专利名称：一次性血糖测定用电极及其制备方法
技术领域：
本发明属生物传感技术领域，具体涉及一种新型的一次性测定葡萄糖氧化酶血糖用的电极及其制备方法。
物理换能器有电化学、光谱、热、压电及表面声波技术等，按物理换能器不同分为电化学、光、半导体、压电晶体、热和介体等生物传感器。生物电化学传感器又分为安培型和电位型两种。在上述生物传感器中，研究和应用最多的是酶传感器。将酶作为试剂与电极结合是1962年由Clark和Lyons首先提出的(L.C.Clark，C.Lyons，Ann.N.Y.Acad.Sci，1962，102，582)。从此，在酶电极和生物传感器方面，每年都有大量工作发表，涉及酶的固定化、膜的组成、电极媒介体和电极的构造等。根据酶与电极间电子转移的机理，大致可将生物传感器分为三代第一代为采用酶的天然介体(氧的催化原理设计的酶传感器称为第一代生物传感器；而将人工合成的电子传递媒介体掺入酶层中，改进了分析常数和简化了处理步骤，能进行无试剂测量，称为第二代生物传感器；第三代生物传感器是指在无媒介体存在下，利用酶与电极间的直接电子转移制作的酶传感器。近年来，生物传感器及生物芯片引起人们的极大关注，相当多的公司和研究单位开展了生物传感器的研究与开发，相关的论文和专利与日俱增。
根据最近的文献报道，已研制成功的有氨基酸、胆固醇、乙酰胆碱、嘌呤类以及生物芯片等生物传感器。目前这方面的主要任务是继续研制和开发新的生物传感器，更重要的是要研制可商品化的高灵敏度、高选择性、精密度好、寿命长和价廉的传感器。其中最关键的是酶和媒介体的固定化，以及媒介体的选择，处理的好坏直接影响传感器的各项指标和寿命。葡萄糖氧化酶电极，30余年来一直在不断地研究，发表的论文在100篇以上，至今仍在不断探索新的制造方法。
发明内容
本发明的目的在于提出一种灵敏度高、线性范围宽、检测下限低、抗干扰能力强、使用寿命长的一次性葡萄糖氧化酶血糖测定用电极及其制备方法。
本发明提出的一次性葡萄糖氧化酶血糖测定用电极，由电极基板、铝膜电极引线、绝缘膜、基体碳电极、电子媒体修饰层、Ag/AgCl参比修饰层、PVC绝缘膜构成，见
图1所示。其中，电极基板1是整个电极的支撑体，铝膜电极引线2直接制作在电极基板1上面，其上再贴制有绝缘膜3，该绝缘膜上预留有2个洞孔，在两个孔中分别刮制有碳膜电极，并与2条铝引线连通。电极基板1的一端或两端的铝膜裸露，用于与仪器接插；非裸露部分贴制有PVC绝缘膜4，用于构成样品检测区；样品检测区的PVC绝缘膜4上开有与绝缘膜3上洞孔对应的洞孔，其中绝缘膜3上的一个洞孔内制作有电子媒介体修饰层和含有葡萄糖氧化酶的壳聚糖修饰层，另一个洞孔内制作有Ag/AgCl参比修饰层，构成含电子媒介体的葡萄糖氧化酶修饰碳电极5和含Ag/AgCl的参比碳电极6，简称葡萄糖氧化酶电极和Ag/AgCl参比电极。这两个电极体系也称为葡萄糖生物传感器。
本发明中，电子媒介体修饰层可采用1-二茂铁基乙胺。电极基板1可采用PVC或覆塑纸板。
本发明还提出了上述一次性葡萄糖氧化酶血糖测定用电极的制作方法。具体步骤如下1、基体电极制作在电极基板1上制作2条铝膜电极引线2，制作方法可以用烫金技术。再覆盖上预留有2个洞孔的透明绝缘膜3，该绝缘膜3可以采用双向拉伸聚丙烯POPP压敏胶带；采用含碳粉和双组份环氧树脂调制的碳浆，在两个洞孔中刮制基体碳膜电极，碳膜电极分别与两条铝线2连通；然后再贴制上PVC绝缘膜4，膜上预留有与膜3上洞孔对应的洞孔，作为样品检测孔；2、葡萄糖生物传感器的制作在一个洞孔中的碳膜电极上滴加1-二茂铁基乙胺乙醇溶液，待乙醇挥发后，得含电子媒介体的碳膜，将预先配制的壳聚糖溶液和葡萄糖氧化酶溶液的混合修饰液修饰在上述碳膜上；在另一个洞孔中的碳膜电极上修饰Ag/AgCl参比层，其厚度为20-50微米，该参比层可使用含Ag/AgCl、碳粉和双组份环氧树脂调制的碳浆制作；最后，将电极置于戊二醛溶液中室温熏蒸10-30分钟，即得所需电极。
上述制作步骤中，1-茂铁基乙胺乙醇溶液由1-茂铁基乙胺溶解于无水乙醇中得到，其浓度为1-5％，为黄色澄清溶液。壳聚糖溶液由壳聚糖加冰醋酸调成糖浆状后再用水稀释得到，浓度为1-2％(W/W)。葡萄糖氧化酶溶液由葡萄糖氧化酶用50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)溶解而得到，其浓度为2-4％，为淡黄色澄清溶液，在两者的混合修饰液中前者和后者的用量比是2∶1-4∶1。戊二醛溶液由25％戊二醛溶液用50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)稀释1倍而得到。
本发明提供的上述血糖测定用电极，其各部分的作用原理如下葡萄糖氧化酶用于特异性地识别葡萄糖并将其氧化为δ-葡萄糖酸内酯；1-二茂铁基乙胺为葡萄糖氧化酶与电极间的新型电子传递，作为酶促反应的氧化剂参与葡萄糖的氧化，它的主要作用是酶反应和电极间的电子传递媒介，使氧化酶降低检测电位，提高电极的选择性。同时选用生物相容性好的新型天然高分子材料壳聚糖为电极敏感材料葡萄糖氧化酶的固定材料，大大提高了电极的稳定性、寿命和重现性，同时该膜材料可提高电极的抗干扰能力。其中基板采用纸板，容易加工，降低了成本。更重要的是纸容易降解，属绿色环保产品。
本发明的电极生产工艺简单，电极灵敏度高、线性范围宽、检测下限低、抗干扰能力强、寿命长达一年，在实际血样测试中性能良好，可用于一次性血糖测定。具体可见下述的测试实验结果。
1、传感器对葡萄糖的响应本实验采用磁力搅拌注射法测定恒电位计时电流曲线，溶液用磁力搅拌(搅速为180rpm)，控制电位为0.30V，连续记录电流-时间曲线，用微量进样器每次注射一定体积(如10μl)的1.0mol/l葡萄糖溶液，结果见图2所示。实验发现随葡萄糖浓度增加，曲线的噪音升高，这可能是磁力搅拌引起的电极表面葡萄糖浓度的微小变化产生的。测定增加葡萄糖浓度产生的电流与葡萄糖浓度的关系曲线见图2。当y为电流(nA)，x为葡萄糖浓度(mmol/l)，线性回归方程为y＝54.807x+8.1667(R2＝0.9997)，检测下限为1.825μmol/l，线性范围5.0μmol/l~15mmol/l，当浓度高于15.0mmol/l，出现负偏差，电流增加值低于理论值，电极反应由葡萄糖的扩散控制转向由酶的催化反应动力学过程控制。对照实验表明，在相同实验条件和检测电位下，裸电极对葡萄糖无电流响应。
2、传感器的抗干扰能力为测定电极的抗干扰能力，采用搅拌注射法，在含0.2mmol/l的葡萄糖的底液中，依次加入0.2mmol/l L-抗坏血酸、尿酸、甘油、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、高半胱氨酸、Tyr、Trp、GABA、Ala、Gly、Glu、Asn、Tau、Glu、Asp和谷胱甘肽(R-SH)，发现尿酸和L-抗坏血酸对测定没有明显干扰，其它均无电流响应。
3、传感器的重复性、寿命和响应时间电极重复性良好，11次连续测试含0.2mmol/l葡萄糖测试液的电流值的RSD为2.07％。该电极在4℃冰箱中保存11个月，电极对0.2mol/l的葡萄糖溶液响应电流下降值小于12％。此外，电极的响应时间短，对于0.2mmol/l的葡萄糖响应时间仅0.5-1.0s。
4、传感器对血清中葡萄糖的测定用本传感器测定四例血清样品(1-4)，测定结果见表1，与上海市中山医院检验科全自动生化分析仪测定结果基本一致。其中，1和2为正常人血清，3和4为糖尿病人血清，显然本方法可用于糖尿病的诊断。取血清3的脱蛋白提取液1ml于5ml容量瓶中，加0.01mol/l葡萄糖贮液0.125ml后定容，使加入的葡萄糖浓度为2.5×10-4mol/l，用本传感器三次测定的平均回收率97.87％(相对标准偏差RSD＝3.26％)。表1 传感器测定人血清中葡萄糖结果样品 正常人血清 糖尿病人血清No.1 2 3 4浓度(mmol/l) 5.746 5.290 17.948 17.606RSD(n＝3，％) 2.261.141.451.70参考值(mmol/l)a5.4 5.2 17.617.6a由中山医院检验科7170A自动生化分析仪(Hitachi，Japan)测定。
本发明的电极可用于人全血、血清和尿液中葡萄糖的测定，还可用于其它含葡萄糖水溶液(如果汁等)中葡萄糖的测定。
图2为本发明电极在样品检测孔处的剖面图示。
图3为本发明中传感器对葡萄糖的响应曲线，其中图2(a)为对每次注射葡萄糖的响应曲线，图2(b)为传感器响应电流与葡萄糖浓度的关系。
图中标号1为电极基板，2为铝引线，3为透明绝缘层，4为PVC绝缘层，5为含电子媒介体的葡萄糖氧化酶修饰碳电极，6为Ag/AgCl修饰的参比碳电极。
该电极性能良好，已成功用于血清中葡萄糖的测定，上述实验结果为本纸质葡萄糖生物传感器的测试结果。优点为纸板基材容易降解，对环境污染小，且容易加工，成本低。
实施例2、基于PVC基体的一次性血糖电极基体电极制作聚氯乙烯(PVC)片材(0.06×1×4cm)上通过烫金技术在上面制作铝质电极引线，覆盖有两个预留圆孔(直径为1.5mm)的透明双向拉伸聚丙烯POPP压敏胶带，主要用于非接触部分铝质电极的绝缘。两端或一端的铝质电极引线裸露，用于与仪器连接。在两个预留圆孔刮制基体碳膜电极(使用含碳粉和双组分环氧树脂调制的碳浆)，碳基体电极分别与两条铝线连通，然后贴制兰色压敏PVC绝缘膜2，待环氧树脂固化，即得PVC基体电极(电极样式为B型)；PVC葡萄糖生物传感器的制作在点样处的两个碳电极中的一个滴加2.5％(w/w)1-二茂铁基乙胺乙醇溶液5微升，待乙醇挥发即可，然后将2％(w/w)壳聚糖溶液和4％(w/w)葡萄糖氧化酶按体积比3∶1混合，取10微升修饰在该含电子媒介体的碳膜上，另一个电极修饰Ag/AgCl参比修饰层(使用含Ag/AgCl、碳粉和双组分环氧树脂调制的碳浆)，其中厚度约30微米，于4℃冰箱中过夜干燥后，电极然后于盛有12.5％(w/w)戊二醛溶液的容器中室温熏蒸20min即成。
实用表明该PVC葡萄糖生物传感器性能与实施例1电极性能相当，没有明显差异。该电极防潮性能较好，机械强度较高。
权利要求
1.一种一次性葡萄糖氧化酶血糖测定用电极，由电极基板、铝膜电极引线、绝缘膜、PVC绝缘膜构成，其特征在于电极基板(1)为整个电极的支撑体，铝膜电极引线(2)直接制作在基板(1)上，其上再贴制有开有2个洞孔的绝缘膜(3)，两个孔中分别刮制有碳膜电极，并与两条铝引线连通；电极基板(1)的一端或两端裸露，用于与仪器接插，非裸露部分再覆盖有PVC绝缘膜(4)，该绝缘膜(4)上开有与绝缘膜(3)上的两个洞孔对应的洞孔；在其中一个洞孔内依次制作有含电子媒介体修饰层和含有葡萄糖氧化酶的壳聚糖修饰层，在另一个孔内制作有含Ag/AgCl的参比修饰层(6)。
2.根据权利要求1所述的血糖测定用电极，其特征在于电子媒介体采用1-二茂铁基乙胺，电极基板(1)采用PVC或覆塑纸板。
3.如权利要求1所述的一次性葡萄糖氧化酶血糖测定用电极的制备方法，其特征在于具体步骤如下(1)基体电极的制作在电极基板(1)上制作两条铝膜电极引线(2)，再覆盖上预留有两个洞孔的透明绝缘膜(3)；采用由碳粉和双组份环氧树脂调制成的碳浆，在两个洞孔中刮制基体碳膜电极，并使其分别与两铝引线(2)连通；然后再贴制上PVC绝缘膜(4)，该膜上预留有与膜(3)上洞孔对应的洞孔；(2)葡萄糖生物传感器的制作在一个洞孔中的碳膜电极上滴加1-二茂铁基乙胺乙醇溶液，待乙醇挥发后，得含电子媒介体的碳膜，将预先配制的壳聚糖溶液和葡萄糖氧化酶溶液的混合修饰液修饰在上述碳膜上；在另一个洞孔中的碳膜电极上修饰Ag/AgCl参比层，其厚度为20-50微米，该参比层可使用含Ag/AgCl、碳粉和双组份环氧树脂调制的碳浆制作；最后，将电极置于戊二醛溶液中室温熏蒸10-30分钟，即得所需电极。
4.根据权利要求3所述的电极的制备方法，其特征在于所述制作步骤中，1-茂铁基乙胺乙醇溶液由1-茂铁基乙胺溶解于无水乙醇中得到，其浓度为1-5％；壳聚糖溶液由壳聚糖加冰醋酸调成糖浆状后再用水稀释得到，浓度为1-2％(W/W)；葡萄糖氧化酶溶液由葡萄糖氧化酶用50mmol/L磷酸缓冲液溶解而得到，其浓度为2-4％；在两者的混合修饰液中前者和后者的用量比是2∶1-4∶1；戊二醛溶液由25％戊二醛溶液用50mmol/L磷酸缓冲液稀释1倍而得到。
全文摘要
本发明涉及一种一次性葡萄糖氧化酶血糖测定用电极及其制备方法。以PVC板或覆膜纸板为电极基底材料,在上面制作铝质电极引线,覆盖两个预留有洞孔的绝缘膜,在孔中刮制基体碳膜电极,电极分别与两条铝线连通。然后分别在碳电极上分别制作电子传递媒介体1－二茂铁基乙胺修饰层和Ag/AgCl参比修饰层,将含葡萄糖氧化酶的壳聚糖溶液修饰在含电子媒介体的碳膜上,于盛有戊二醛溶液的容器中熏蒸即成。该电极生产工艺简单,电极灵敏度高、线性范围宽、检测下限低、抗干扰能力强、寿命长达一年,在实际血样测试中性能良好,可用于血糖测定。
文档编号G01N27/30GK1373361SQ02111330
公开日2002年10月9日 申请日期2002年4月11日 优先权日2002年4月11日
发明者陈刚, 柴建青, 雷杰 申请人:复旦大学