专利名称：一种纳米修饰生物阵列传感器的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种新型的可同时检测葡萄糖等4种含量的纳米修饰生物阵列传感器，属于生物传感器技术和纳米生物检测技术领域。
背景技术：
世界卫生组织最新发布了权威数据全球糖尿病患者的人数已超过1.77亿，预计到2025年将达到3.7亿，排在糖尿病患病率前三位的国家分别是印度、中国和美国。触目惊心的数字表明，糖尿病已成了危害人类健康的最大凶手之一，并且有扩大化和年轻化的趋势。糖尿病患者因体内的胰岛素缺乏或有障碍，而使葡萄糖的代谢产生紊乱，同时与糖元代谢密切相关的乳酸等的含量也发生变化，谷氨酸是神经兴奋传导的重要氨基酸，而次黄嘌呤能衡量细胞损伤的程度。同时测量该4种物质的含量，可为糖尿病及其并发症患者提供疾病诊断方面较为全面的信息。
但是，目前已有的测量血液中葡萄糖、乳酸等含量的生物传感器的功能单一，即一般只测量单个指标。而且普遍存在着灵敏度不高、抗干扰性差和稳定性低及制造成本高的缺陷。例如中国专利申请“血液乳酸电化学传感器”(申请号03128815.4)是由设有血样测量工作区的基板、基板上依次覆有的工作电极和参比电极组成。基板(血样测量工作区范围内部)还覆有能够与乳酸反应，并产生电子传递的酶试剂反应膜。酶试剂反应膜含有乳酸氧化酶、电子传递体、稳定剂和能使血样快速渗透到反应膜内部与酶进行反应的亲水高分子物质。由于电子传递体采用了铁氰酸根，但铁氰酸根水溶性好，易流失，使得传感器的稳定性能受影响。从而测量结果的可信度被降低了。中国专利申请“全血葡萄糖生物传感器”(申请号03129434.0)和“全血乳酸生物传感器”(申请号03129433.2)提出了反应层由羧甲基纤维素CMC、修饰碳纳米管(作为电子第二中介体)，铁氰化钾、乳酸氧化酶或葡萄糖氧化酶(作为电子第一中介体的试剂)、稳定剂、缓冲液制备成的生物传感器，可用来测定血液中的乳酸、葡萄糖的含量。引入的电子第二中介体，碳纳米管提高了传感器的响应灵敏性，克服了铁氰酸根流失造成稳定性差的缺陷。但是由于反应层是依次叠加在设有毛细孔的腔体内，因此它们的用酶量较高，使得传感器的成本提高。
发明内容
本实用新型的目的是设计一种可用于同时检测葡萄糖、乳酸、L-谷氨酸和次黄嘌呤含量，且灵敏度高，稳定性好，所需样品量少、制作成本低廉的纳米修饰生物传感器。
为了实现上述目的，本实用新型是这样进行的传感器包括工作电极、参比电极和对电极及溶液进、出口。其特点是工作电极由聚四氟乙烯板和贯穿该板的4个碳阵列电极组成。碳阵列电极由碳电极及其底端各设有碳电极引线，顶端分别修饰有不同的四种酶试剂反应膜构成。酶试剂反应膜由核壳型的中性红掺杂的二氧化硅(NR-SiO2)纳米粒子和生物活性酶组成。生物活性酶分别是葡萄糖氧化酶(GOD)、乳酸氧化酶(LOD)、L-谷氨酸氧化酶(L-GLOD)或黄嘌呤氧化酶(XOD)。工作电极上面依次设有薄层检测池和对电极，并通过螺钉将工作电极、薄层检测池和对电极固为一体。对电极由聚四氟乙烯板和贯穿该板的不锈钢电极、对电极引线以及液体进口孔和出口孔组成。薄层检测池是一片中间挖成通孔的聚四氟乙烯膜，池底是四个修饰有酶试剂反应膜的碳阵列电极，池顶部是对电极上的不锈钢电极与两侧对称开设的液体进口孔和出口孔。液体进口孔直接与溶液进口管连接。液体出口孔通过接管与套管连接，套管内装有参比电极，套管一侧设有溶液出口管。
本实用新型具有如下优点和效果1.由于本实用新型的工作电极部分是由4个碳阵列电极构成，其各自的底端设有引线，顶端分别修饰有不同的酶试剂反应膜。酶试剂反应膜由核壳型的中性红掺杂的二氧化硅(NR-SiO2)纳米粒子和生物活性酶组成。生物活性酶分别是葡萄糖氧化酶(GOD)、乳酸氧化酶(LOD)、L-谷氨酸氧化酶(L-GLOD)和黄嘌呤氧化酶(XOD)。通过与之相连的电分析仪，可同时检测血液等溶液中葡萄糖、乳酸、L-谷氨酸和次黄嘌呤含量。
2.由于本实用新型的碳电极顶端表面修饰的酶试剂反应膜是用核壳型的NR-SiO2纳米粒子进行修饰的，其核NR具有良好的导电性，且对生物活性酶具有催化作用，其壳层SiO2具有良好的生物兼容性和生物亲和性，使其催化电流增大了3-9倍(不同生物活性酶，其催化效果的提高也不同)因此本传感器的安培响应值是无纳米修饰的传感器的3-9倍。
3.由于采用的NR-SiO2纳米粒子尺寸为20-100nm，同时，该纳米粒子的壳层SiO2具有良好的生物兼容性和生物亲和性，且呈三维网状结构，有效防止了核NR电子传递体的泄漏，显著提高了核NR电子传递体的稳定性。因此保证了本传感器的稳定性。
4.由于生物传感器采用了薄层检测池，因此检测时所需样品量少。
5.由于采用了NR-SiO2纳米粒子，因此除了灵敏度和稳定性得到提高外，其线性范围宽，可达4个数量级，最低检测线降低到了2.0×10-7mol·L1，可直接检测含微量葡萄糖、乳酸等的溶液，例如脑渗析液等。
6.由于生物传感器只需0.4个活力单位的葡萄糖氧化酶、0.2个活力单位的乳酸氧化酶、0.04个活力单位的L-谷氨酸氧化酶和0.05个活力单位的次黄嘌呤氧化酶。而通常，如专利申请号03129433.2和03129434.0乳酸和葡萄糖传感器需1-2个活力单位的生物活性酶。因此制造成本低廉。
图1为本实用新型的生物传感器的剖视图；图2为本实用新型的生物传感器的对电极的俯视图；图3为本实用新型的生物传感器的薄层检测池的俯视图；图4为本实用新型的生物传感器的工作电极的俯视图；图标说明固定圈1、溶液出口管2、参比电极3、对电极引线4、溶液进口管5、溶液进口孔6、对电极7、薄层检测池8、工作电极9、碳电极引线10、螺钉11、定位孔12、溶液出口孔13、接管14、套管15、不锈钢电极16、聚四氟乙烯板17、通孔18、聚四氟乙烯膜19、4个碳阵列电极20。
具体实施方式
请参阅附图1、2、3、4。传感器包括工作电极9、对电极7和参比电极3及溶液进、出口管5和2构成。参比电极3为饱和甘汞电极。其特点是，工作电极9由聚四氟乙烯板(又称绝缘性Teflon基材)17和贯穿该板17的4个碳阵列电极20组成，碳阵列电极20由碳电极及其底端各设有的碳电极引线10、顶端修饰的不同的酶试剂反应膜组成。酶试剂反应膜由核壳型中性红掺杂的二氧化硅纳米粒子和4种生物活性酶中的一种组成。4种生物活性酶分别是葡萄糖氧化酶(GOD，from Aspergillus niger，EC 1.1.3.4.150 000units/g)、乳酸氧化酶(LOD，from Pediococcus species，37U/mg)、L-谷氨酸氧化酶(L-GLOD，EC 1.4.3.11，from Streptomyces sp.，10.8U/mg)或黄嘌呤氧化酶(XOD，EC1.1.3.22，Grade I from Buttermilk，1U(mg Protein)-1，34.7mg Protein mL-1)。这些酶均可市售购得。酶试剂反应膜表面上可再涂敷一层1％的Nafion甲醇溶液，形成一层抗阴离子干扰的Nafion膜，可进一步增强本传感器的抗干扰性能。工作电极9上面依次设有薄层检测池8和对电极7，各自的厚度分别为12mm、0.15mm和12mm，并且四周均开有4个定位孔12，通过螺钉11穿入定位孔12将工作电极9、薄层检测池8和对电极7三者固为一体。对电极7由聚四氟乙烯板17和贯穿该板17的不锈钢电极16、以及与不锈钢电极16固接的对电极引线4组成。薄层检测池8是一片中间挖成直径为8mm的通孔18的聚四氟乙烯膜19，池底是修饰有酶试剂反应膜的四个碳阵列电极20，池顶部是对电极7上的不锈钢电极16与两侧对称开设的液体进口孔6和出口孔13，由此形成体积为9.66μL薄层检测池8。通过固接在对电极7上的螺母将溶液进口管5直接与液体进口孔6连接。液体出口孔13通过接管14与套管15螺纹连接。套管15内装有参比电极3，并用参比电极固定圈1将其固定在套管15内。套管15一侧设有溶液出口管2。
检测样品时，可通过微管道与传感器外部的流动注射仪的微进样器连接。打开溶液进、出口管5和2，则待测液体是流动相，若关闭溶液进、出口管5、2，待测液体是非流动相的。启动与工作电极9、对电极7和参比电极1连接的电分析仪，可检测到血液或脑渗析液或其他溶液中的葡萄糖或乳酸或L-谷氨酸或次黄嘌呤的浓度变化的安培信号，按照相应的工作曲线，就能得到其含量。
权利要求1.一种纳米修饰生物阵列传感器，包括工作电极(9)、对电极(7)和参比电极(3)及溶液进口管(5)和出口管(2)，其特征在于工作电极(9)由聚四氟乙烯板(17)和贯穿板(17)的四个碳阵列电极(20)组成，碳阵列电极(20)底端设有各自的引线(10)，顶端修饰有酶试剂反应膜，酶试剂反应膜由核壳型中性红掺杂的二氧化硅纳米粒子和葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、L-谷氨酸氧化酶或黄嘌呤氧化酶四种生物活性酶组成；工作电极(9)上面依次设有薄层检测池(8)和对电极(7)，并通过螺钉(11)将工作电极(9)、薄层检测池(8)和对电极(7)固为一体；对电极(7)由聚四氟乙烯板(17)和贯穿该板(17)的不锈钢电极(16)、对电极引线(4)以及液体进口孔(6)和出口孔(13)组成；薄层检测池(8)是一片中间挖成通孔(18)的聚四氟乙烯膜(19)，池底是四个修饰有不同酶试剂反应膜的碳阵列电极(20)，池顶部是对电极(7)上的不锈钢电极(16)与两侧对称开设的液体进口孔(6)和出口孔(13)；液体进口孔(6)直接与溶液进口管(5)连接；液体出口孔(13)通过接管(14)与套管(15)连接，套管(15)内装有参比电极(3)，套管(15)一侧设有溶液出口管(2)。
专利摘要一种纳米修饰生物阵列传感器，涉及一种可同时检测葡萄糖等4种含量的纳米生物传感器。其特点是工作电极(9)由四个碳阵列电极(20)上修饰核壳型NR－SiO
文档编号G01N27/327GK2715150SQ20042003731
公开日2005年8月3日 申请日期2004年7月8日 优先权日2004年7月8日
发明者金利通, 张芬芬, 万巧, 王晓丽, 李陈鑫, 朱自强, 鲜跃仲, 张文 申请人:华东师范大学