英的粗萃取液，草药F是凉喉(Hedyotis diffuse)的粗萃取液，草药C的分级液1至9是得自于凉喉的不同且部份纯化的分级液，草药D是忍冬(Lonicera japonica)的粗萃取液，草药E是红花(Carthamus tinctorius)的粗萃取液，草药J是一种得自于红花的纯化成份，草药H是连翘(Forsythia suspensa)的粗萃取液，及草药I是芍药(Paeonialactiflora)的粗萃取液。所述塑料载片的凹槽表面上的配置点经干燥后，于37℃下利用1M Tris溶液(pH8.0)浸没处理所述塑料载片2小时。利用雷射扫描仪(Axon，USA)显影所生成的塑料载片以确定所有样品皆吸附于所述塑料载片上(参阅图2B)。
杂交反应及信号侧测利用经Cy3标记的肿瘤坏死因子α受体(TNF-αR)和经Cy5标记的链球菌抗生物素蛋白(strepavidin)充作探针以进行杂交反应。于加载含有所述2种标记探针的杂交溶液(100μl TBST缓冲液，其含有50mM Tris，pH7.3，0.15M NaCl，及0.02％ Tween 20)前，利用2个玻璃盖片分别盖住所述塑料载片上的2个凹槽。令所述塑料载片于室温下静置4小时，随后以TBST缓冲液冲洗3次及以水冲洗3次。最终，令所述塑料载片于37℃下干燥。利用雷射扫描仪(Axon，USA)显影所述塑料载片。所述显影结果是示于图2C。
回收图2C显影上显现抑制TNF-α/TNF-αR结合的绿色萤光配置点。对应于所述绿色萤光配置点的草药分级液是含有能够与TNF-αR结合的活性成份。
显示正向绿色萤光讯号的样品的生物活性分析为证实上述所收集的分级液于抑制TNF-α/TNF-αR结合上的生物活性，进行文献Mancini et al.，Biochemical Pharmacology 58851-859，1999所描述的分析方法，其中已知成份「苏拉明」(Suramin)是充作正向对照组，并测试显现绿色萤光的2个样品(草药C的分级液4和5，其对应于图2A草药芯片上B7和B8，及B9和B10位置上的配置点)。所述测试结果是示于图3。
权利要求
1.一种草药芯片，其特征在于，它包含塑料载片，于所述塑料载片上充作间隔子的涂层；及以微数组方式各别配置于所述涂层上的草药分级液或成份。
2.如权利要求1所述的草药芯片，其特征在于，所述草药分级液或成份为均一相或不均相。
3.如权利要求1所述的草药芯片，其特征在于，为通过利用HPLC分级分离草药的萃取液以得到所述草药的分级液或成份。
4.如权利要求1所述的草药芯片，其特征在于，所述草药分级液或成份含有草药的二级代谢物。
5.如权利要求1所述的草药芯片，其特征在于，所述塑料载片的材料为聚碳酸酯，或由1种或多种单体所制备的同聚物或共聚物，所述单体为选自乙烯，卤乙烯，丙烯，卤丙烯，丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯，丁二烯，丙烯腈，原冰片烯或苯乙烯。
6.如权利要求5所述的草药芯片，其特征在于，所述塑料载片的材料为苯乙烯的聚合物。
7.如权利要求1所述的草药芯片，其特征在于，所述塑料载片含有2个凹槽。
8.如权利要求1所述的草药芯片，其特征在于，于涂覆所述塑料载片前，利用多官能性醛及随后浸没于提供NH2基团的前导物溶液中以先期处理所述塑料载片。
9.如权利要求8所述的草药芯片，其特征在于，所述多官能性醛为茂二醛。
10.如权利要求8所述的草药芯片，其特征在于，所述提供NH2基团的前导物为NH4OH。
11.如权利要求1所述的草药芯片，其特征在于，所述涂层为由多官能性分子所构成。
12.如权利要求11所述的草药芯片，其特征在于，所述多官能性分子为于每1个终端含有至少1个环氧基的多官能性环氧化物。
13.如权利要求12所述的草药芯片，其特征在于，于所述多官能性环氧化物的一端的环氧基为与所述经先期处理的塑料载片的表面上的胺基反应。
14.如权利要求12所述的草药芯片，其特征在于，于所述多官能性环氧化物的另一端的环氧基为与草药成份的自由羟基，氢硫基或胺基反应。
15.如权利要求12所述的草药芯片，其特征在于，所述多官能性环氧化物为含有6至24个碳原子长的化学链。
16.一种制造权利要求1所述的草药芯片的方法，它包含下列步骤制备塑料载片，利用多官能性分子涂覆所述塑料载片的表面，及于所述经涂覆的塑料载片上以微数组的方式于栏格面积上点配置及固定大量的样品，其特征在于，每一个样品含有均一相或不均相的草药分级液或成份。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述塑料载片含有2个凹槽且所述样品为点配置或固定于所述凹槽的表面上。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，于涂覆所述塑料载片前，利用多官能性醛及随后浸没于提供NH2基团的前导物溶液中以先期处理所述塑料载片。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述多官能性醛为戊二醛。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述提供NH2基团的前导物为NH4OH。
21.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述多官能性分子为于每1个终端含有至少1个环氧基的多官能性环氧化物。
22.一种利用权利要求1所述的草药芯片以筛选草药中所含的活性成份的方法，它包含下列步骤加载含有标记探针的溶液至所述草药芯片上以进行杂交反应，及显影并鉴别出能与所述标记探针反应或结合的栏格样品。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述含有标记探针的溶液为均一相或不均相。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述标记为染料或放射性物质。
全文摘要
本发明关于一种草药芯片，其包含塑料载片，于所述塑料载片上充作间隔子的涂层，及以微数组方式各别配置于所述涂层上的草药分级液或成份。本发明的草药芯片是用于筛选草药中具有特定药理活性或治疗功效的活性成份。
文档编号G01N33/68GK1391105SQ0112111
公开日2003年1月15日 申请日期2001年6月7日 优先权日2001年6月7日
发明者张素真, 徐立伟, 陈志萍, 李政伟 申请人:先进基因股份有限公司