专利名称：一种检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种检测类鼻疽菌感染的试纸及其制备方法，特别涉及一种检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸及其制备方法。
背景技术：
类鼻疽病(Melioidosis)是由类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderiapseudomallei)感染引起的人兽共患病。类鼻疽菌是重要的生物战剂，已被列入国际禁止生物武器公约致病微生物核查清单，“9.11”以后被美国列入可能用于进行生物恐怖活动的烈性细菌。人和动物通过吸入和/或食入类鼻疽菌感染，如得不到及时治疗，可发展为急性败血症，死亡率极高，法越战争时期，法国侵略者伞兵在越南境内跳伞造成外伤者，感染死亡率在90％以上；慢性症状可表现为持续发热、伤口不愈、蜂窝组织炎、胸膜积液、肺炎和不愈性咳嗽等。由于类鼻疽病没有典型的临床症状，并且急性致死率高，慢性症状如没有对应的抗菌素治疗，很难治愈。因此快速和特异的诊断试验尤其必要。
类鼻疽病一般是根据流行病学资料、临床表现和实验室诊断的综合结果作为诊断依据。
类鼻疽疫源地主要分布在热带、亚热带地区，有类鼻疽疫区生活史、旅行史和野外作业史，出现原因不明发热或化脓性患者，或X-射线检查表现为肺结核而又不能查出结核杆菌的病人，均应初步怀疑类鼻疽菌感染。
类鼻疽病根据其临床表现可分为急性败血型、亚急性型和慢性型。急性败血型潜伏期一般4-5d，病人表现严重寒战、发热、虚脱及呼吸道感染症状(咳嗽、脓痰、咯血、胸痛等)、肾衰竭和消化道症状，预后不良，死亡率极高，为最为严重的临床类型。亚急性型病程数周至数月，感染可发生于各种组织，其中以肺部感染为多，以发热、咳嗽和消瘦为特征，X线透视可见肺空洞和浸润，多见于肺上叶。该型可转化为急性败血型或慢性型。慢性型病程长达数年，慢性类鼻疽病局限于某一器官，受侵最常见肺部，酷似结核或真菌感染。
临床样品中的类鼻疽菌培养和鉴定是重要的诊断方法，一般是从病人的血液、痰、脓、尿或脑髓分离类鼻疽菌，然后进行一系列生化和血清学鉴定。但是从临床样品中分离和培养细菌受到许多限制，如病人是否用药、实验室是否具备条件，并且培养和鉴定操作繁锁，使临床诊断困难。
血清抗体检测是另一个快速而可靠的类鼻疽病诊断方法，患者感染1周后可出现特异血清抗体，国内外均有临床诊断应用的报道，常用的抗体检测方法有间接血球凝集(IHA)、间接免疫荧光(IFA)和ELISA，这三种试验阳性标准不同，但均有较好的诊断意义。IHA抗体滴度达1∶80以上判为阳性反应，即有类鼻疽菌感染，ELISA试验中检出IgM抗体、或IgG抗体1∶400以上判为阳性反应。
临床诊断技术的发展方向为更简便、更快速，非专业技术人员或患者本人在短时间内即可操作解读。这些技术中近年来发展较快、应用较广的是免疫层析检测(Immuno-Chromatographic Assay，ICA)试纸技术，即金标技术，该技术是用包被在NC膜上的配对物(抗原或抗体)进行捕捉，然后用免疫胶体金探针检测，阳性样品2分钟后出现肉眼可见的沉淀线，该技术与其它方法比较，优势在于检测过程中样品处理简单，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，很适合突发事件现场和基层使用。
发明创造内容本发明的目的是提供一种检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸(ICA试纸)。
本发明所提供的检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸(ICA试纸)，包括吸水纸垫、紧密连接于所述吸水纸垫上面的纤维膜、紧密连接于所述纤维膜上面的含有金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针的金标垫和紧密连接于所述金标垫上面的样品垫；所述纤维膜载有相互分离的检测线和质控线，所述检测线为类鼻疽菌多糖抗原，所述质控线为可和金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体。
为了使用更加方便，所述吸水纸垫的下面还紧密连接有背板。背板的材料可以是多种多样的，如塑料、树脂、PVC板等。
本发明的第二个目的是提供一种制备上述检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸的方法。
本发明所提供的制备上述检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤1)制备类鼻疽菌多糖抗原；用0.01M pH7.2的磷酸缓冲液(PB)将该抗原和可与金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体分别稀释至2-4mg/ml和1-4mg/ml，然后分别喷于纤维膜上形成相互分离的检测线和质控线，37℃干燥2-4小时，然后将其粘贴在吸水纸垫上；2)制备金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针；将该探针溶于0.25-0.4％四硼酸钠溶液中，使其终浓度为5-10％，然后将玻璃纤维膜、树脂浸入上述探针溶液中，得到金标垫，在-20℃--50℃冰冻5-8小时后，冷冻抽干后将其粘贴在步骤1)中得到的粘贴于吸水纸垫上面的喷有相互分离的检测线和质控线的纤维膜上面；3)在步骤2)中的金标垫上面再粘贴样品垫，得到检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸。
为了使用更加方便，所述吸水纸垫的下面还粘贴有背板。
本发明所提供的检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸及其制备方法中，所述类鼻疽菌多糖抗原可按下述方法制备将类鼻疽伯克霍尔德氏菌接种于4％甘油普通琼脂培养基，37℃培养24-48h，用无菌生理盐水洗下菌苔，流通蒸汽1h-2h，冷却至室温后5000-8000rpm离心10-15min，上清即为类鼻疽菌多糖抗原；所述金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)标记胶体金探针，可按下述方法制备用水溶解氯金酸使其终浓度为0.01％，煮沸后每100ml氯金酸溶液进行以下操作加入1％的柠檬酸三钠水溶液1.6ml，继续煮沸10-15分钟，用水恢复至100ml，冷却至室温后用K2CO3调pH至6-7，搅拌加入SPA 0.7-1.0mg，10min-30min后加入10％的聚乙二醇(20000)2ml，继续搅拌20min-30min，9000rpm-15000rpm离心25min-35min，弃上清，沉淀即为SPA标记胶体金探针；所述纤维膜可为硝酸纤维膜、醋酸纤维膜；所述金标垫的材料可为玻璃纤维膜、树脂等；所述可和金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体可为羊、兔、豚鼠、猪、小鼠、猴等IgG。
其中，调节pH值的K2CO3的浓度可为0.1M-0.3M，优选为0.2M。
在实际应用中，所述纤维膜的厚度可为2.5-3mm；所述金标垫的厚度可为30-70mm；所述样品垫的厚度可为0.1-0.2mm。
本发明的检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸与ELISA方法检测原理相同，检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸是将类鼻疽菌多糖包被在NC膜上，用于捕捉血清中类鼻疽抗体，然后用标记了SPA的免疫胶体金探针检测；阳性血清样品类鼻疽抗体(IgG和IgM)的Fc端与金颗粒上的SPA结合，Fab端与NC膜上的类鼻疽多糖结合，层析2分钟后出现肉眼可见的沉淀线。
实验证明本发明的检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸特异性强、敏感、简便、快速，与IHA和ELISA相比，更适合于临床、突发事件以及基层的类鼻疽病诊断。
具体实施例方式
实施例1、检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸的制备材料氯金酸(HAuCl4.4H2O)，分析纯，上海试剂一厂；柠檬酸三钠(Na3C6H5O7.2H2O)，分析纯，北京化工厂；碳酸钾(K2CO3)，分析纯，北京化工厂；
金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，购于Amersham Pharmacia Biotech公司；类鼻疽菌株，(中国医学细菌保藏管理中心，350102)；羊抗人IgG(提取人的IgG免疫羊获得，具体方法见《免疫化学研究进展》，李成文著，中国科学技术出版社，1993年)；类鼻疽阳性兔血清，(类鼻疽菌多糖抗原免疫家兔获得，具体方法见《免疫化学研究进展》，李成文著，中国科学技术出版社，1993年)。
正常兔血清，类鼻疽阳性猪血清，正常猪血清，类鼻疽阳性人血清，正常人血清，按常规方法分离保存；1、类鼻疽菌多糖抗原的制备将类鼻疽伯克霍尔德氏菌350102接种于4％甘油普通琼脂培养基，37℃培养48h，用无菌生理盐水洗下菌苔，菌悬液约为比浊浓度(1×108个菌/ml)，流通蒸汽1h，冷却至室温后8000rpm离心15min，上清即为类鼻疽菌多糖抗原，收集上清备用。
2、金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)胶体金探针的制备用纯水溶解氯金酸使其终浓度为0.01％，煮沸后每100ml氯金酸溶液进行以下操作加入1％的柠檬酸三钠水溶液1.6ml，继续煮沸10分钟，用纯水恢复原体积(100ml)，冷却至室温后用0.2M K2CO3调pH6，磁力搅拌下加入SPA 0.7mg，15min后加入10％的聚乙二醇20000 2ml，继续搅拌30min，15000rpm离心35min，弃上清，沉淀即为SPA标记胶体金探针，用0.25％四硼酸钠保存液恢复至原体积的十分之一，即10ml，4C冰箱保存。
3、检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸的制备检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸由吸水纸垫、硝酸纤维膜、金标垫和玻璃纤维膜样品垫四部分组成。
分别用0.01M pH7.2磷酸缓冲液稀释步骤1中制备的类鼻疽菌多糖抗原至2mg/ml和羊抗人IgG至2.5mg/ml，用BIODOT公司XYZ3000喷膜机分别喷于2.5mm厚硝酸纤维素膜上，形成相互分离的检测线和质控线，37℃干燥2.5h，然后将其用双面胶粘贴在吸水纸垫上；将50mm厚的玻璃纤维膜浸于步骤2中制备的SPA标记胶体金探针液中制备成金标垫，冷冻干燥机抽干后备用；将该金标垫用双面胶粘贴在上述具有检测线和质控线的硝酸纤维膜上，再在该金标垫上面用双面胶粘贴0.15mm厚的玻璃纤维膜样品垫，最后将它们用双面胶粘贴在塑料背板上，按所需大小切割，即为检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸，加干燥剂后密封保存。
实施例2、检测临床血清样品将待检人或动物血清样品用生理盐水按1∶40稀释，取实施例1中制备的检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸1条，浸入经上述稀释的血清样品中，2min后开始观察结果，15min观察终止。以血清效价1∶40以上为阳性诊断标准，出现1条红色(对照)沉淀线，为类鼻疽血清学诊断阴性，即无类鼻疽菌感染；出现2条红色(样品和对照)沉淀线，为类鼻疽血清学诊断阳性，即有类鼻疽菌感染。
检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸检测动物血清样品结果如表1所示，表明检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸与IHA在检测动物血清样品中具有较好的一致性，1号兔血清为免疫血清，因此在IHA和ICA中均具有较高的抗体效价，2号和3号为正常兔血清，在IHA和ICA中全部为阴性；1-4号猪血清收集自然疫源地流行病调查中无症状隐性感染猪，在IHA和ICA中均具有抗体效价，5-13号猪血清收集自非疫源地；正常猪，在IHA和ICA中全部为阴性。
检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸检测人血清结果如表2所示，表明1-6号人血清(来自临床经细菌培养诊断为类鼻疽病患者)，在ELISA和ICA中均具有较高的抗体效价；7-26号人血清来自与上述类鼻疽病患者同一地区的正常体检人群，在ELISA和ICA中全部为阴性。结果说明检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸与ELISA在检测人血清样品中也具有较好的一致性，因为这些人血清来自同一地区的类鼻疽病患者和正常人，用于检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸特异性评价，具有良好的可比性。
表1.检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸检测动物血清样品样品(编号) IHA效价 ICA效价 样品(编号) IHA效价ICA效价兔血清(1)1∶2560 1∶20000猪血清(6) - -兔血清(2)- - 猪血清(7) - -兔血清(3)- - 猪血清(8) - -猪血清(1)1∶40 1∶1000 猪血清(9) - -猪血清(2)1∶1601∶1000 猪血清(10) - -猪血清(3)1∶80 1∶1000 猪血清(11) - -猪血清(4)1∶6401∶5000 猪血清(12) - -猪血清(5)- - 猪血清(13) - -
表2.检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸检测人血清样品样品编号 ELISA效价 ICA效价样品编号 ELISA效价ICA效价11∶32001∶800014--21∶25600 1∶80000 15--31∶32001∶10000 16--41∶16001∶200017--51∶64001∶20000 18--61∶400 1∶100019--7- - 20--9- - 22--10 - - 23--11 - - 24--12 - - 25--13 - - 26--
权利要求
1.一种检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸，包括吸水纸垫、紧密连接于所述吸水纸垫上面的纤维膜、紧密连接于所述纤维膜上面的含有金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针的金标垫和紧密连接于所述金标垫上面的样品垫；所述纤维膜载有相互分离的检测线和质控线，所述检测线为类鼻疽菌多糖抗原，所述质控线为可和金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体。
2.根据权利要求1所述的检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸，其特征在于所述吸水纸垫的下面还紧密连接有背板。
3.根据权利要求1或2所述的检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸，其特征在于所述类鼻疽菌多糖抗原可按下述方法制备将类鼻疽伯克霍尔德氏菌接种于4％甘油普通琼脂培养基，37℃培养24-48h，用无菌生理盐水洗下菌苔，流通蒸汽1-2h，冷却至室温后5000-8000rpm离心10-15min，上清即为类鼻疽菌多糖抗原。
4.根据权利要求1或2所述的检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸，其特征在于所述金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针，可按下述方法制备用水溶解氯金酸使其终浓度为0.01％，煮沸后每100ml氯金酸溶液进行以下操作加入1％的柠檬酸三钠水溶液1.6ml，继续煮沸10-15分钟，用纯水恢复至100ml，冷却至室温后用K2CO3调pH至6-7，搅拌加入SPA 0.7-1.0mg，10-30min后加入10％的聚乙二醇(20000)2ml，继续搅拌20-30min，9000rpm-15000rpm，离心25min-35min，弃上清，沉淀即为SPA标记胶体金探针。
5.根据权利要求1或2所述的检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸，其特征在于所述纤维膜为硝酸纤维膜、醋酸纤维膜；所述金标垫的材料为玻璃纤维膜、树脂。
6.根据权利要求1或2所述的检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸，其特征在于所述可和金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体为羊、兔、豚鼠、猪、小鼠、猴IgG。
7.一种制备检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤1)制备类鼻疽菌多糖抗原；用0.01M pH7.2的磷酸缓冲液将该抗原和可与金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体分别稀释至2-4mg/ml和1-4mg/ml，然后分别喷于纤维膜上形成相互分离的检测线和质控线，37℃干燥2-4小时，然后将其粘贴在吸水纸垫上；2)制备金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针；将该探针溶于0.25％-0.4％四硼酸钠溶液中，使其终浓度为5％-10％，然后将玻璃纤维膜、树脂浸入上述探针溶液中，得到金标垫，在-20℃--50℃干燥5-8小时后，将其粘贴在步骤1)中得到的粘贴于吸水纸垫上面的喷有相互分离的检测线和质控线的纤维膜上面；3)在步骤2)中的金标垫上面再粘贴样品垫，得到检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述吸水纸垫的下面还粘贴有背板。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述类鼻疽菌多糖抗原可按下述方法制备将类鼻疽伯克霍尔德氏菌接种于4％甘油普通琼脂培养基，37℃培养24-48h，用无菌生理盐水洗下菌苔，流通蒸汽1-2h，冷却至室温后5000-8000rpm离心10-15min，上清即为类鼻疽菌多糖抗原；所述金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针，可按下述方法制备用水溶解氯金酸使其终浓度为0.01％，煮沸后每100ml氯金酸溶液进行以下操作加入1％的柠檬酸三钠水溶液1.6ml，继续煮沸10-15分钟，用纯水恢复至100ml，冷却至室温后用K2CO3调pH至6-7，搅拌加入SPA 0.7-1.0mg，10-30min后加入10％的聚乙二醇(20000)2ml，继续搅拌20-30min，9000rpm-15000rpm，离心25min-35min，弃上清，沉淀即为SPA标记胶体金探针。
10.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述纤维膜为硝酸纤维膜、醋酸纤维膜；所述金标垫的材料为玻璃纤维膜、树脂；所述可和金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体为羊、兔、豚鼠、猪、小鼠、猴IgG。
全文摘要
本发明公开了一种检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸及其制备方法。本发明所提供的检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸，包括吸水纸垫、紧密连接于所述吸水纸垫上面的纤维膜、紧密连接于所述纤维膜上面的含有金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针的金标垫和紧密连接于所述金标垫上面的样品垫；所述纤维膜载有相互分离的检测线和质控线，所述检测线为类鼻疽菌多糖抗原，所述质控线为可和金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体。实验证明本发明的检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸特异性强、敏感、简便、快速，与IHA和ELISA相比，更适合于临床、突发事件以及基层的类鼻疽病诊断。
文档编号G01N33/558GK1632584SQ20041003076
公开日2005年6月29日 申请日期2004年4月2日 优先权日2004年4月2日
发明者端青, 檀华, 何君, 朱虹 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所