基于相移干涉测量法的光纤分析装置的制作方法

专利名称：基于相移干涉测量法的光纤分析装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测在一试样中一个或多个分析物的存在、数量或结合速率的装置及方法，且具体而言涉及基于光纤干涉测量法的装置及方法。
背景技术：
基于一分析物-抗-分析物结合对的成员之间的结合事件的诊断性测试已广泛用于医疗、兽医、农业及研究应用中。通常，此类方法被用来检测一试样中的分析物的存在或数量、及/或此分析物与此抗-分析物的结合速率。典型的分析物-抗-分析物对包括互补核酸链、抗原-抗体对、及受体-受体结合剂的，其中分析物可为所述对中的任一成员，且抗分析物分子是其对立成员。
此类型的诊断方法通常采用一具有试样分析物分子将与其特异性结合的固定抗分析物分子并在一界定的检测区上具有高亲和性的固体表面。在称作固相分析的此类分析中，在促使分析物结合至固定抗-分析物分子的条件下，固体表面暴露于试样。可直接通过(例如)质量、反射率、厚度、颜色或其他可指示一结合事件的特征来检测结合事件。在(例如)使用发色团、或荧光或放射性标记来预标记分析物位置时，可根据在检测区上可检测标记的存在及/或数量来检测结合事件。或者，可在分析物在所述检测区上结合后，用(例如)一辅助、荧光标记的抗-分析物抗体来标记此分析物。
共同拥有的第5,804,453号(′453专利)美国专利公开一种设计用以检测结合至一光纤端面的分析物的光纤干涉仪分析装置，此美国专利以引用方式并入本文中。分析物检测是基于一因分析物分子至表面的结合而引起的光纤端面的厚度变化，分析物数量越多，所产生的与厚度相关的干涉信号变化就越大。如在′453专利的图7a及7b中所具体说明，干涉信号变化是由自光纤的端部所反射的光与自置于此光纤端部的结合层所反射的光之间的相位移而引起。此装置易于操作并为分析物检测提供一种快速分析方法。
理论上，干涉仪分析装置将产生可易于观察的光谱峰及谷(极值)位置变化，所述位置变化处于传统可见光分光计的范围内(更确切地说，介于约450-700nm之间的可见光范围内)，以致光纤端部上相对小的光学厚度变化均可作为干涉波长峰及谷的光谱位置的显著变化来检测。用′453专利中所述装置观察的一个限制是在此光谱范围内没有易于识别的波长光谱极值。
设计本发明以克服此限制、保留前面所公开装置的速率及简单性的优点，但显著提高灵敏度及精确度。本发明还提供一种更方便的可置换头形式、以及一种用於(例如)基因芯片及蛋白质芯片应用的多分析物阵列形式。

发明内容
本发明一方面包括一种用于检测一试样中分析物的装置，其包括检测分析物的存在、分析物的数量或分析物与分析物结合分子的缔合及/或离解速率。此装置包括一光学元件，此光学元件具有相隔至少50nm的一个近端反射表面和一个远端反射表面。来自一光纤的光束射至这两个反射表面并从这两个反射表面反射。所反射的光束耦合返回至此光纤并相互干涉。此光学元件还包括一个经定位的分析物结合分子层，以便所反射光束之间的干涉随着分析物结合至所述分析物结合分子层而变化。
干涉变化可由不同的物理现象而引起。例如，分析物结合可引起这两个反射表面之间的光学路径长度或物理距离的改变。或者，分析物结合可引起该等反射表面之间的材料的光学吸收或反射率改变。分析物结合还可引起分析物结合分子层膨胀，从而导致干涉改变。
在一具体设计中，远端反射表面包括分析物结合分子层。例如，当分析物结合至分析物结合分子层时，这两个反射表面之间的光路径长度或物理距离可能增加。在本发明另一方面中，一种透明固体材料位于反射表面之间且，视需要，近端反射表面包括一具有大于此透明固体材料的反射率的材料。或者，一空气隙可位于反射表面之间。在另一设计中，此远端反射表面位于近端反射表面与分析物结合分子层之间。例如，分析物结合可使分析物结合分子层膨胀，使远端反射表面移动靠近近端反射表面。在又一设计中，分析物结合分子层位于这两个反射表面之间。分析物结合可使此层膨胀或改变其反射率，进而改变两个反射光束之间的干涉。
在另一方面中，此装置包括一光学组件，其具有相隔50nm以上的距离“d”的第一及第二反射表面。此光学组件由一个透明光学元件组成，此光学元件可具有一界定于此元件的近端与远端面之间的至少50nm、较佳介于400至1,000nm之间的厚度。第一反射表面置于光学元件的远端面上，且由一分析物-结合分子层形成。第二反射表面由一种折射率大于此光学元件折射率的透明材料涂层形成。此涂层可由一较佳厚度介于5与50nm之间的Ta2O5层形成。光学元件可为SiO2，并具有且介于约100至5,000nm之间、较佳400至1,000nm的厚度。
还包括一光源，其用于将一光束射到所述第一及第二反射表面上；及一检测器单元，当此组件被置于分析物溶液中时，其运行以检测一因分析物结合至分析物结合分子而引起的第一反射层的光学厚度变化。第一反射层光学厚度变化与由自所述第一及第二表面反射的两个光波所形成的干涉波的相位特性位移有关。所述相位特性可为干涉波的一个或多个峰及谷的光谱位置的位移，或是此波整个循环周期的变化。
光源可包括一个其远端适于毗邻此组件中的第二反射表面放置的光纤，且此装置进一步包括一个用于将反射光波自组件反射至检测器的光耦合器。
在第一实施例中，此光学组件固定安装于所述光纤上，同时光纤的远端与第二反射表面接触。在第二实施例中，此光学组件进一步包括一第二透明光学元件，其具有小于第二涂层的折射率及大于约100nm的厚度，其中此高折射率材料的涂层夹于这两个透明光学元件之间。在后一实施例中，此组件是以可移动方式附接至光纤的远端区域，光纤的远端与组件中第二透明光学元件的相对面之间具有一小于100nm或大于2μm的间隔。
为了检测多种分析物(例如多种核酸物质)，分析物结合分子层可由诸如单链核酸等离散分析物结合区域阵列组成。该等区域可有效地结合不同的分析物。此光纤包括复数根单独的光纤，每一光纤与该等区域中之一对准，此检测器包括复数个检测区，且光耦合用于将复数根光纤中每一根与此区域中的每一个耦合在一起。
此组件中的分析物结合分子可为(例如)(i)抵抗物质(anti-species)抗体分子，其用于筛选杂种细胞库以寻找隐藏抗体的存在、(ii)抗原分子，其用于检测特异性针对此抗原的抗体的存在；(iii)蛋白质分子，其用于检测此蛋白质的结合伙伴的存在；(iv)蛋白质分子，其用于检测能够与此蛋白质形成多蛋白质络合物的多种结合物质的存在；或(v)单链核酸分子，其用于检测核酸结合分子的存在。
此检测器可为用于测量所选波长范围内的反射光强度的分光计。或者除其外，此光源可包括复数个发光二极管，每一发光二极管均具有一特性光谱频率，且此检测器用于记录不同LED频率中每一频率下的反射光的光强度。在再一实施例中，此光源包括一个白光源且此检测器经设计以记录复数个不同波长中每一波长下的反射光的光强度。
另一方面，本发明包括一种用于检测一试样溶液中分析物的存在或数量的方法。此方法包括使此试样溶液与第一反射表面反应，此第一反射表面由置于透明光学元件的远端表面上厚度至少50nm的分析物结合分子层所形成，从而通过分析物与此层中的分析物结合分子的结合来增加第一反射层的厚度。通过检测干涉波的相位特性位移来测量第一反射层的厚度变化，此干涉波是由自第一层及自第二反射层所反射的两个光波形成，此第二反射层形成于此光学元件的对置近端表面上且其具有较光学元件大的折射率。
检测步骤可包括将来自光纤的光引导至这两个反射表面上并通过光耦合将来自这两个表面的反射光射到检测器上。此检测器可为一分光计，其中检测包括测量由这两个反射光波所产生的一个或多个干涉极值的光谱位置位移。
若此方法用于测量分析物至第二层的缔合速率，则可实施此反应步骤直至观察到第一反射层厚度增加接近最大值为止。若此方法用于测量分析物与第二层的离解速率，则反应步骤可包括将第二层浸于一离解缓冲液中一段时间直到观察到第一反射层厚度降低为止。若此方法用于测量试样中存在的分析物的数量，则将此检测实施足以测量复数个不同时间点上第一反射层厚度的时期。
若此方法用于测量试样中复数个分析物中的一个或多个，则第一反射层由一离散分析物结合区域阵列组成，不同区域可有效地结合不同分析物，且此测量有效地检测因分析物与分析物结合分子的结合而引起的该等区域中每一区域的厚度变化。
结合附图，通过阅读下文对本发明的详细说明，本发明的这些及其他目的及特征将更加一目了然。


参照下文说明及附图，将更好地了解本发明的这些及其他特征、方面及优点，其中图1显示生物探针及其装置的基本系统设置；图2显示一根据本发明一实施例形成的光学组件；图3A及3B显示沿7个峰谷次序(3A)及处于此光谱可见部分(3B)的一干涉波的一部分；图4显示一根据本发明的另一实施例构造的光学组件；图5显示一具有分析物结合阵列并根据本发明的另一实施例构造的一次性多分析物光学组件；图6显示三种分子的顺序结合；图7显示因抗体的缔合及离解而产生的缔合及离解曲线；图8显示两种不同浓度的抗体结合至其抗原的曲线；图9显示通过形成酰胺键来特异性固定双胺基PEG(MW3300)。PEG(MW8000)用作一阴性对照以监视PEG聚合物的非特异性结合；及图10显示与大分子结合的小分子的阴性对照及基线测量。
具体实施例方式
定义除因下文另有明确定义外，本权利要求书及说明书中所使用的术语均应视为所属领域的技术人员所理解的其常用含义。本权利要求书及说明书中所述的数值范围应视为包括界定所述范围的极值。
术语“活体内”是指在活生物体中发生的过程。
“分析物结合”分子是指任一能够参与与分析物分子的特异性结合反应的分子。实例包括(但不限于)例如抗体-抗原结合反应及核酸杂交反应。
“特异性结合反应”是指可饱和、通常可逆且可与该等反应物中过量的一种竞争的结合反应。特异性结合反应由此特异性结合反应中参与者之间的形状、电荷及其他结合决定因素的互补性表征。
“抗体”是指通过任一所属领域已知或后来开发的方法制备的具有两个重链及两个轻链的免疫球蛋白分子并包括例如通过给诸如山羊、小鼠、兔子等哺乳动物注射免疫原所产生的多克隆抗体、以及通过使用习知Kohler Milstein杂种细胞融合技术所产生的单克隆抗体。此术语包括使用基因工程方法所产生的抗体(例如那些使用(例如)经人类免疫球蛋白基因重组的SCID小鼠所制造者)、以及已使用所属领域已知的表面置换技术人源化的抗体。
“抗体片段”是指通过化学裂解或基因工程技术所产生的抗体分子的片段，也指诸如那些使用组合基因库及抗菌体展显技术所产生者等单链可变片段(SCRVS)。根据本发明所使用的抗体片段通常保留结合其同源抗原的能力且因此包括可变序列及抗原结合部位。
“小分子”是指具有小于约500道尔顿的分子量的有机化合物。小分子是有用的起始筛选材料，其可确定药物先导化合物进而可通过传统药物化学、结构活性关系研究加以优化以生成新的药物。小分子药物化合物具有通常可口服生物利用的优点。小分子的实例包括下列数据库中所列举的化合物MDL/ACD(http//www.mdli.com/)、MDL/MDDR(http//www.mdli.com/)、SPECS(http//www.specs.net/)、中国天然产物数据库(CNPD)(http//www.neotrident.com/)、及国家药品筛选中心化合物试样数据库(http//www.screen.org.cn/)。本申请案中所用的缩略语包括如下“ss”是指单链；“SNP”是指单核苷酸多态性；“PBS”是指磷酸盐缓冲溶液(0.01M磷酸盐缓冲液、0.0027M氧化钾及0.137M氧化钠，pH7.4)；“NHS”是指N-羟基琥珀酰亚胺；“MW”是指分子量；“Sulfo-SMCC”是指羧酸4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-磺基琥珀酰亚胺基酯。必须注意，如在本说明书及随附权利要求书中所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一”、及“该”包括复数个对象。
优点及效用参照下文更详细阐述的图式及实施例来说明本发明的优点及效用。这些包括无需使用标记即可实时监视分析物结合反应的能力，从而降低成本及可能的毒性。另一优点包括使用可见波长光源来实施此方法的能力。检测器尖端的光纤性质可提供其它优点，此尖端允许在极小的试样体积(包括“体外”空间)中监视结合反应并使光纤束可一起对结合反应进行高度复杂的分析。
图1以示意图显示一根据本发明构造的干涉测量装置20。在采用最基本元件时，此装置包括光源22、光学组件26及检测器单元28，光学组件26起传感元件或检测器尖端的作用且下文将参照图2、4及5进一步详述，检测器单元28用于检测由自光学组件26反射的干涉光波所产生的干涉信号。
将来自源22的光射至光学组件26上，并通过一由虚线30处所指示的光耦合组件反射回至此检测器。在一较佳实施例中，此耦合组件包括自光源延伸至光学组件的第一光学导管或光纤32、一将来自光学组件的反射光载至检测器的第二光学导管或光纤34及一以光学方式耦合光纤32、34的光学耦合器。适合的光纤及耦合部件详述于上文所引用的′453专利中。一种实例性耦合器可自包括Ocean Optics(Dunedin，Florida)在内的许多卖主购得者。
或者，此耦合组件可包括一透镜系统，其经构造用以使一光束在光学组件的上表面上聚焦并将来自光学组件的反射干涉光引导至检测器。后一系统不需要光纤，但此将对用于光耦合的透镜元件的定位提出相对严格的要求。
装置中的光源可为诸如发光二极管(LED)等白光源，其在(例如)400nm或以下至700nm或以上、通常在至少100nm的光谱范围内的宽光谱上产生光。或者，此光源可为各自具有不同特征波长的复数个源，例如设计用于在可见光范围内以不同的选定波长发射光的LED。相同的功能可借助具有适当滤波器的单个光源(例如白光源)将不同选定波长的光射至光学组件上来实现。
此检测器较佳为分光计，例如能够记录来自光学组件的反射干涉光光谱的电荷耦合器件(CCD)。或者，当光源运行以将不同的选定波长射至光学组件上时，检测器可为一用于记录各不同辐照波长处光强度的简单的光检测器。在再一实施例中，检测器可包括复数个滤波器，此允许在干涉反射波的复数个所选波长中每一波长处检测来自(例如)白光源的光强度。实例性光源及检测器构造阐述于上述′453专利中，尤其参照所述专利的图8及10，且应了解这些构造亦适用于本发明。
图2显示根据本发明一实施例构造的光学组件26及此光学组件固定附接至其的光纤32的远端区域毗连部分。如所看到的，组件26包括一透明光学元件38，光学元件38具有分别于其下(远端)及上(近端)端面上形成的第一及第二反射表面42、44。根据本发明的一重要特征，光学元件其远端与近端表面之间(即介于这两个反射表面之间)的厚度“d”至少为50nm，且较佳至少为100nm。一实例性厚度介于约100至5,000nm之间，较佳为400至1,000nm。第一反射表面42由有效地特异性结合分析物分子46且具有高亲和性的分析物结合分子(例如分子44)的层形成。换言之，分析物及抗分析物分子是上述类型结合对的对立成员，其可包括(但不限于)抗原-抗体对、互补核酸及受体-结合剂对。
此光学元件的折射率较佳类似于第一反射表面的折射率，以便来自光学组件下远端的反射主要发生自由分析物结合分子所形成的层而非自光学元件与分析物结合分子之间的界面。同样，当分析物分子结合至光学组件的下层时，自组件下端反射的光主要出现于由分析物结合分子及所结合的分析物所形成的层而非出现于此界面区域。一种形成光学元件的实例性材料为SiO2，例如具有约1.4至1.5折射率的高质量玻璃。光学元件也可由透明聚合物形成，例如具有较佳在1.3至1.8范围内折射率的聚苯乙烯或聚乙烯。
形成光学组件中的第二反射表面作为具有一大致较光学元件为高的折射率的透明材料层，因此此层可用于反射一部分射至光学组件的光。较佳地，第二层具有大于1.8的折射率。一种用于第二层的实例性材料为反射率等于2.1的Ta2O5。此层通常通过一传统的蒸汽沉积涂布或分层工艺在光学元件上形成厚度小于50nm、通常介于5与30nm之间的层。
第一(分析物结合)层的厚度经设计以根据具体硬件及光学部件最优化整体灵敏度。使用传统固定化学物质来以化学方式(例如以共价方式)将分析物结合分子层连接至光学元件的下表面。例如，多种双官能团试剂，其包含一个用于化学连接至SiO2的硅氧烷基团及一个用于连接诸如蛋白质(例如抗原，抗体)或核酸的生物分子的羟基、胺、羧基或其他反应基团。亦习知蚀刻或以其他方式处理一玻璃表面以增加可结合分析物结合分子的羟基的密度。当此光学元件是由一种诸如聚苯乙烯等聚合物形成时，则可使用多种方法用于暴露诸如胺、羟基及羧基等可用化学活性表面基团。
分析物结合层较佳于以下条件下形成其中光学元件的远端表面经致密涂布的，因此分析物分子与此层的结合迫使此层厚度改变，而不是填充于此层中。此分析物结合层可为一单层或多层基质。
通过来自光学组件中两个反射表面的反射光束的干涉可测量光学组件上分析物的存在、浓度及/或结合速率。具体而言，当分析物分子连接至此表面或自其离解时，第一反射层的平均厚度相应变化。由于所有其他层的厚度保持不变，故由反射自这两个表面的光波所形成的干涉波随此厚度变化而相位移。
假定有两个反射光束自第一表面反射的第一光束，其为分析物结合分子及所结合分析物与周围介质之间的远端界面；及自第二表面反射的第二光束，其是光学元件(第一层)与高折射率层(第二层)之间的近端界面。取决于总波长的干涉波强度为I=I1+I2+2I1I2cos(2πΔλ)]]>其中I为强度，I1及I2为两个干涉光束的强度，Δ为光程差，且λ为波长。
当(2πΔ/λ)＝Nπ时，若N为一整数0、1、2、...，则曲线在其峰或谷处。
第一层的厚度d＝Δ/2n。因此，在峰或谷(极值)处λ＝4nd/N。
对于N的最初几个值(即，0，1，2，....7)而言，且假定d为700nm，则方程式为
N＝0λ＝∞(谷)N＝1λ＝4nd＝4,496.80nm(峰)N＝2λ＝2nd＝2,248.40nm(谷)N＝3λ＝4nd/3＝1,498.9nm(峰)N＝4λ＝nd＝1,124.20nm(谷)N＝5λ＝4nd/5＝899.36nm(峰)N＝6λ＝2nd/3＝749.47nm(谷)N＝7λ＝4nd/7＝642nm(峰)N＝8λ＝nd/2＝562nm(谷)N＝9λ＝4nd/9＝499.64nm(峰)N＝10λ＝4nd/10＝449.6nm(谷)由此可见，并且在图3A和3B中所进一步说明，在可见光谱范围内出现至少三个峰/谷(N＝7-9)。
若使用第7次谷来计算分子层厚度变化，则当连接至第一层的分子层从0nm增加至10nm时，第7次谷将位移至650.74nm。因此，第7次谷的实际相位移与厚度变化之间的比率等于(650.74-642.40)/10＝0.834。
相反，若这两个反射层之间的初始间距完全由光纤端部上的分析物结合分子构成，假定此层厚度为25nm，则第一次峰将出现于146nm处，显然在可见光谱范围之外，因此器件将只看到0次谷与第一次峰间区域的一部分，但将看不到任何峰，因而难以精确测量干涉波的光谱特征位移。
直到反射层的总厚度接近约100nm才会在可见光谱中出现第一次峰。假定总厚度变化高达50nm，光学元件的厚度才可小到50nm，但较佳为约数百纳米，以便可容易地通过更多次峰或谷(例如其中N＝3-10)的光谱位置移动来测量干涉波的周期性相移或变化。
人们认为实际厚度与所测量相移之间的比例是测量灵敏度的关键因素。可以理解为何可调整光学元件的厚度及其折射率来提高并优化灵敏度以适应电子及光学设计。
图4显示在分析装置中以可移动方式置于光纤52远端的光学组件50。如图所示，此光学元件包括复数个诸如臂54等挠性夹紧臂，该等夹紧臂设计成于光纤端部滑动并通过光纤上的一环形缘或制动器56与形成于臂中的互补形凹槽的咬合来夹紧光纤。此附件用来将光学组件定位于光纤上以在光纤的远端与组件的相对(上)面之间形成小于100nm或大于2μm的空气隙。若空气隙大于约100nm但小于2μm，则来自光学组件上表面的内部反射可显著促成对检测精度造成不利影响的不期望干扰。
继续参见图4，此光学组件包括一类似于上述光学元件38的第一光学元件60，其具有分别对应于上述反射层40、42的分别为第一及第二反射层62、64。此组件进一步包括第二光学元件66，第二光学元件66的厚度较佳大于100nm、通常至少200nm且其折射率类似于第一光学元件60的折射率。较佳地，这两个光学元件均由相同的玻璃或具有介于1.4与1.6之间的折射率的聚合材料构成。由高折射率材料形成且具有较佳小于约30nm厚度的层64如图所示夹于2个光学元件之间。
运行时，将此光学组件放置于远端光纤端部上并在此光纤上卡入到位。然后，在有利于试样分析物与形成反射层62的分析物结合分子结合的条件下，将此组件的下表面暴露于一分析物试样。随着分析物分子与此层结合，此层的厚度增加，从而反射表面62与64之间的距离“d”增加。如上文参照图3A及3B所述，此产生由自这两层的反射所产生的干涉波的极值位移。此极值或波长、或波长周期的改变进而用来确定下(最远端)反射层上的厚度变化。用完后，可去除并丢弃此光学组件，且替换为未使用过的元件用于新的分析(对相同或不同分析物进行分析)。
图5绘示了本发明一实施例中的光学组件及光纤束，其经设计用于检测一试样中复数个分析物(例如不同序列的核酸分析物)中的一个或多个。光纤束72由例如光纤74等各光纤的阵列(例如环形阵列)组成。光学组件(通常以70来指示)由上文参照图4所述但呈阵列形式的基本光学元件组成。具体而言，此元件中的第一光学元件80在其下远端表面提供一诸如区域84等分析物反应区域阵列，每一阵列均包含有效结合至试样中不同分析物中之一的分析物结合分子层。每一区域均在此光学组件中形成第一反射层。一较佳感测可提供不同序列的核酸(例如cDNA或寡核苷酸)阵列，其经设计以特定与一试样中不同序列核酸分析物质杂交。换言之，此阵列表面形成一用于检测复数个不同基因序列中每一序列的“基因芯片”。
此光学组件中还包括一第二光学元件78及一夹于这两个光学元件之间并在光学组件中提供第二反射表面的高折射率材料层79。此组件通过一对诸如臂76等挠性支撑臂与光纤束上的环形缘或制动器86之间的咬合置于光纤束72上。由于组件放置于光纤束上，光纤的下远端与光学元件78的对面由空气隙85隔开，空气隙85的间距较佳小于100nm或大于2μm。此外，光纤中的每一根均与光学组件的对应分析区域对准，以便每一光纤均将光射到其对准的检测区域上，并接收来自此区域的反射光。同样，此装置中用来将多根光纤耦合至检测器的光耦合器保持阵列区域与光学检测器(例如二维CCD)上的相应位置之间的对准。各种光学组件部件的材料及厚度尺寸均类似于彼等上文参照图4所阐述者。
更特定而言，本发明中所述的装置可用于下列应用(i)用携带于尖端上的抵抗物质抗体来筛选杂交瘤表达系以获得具有高抗体表达的细胞系；(ii)用携带于尖端上的抗原来定性对此抗原具有高亲和性的抗体；(iii)用携带于尖端上的蛋白质来鉴别并定性此蛋白质的结合伙伴(DNA、RNA、蛋白质、碳水化合物、有机分子)；(iv)用携带于尖端上的碳水化合物或糖基部分来鉴别并定性此碳水化合物的结合伙伴(例如DNA、RNA、蛋白质、碳水化合物、有机分子)；(v)用携带于尖端上认为参与多蛋白质络合物的蛋白质来定性结合组份及/或络合物形成动力学；(vi)用携带于尖端上的小蛋白结合分子来鉴别并定性此分子的蛋白质结合剂；(vii)用携带于尖端上的抗体、使用一组标准分析物来绘制此分析物的校准曲线。使用此校准曲线，人们可由此确定未知溶液(细胞培养上清液、生物试样、处理混合物等)中的分析物浓度。
(viii)用携带于尖端上的单链核酸(例如ssDNA或RNA)来鉴别与此核酸特异性结合的分子。
使用一温度控制块，此装置及方法还可用于监控经固定ssDNA至溶液中寡核苷酸的结合并对此结合进行表征以实施SNP分析。
下列实施例说明本发明的各种方法及应用，但决非意欲限制本发明范围。
实例以下是用于实施本发明特定实施例的实例。所给出的这些实例仅用于说明目的，而不欲以任何形式限制本发明的范围。尽管力求使所用变量(例如数量、温度等)达到精确，但当然应允许某些实验误差及偏差。除非另有说明，否则应使用此技术内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术及药理学的常用方法来实践本发明。该等技术已详细阐述于文献中。参见(例如)T.E.Creighton的ProteinsStructures and MolecularProperties(W.H.Freeman and Company，1993)；A.L.Lehninger的Biochemistry(WorthPublishers有限公司，当前增补版)；Sambrook等人的Molecular CloningA LaboratoryManual(第2版，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick与N.Kaplan编辑，AcademicPress有限公司)；Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(Easton，PennsylvaniaMackPublishing公司，1990)；Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)A和B卷(1992)。
实例1小分子-蛋白质结合反应。
本实例用来验证检测蛋白质结合至固定于传感器尖端的小分子并随后结合至多个抗体的能力。此测试使用光纤尖端的双层结构。第一Ta2O5层的厚度为25nm且第二SiO2层的厚度为770nm。光纤是自Ocean Optics(Dunedin，Florida)购得者。人工将其切成40mm长的段。该等段的两端均抛光为标准镜面品质。此处所用的抛光方法与那些用於光学透镜及反射镜的方法完全相同。将该等光纤段的一个表面供给光学涂层室以涂布Ta2O5层及SiO2层。此供应者使用由Leybold制造的离子束辅助物理气相沉积(IAPVD)涂布机。IAPVD是通常用于抗反射及滤光器的涂布技术。该等实验步骤包括于下文中(除非另有说明，否则所有步骤均在室温下实施)用经生物素衍生出的聚合物单层涂布光纤尖端。使用生物素化的脂质(常用)制备聚合物单层。使用此脂质在水溶液表面形成一脂质单层。使用UV光使此单层交联15分钟。然后使干净干燥的光纤接触此浮动薄膜并将生物素聚合物吸收于此光纤尖端。然后将该等光纤于60℃下干燥1小时。然后在环境条件下存储此光纤。
将此生物传感器尖端浸于50μg/ml于PBS(Invitrogen，Carlsbad，CA；目录编号14190078)中的抗生蛋白链菌素(PierceBiotechnology，Rockford IL，目录编号21122)中9分钟并然后用PBS简单冲洗。
将同样的尖端浸于10μg/ml于PBS中的兔子-抗-抗生蛋白链菌素溶液(AbCam，Cambridge，MA；目录编号ab6676-1000)中36分钟并然后用PBS简单洗涤。
最后，将此尖端浸于50μg/mL于PBS中的驴-抗-兔子抗体溶液(JacksonImmunoResearch，West Grove，PA；目录编号711-005-152)中25分钟。最后在PBS溶液中冲洗10分钟。
图6展示此顺序结合实验的实时响应曲线。纵轴是以纳米表示的7次谷相移。其清楚的展示抗生蛋白链菌素至生物素的结合先固定于尖端，且随后是抗抗生蛋白链菌素抗体至抗生蛋白链菌素及第二抗体至此第一抗体之结合。在900秒时可看出抗生蛋白链菌素层自此尖端离解(光学厚度小的减少)。
实例2生物分子相互作用动力学及亲和性的生物分子相互作用分析。
本实例阐述本发明实施生物分子相互作用分析(BIA)用于测定生物分子相互作用的动力学及亲和性。使用实例1中所述相同的尖端构造。此实验步骤包括以下(除非另有说明，否则所用步骤均在室温下实施)使用以下程序制备巯基硅烷涂布的尖端。将干净干燥的光纤在甲苯∶己酸∶巯基丙基三氧基硅烷(10∶2∶1体积比)中于室温下培育24小时。将该等光纤用10ml甲苯冲洗2次，每次冲洗5分钟。然后该等光纤用10mL乙醇冲洗1次并于氩气流下干燥且于环境条件下存储。
首先通过用10μg/ml兔子-IgG于PBS中的溶液(Jackson ImmunoResearch，WestGrove，PA；目录编号309-005-003)浸渍1小时获得生物传感器尖端。
将此经涂布的尖端浸于10μg/ml山羊-抗-兔子抗体(Jackson ImmunoResearch，WestGrove，PA；目录编号111-005-003)于PBS中的溶液并在其中保持15分钟。
取出此尖端并在PBS中洗涤。为促使此第二抗体自此第一抗体离解，手动摇晃此PBS 20分钟。
然后，将此尖端再次浸于相同的山羊-抗-兔子溶液中以展示山羊-抗-兔子至兔子-IgG的可重现缔合。
图7展示由兔子-IgG和山羊-抗-兔子的缔合与离解所产生的缔合和离解曲线。再次，纵轴是第7次谷相移。此相移以0.834的比例与平均厚度正相关。能否可靠地检测缔合和离解曲线对测定相互作用动力学及亲和性是十分重要的。
实例3由抗体-抗原结合和释放曲线计算亲和常数。
本实验示范通过测量两种抗体与其抗原的缔合和离解曲线来计算亲和常数。将该等专属抗体标记为Ab-1和Ab-2。此抗原的分子量为约30千道尔顿。使用与实例1中相同的尖端构造。使用与实例2中相同的巯基硅烷光纤制备物。该等实验步骤如下所述(除非另有说明，否则所用步骤均于室温下实施)活化此光纤尖端以用于所述抗原的共价连接。巯基硅烷涂布的光纤通过将传感器尖端浸于50μL的50mg/mL sulfo-SMCC(Pierce Biotechnology，Rockford EL；目录编号22322)于DMF(Sigma-Aldrich Chemical Company，St Louis，MO；目录编号494488)中的溶液中2小时来活化。将此传感器尖端在DMF中简单冲洗并干燥。
通过将此经活化尖端在20μg/ml的抗原的PBS溶液中浸渍20分钟使此抗原以共价方式结合至此经活化的光纤尖端。此尖端用PBS冲洗2分钟。PBS冲洗后，此尖端用100μM乙醇胺pH 8.5(Sigma-Aldrich Chemical Company，St Louis，MO；目录编号E9508)的水溶液骤冷5分钟并随后在PBS中再冲洗2分钟。
将此同一尖端浸于用于缔合实验的抗体中并记录9至15分钟的实时结合数据(根据抗体性质和浓度而定)。一旦记录完该等数据，将此尖端再次浸于PBS中并搅拌以测量9至15分钟的离开曲线(off curve)(即，固定抗原与所结合抗体之间的离解)。使用不同浓度的抗体(25nM、150nM和430nM)并用两种标记为Ab-1和Ab-2的不同抗体重复此结合(缔合曲线)与离解(离解曲线)测量。
图8展示不同浓度下的缔合和离解曲线。由于在25nM的浓度下缔合极慢，因此没有完成此浓度的Ab-2测试。所示的该等曲线是原始数据图。
通过用一阶指数函数拟合原始数据自该等曲线获得Kon、Koff及KD。通过将两组数据平均，获得如下动力学及亲和性系数

实例4NHS-酯活化的尖端。
采用实例1中所述的相同尖端构造。采用实例2中所述相同的巯基硅烷光纤制备物。通过将传感器尖端浸于50uL50mg/mL sulfo-SMCC(Pierce Biotechnology，RockfordEL；目录编号22322)于DMF(Sigma-Aldrich Chemical Company，St Louis，MO；目录编号494488)中的溶液中2小时来活化巯基硅烷涂布的光纤。在DMF中简单冲洗此传感器尖端并干燥。
含胺的分子可通过形成稳定的酰胺键合以共价方式结合至此表面。不含游离胺的分子不能通过NHS部分固定，但该等分子通过非特异性结合仍可结合于此表面。此非特异性结合可为多层而在单层中应通过NHS酯的有效性及可达性来控制通过NHS酯的共价固定。
在此组实验中，使用双胺基PEG(MW 3300)(Shearwater Polymers，San Carlos，CA)作为测试化合物以共价方式结合至活化表面。不包含游离胺基的PEG(MW8000)(Sigma-Aldrich Chemical Company，St Louis，MO；目录编号04162)作为阴性对照。此阴性对照用于在此表面上寻找PEG聚合物可能固有的任何非特异性或多层结合。
图9展示用测试分子处理经活化巯基硅烷尖端的时间过程。当此活化尖端暴露于0.1mg/mL于PBS中的双胺基PEG(MW 3300)时，其光学厚度展示一明显增加。当双胺基PEG溶液用PBS缓冲液代替时，停止增加。暴露于0.1mg/mL PEG(MW8000)存于PBS中的混合物(其不包含胺)的活化尖端展示较小的光学厚度初始增加但此痕迹很快变得平坦。自此可得出结论PEG聚合物不具有固有的非特异性结合且所看到的双胺基PEG结合归因于胺基的特异性共价固体。
实例5使用NHS-酯化学物质获得的抗体衍生化尖端。
本实例阐述了低分子量分子结合至经固定高分子量分子的结合。采用实例4中所述的相同NHS酯端接的表面及实例1中所述相同的尖端构造，将一个抗-生物素抗体固定于3个光纤。通过于室温下将此经活化的光纤浸于20μg/mL小鼠抗-生物素抗体(Biodesign，Saco MN；目录编号H61504M)于PBS中的溶液中1小时来完成抗体的固定。此尖端用PBS冲洗2分钟。PBS冲洗后，此尖端用100μM乙醇胺pH8.5(Sigma-AldrichChemicalCompany，St Louis，MO；目录编号E9508)的水溶液骤冷5分钟并然后在PBS中再洗涤2分钟。
将第一光纤暴露于200μg/mL生物素(Pierce Biotechnology，Rockford IL；目录编号29129)于PBS中的溶液。使用蔗糖(Sigma-Aldrich Chemical Company，St Louis，MO；目录编号S8501)(2mg/mL)和PBS的溶液在第二及第三光纤上实施对照以确定基线噪声。自该等测试获得的数据展示于图10中。将生物素结合视为光学厚度增加，而暴露于蔗糖未展示高于基线可察觉的增加(PBS)。使用以相同方式固定于上述抗-生物素抗体上的不相干抗体(自Calbiochem，San Diego CA购得的抗-Lewis Y抗体；目录编号434636)实施另一阴性对照。将此经固定的抗体暴露于200μg/mL生物素溶液。没有结合至此抗体的生物素表明生物素至此抗-生物素抗体的结合是由于特异性相互作用而不是由于非特异性结合。
尽管上文已根据一较佳实施例及各种替代实施例具体展示并阐述本发明，但，熟习此项技术者应了解，可对其中的形式及细节作出各种修改且并不背离本发明之精神及范畴。
出於所有目的，本说明书主体内所引用的所有参考文献、公开专利及专利申请案均以其整体引用的方式并入本文中。
权利要求
1.一种组件，其包括用于通过光纤耦合至光源的光学元件，所述光学元件包括透明材料、第一反射表面和第二反射表面，所述第一与第二反射表面相隔至少50nm，其中所述第一反射表面包括分析物结合分子层。
2.如权利要求1所述的组件，其中所述第二反射表面包括折射率大于所述光学元件透明材料折射率的材料层。
3.如权利要求1所述的组件，其中所述第一与第二反射表面之间的间距介于100nm与5,000nm之间。
4.如权利要求3所述的组件，其中所述第一与第二反射表面之间的间距介于400nm与1,000nm之间。
5.如权利要求1所述的组件，其中所述光学元件透明材料的折射率小于1.8。
6.如权利要求5所述的组件，其中所述光学元件透明材料为选自由SiO2和透明聚合物组成的群组的材料。
7.如权利要求6所述的组件，其中所述透明聚合物包括聚苯乙烯或聚乙烯。
8.如权利要求1所述的组件，其中所述第二反射表面包括一具有大于1.8的折射率的材料层。
9.如权利要求8所述的组件，其中所述第二反射表面层包含Ta2O5。
10.如权利要求9所述的组件，其中所述第二反射表面层的厚度介于5nm与50nm之间。
11.如权利要求1所述的组件，其中所述分析物结合分子层包括选自由蛋白质、小分子、核酸和碳水化合物组成的群组的分子。
12.如权利要求11所述的组件，其中所述蛋白质选自由抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、抗体和抗体片段组成的群组。
13.如权利要求1所述的组件，其中所述光学组件适于通过使所述光学组件与所述光纤咬合的机械耦合来耦合至所述光源。
14.如权利要求1所述的组件，其中所述光学元件适于通过包括透镜系统的耦合组件来耦合至所述光源。
15.如权利要求1所述的组件，其进一步包括覆盖于所述第二反射表面上的第二光学元件。
16.如权利要求15所述的组件，其中所述第二光学元件的厚度大于100nm。
17.如权利要求16所述的组件，其中所述第二光学元件的厚度大于200nm。
18.如权利要求15所述的组件，其中所述光学组件适于通过使所述光学组件与所述光纤咬合的机械耦合来耦合至所述光源。
19.如权利要求18所述的组件，其中所述机械耦合在所述组件与所述光纤之间提供空气隙。
20.如权利要求19所述的组件，其中所述空气隙小于100nm。
21.如权利要求19所述的组件，其中所述空气隙大于2μm。
22.一种由权利要求1所述的组件组成的二维阵列。
23.一种由权利要求15所述的组件组成的二维阵列。
24.一种用于检测分析物的装置，其包括权利要求1所述的组件；用于将光射至所述第一与所述第二反射表面上的光源；和检测器，其接收来自所述第一与所述第二反射表面的光且所述第一反射表面暴露于所述分析物便对所述第一反射表面的光学厚度变化进行检测。
25.一种用于检测分析物的装置，其包括权利要求15所述的组件；用于将光射至所述第一与所述第二反射表面的光源；和检测器，其接收来自所述第一与所述第二反射表面的光且所述第一反射表面暴露于所述分析物便对所述第一反射表面的光学厚度变化进行检测。
26.一种用于检测分析物的装置，其包括如权利要求22所述的组件的二维阵列；用于将光射至所述第一与所述第二反射表面上的光源；和检测器，其接收来自所述第一与所述第二反射表面的光且所述第一反射表面暴露于所述分析物便对所述第一反射表面的光学厚度变化进行检测。
27.一种用于检测分析物的装置，其包括如权利要求23所述的组件的二维阵列；用于将光射至所述第一与所述第二反射表面上的光源；和检测器，其接收来自所述第一与所述第二反射表面的光且所述第一反射表面暴露于所述分析物便对所述第一反射表面的光学厚度变化进行检测。
28.一种套组，其包括一组件，所述组件包括一适于通过光纤耦合至光源的光学元件，所述光学元件包括透明材料、第一表面和第二反射表面，所述第一表面与所述第二反射表面相隔至少50nm；其中所述第一表面可结合一分析物结合分子层且所述第二反射表面包括一折射率大于所述光学元件透明材料折射率的材料层；和用于使所述分析物结合分子层结合至所述第一表面的说明书。
29.如权利要求28所述的套组，其进一步包括用于以化学方式修饰所述第一表面的试剂和所述试剂的使用说明书。
30.如权利要求28所述的套组，其中所述光学组件进一步包括一覆盖于所述第二反射表面上的第二光学元件。
31.如权利要求29所述的套组，其进一步包括覆盖于所述第二反射表面上的第二光学元件。
32.一种用于检测试样中分析物的方法，其包括提供如权利要求24所述的装置和试样；将所述第一反射表面暴露于所述试样，和确定所述暴露是否导致所述第一反射表面的光学厚度变化。
33.一种用于检测试样中分析物的方法，其包括提供如权利要求25所述的装置和试样；将所述第一反射表面暴露于所述试样，和确定所述暴露是否导致所述第一反射表面的光学厚度变化。
34.一种用于检测试样中分析物的方法，其包括提供如权利要求26所述的装置和试样；将所述第一反射表面暴露于所述试样，和确定所述暴露是否导致所述第一反射表面的光学厚度变化。
35.一种用于检测试样中分析物的方法，其包括提供权利要求27所述的装置和试样；将所述第一反射表面暴露于所述试样，和确定所述暴露是否导致所述第一反射表面的光学厚度变化。
36.一种组件，其包括适于附装至光纤的一端来接收来自所述光纤的光束的光学元件，所述光学元件包括(a)相隔至少50nm的近端反射表面与远端反射表面，和(b)一分析物结合分子层，其定位可使来自所述近端反射表面的反射光束与来自所述远端反射表面的反射光束之间的干涉随分析物与所述分析物结合分子层的结合而改变，且其中所述反射光束耦合到所述光纤中。
37.如权利要求36所述的组件，其中所述远端反射表面包括所述分析物结合分子层。
38.如权利要求37所述的组件，其中所述两个反射表面之间的光程长度随分析物与所述分析物结合分子层的结合而增加。
39.如权利要求38所述的组件，其中所述两个反射表面之间的物理距离随分析物与所述分析物结合分子层的结合而增加。
40.如权利要求37所述的组件，其中所述光学元件进一步包括位于所述反射表面之间的透明固体材料。
41.如权利要求40所述的组件，其中所述近端反射表面包括具有较所述透明固体材料大的反射率的材料。
42.如权利要求40所述的组件，其中所述透明固体材料的反射率约等于所述分析物结合分子层的反射率。
43.如权利要求36所述的组件，其中所述远端反射表面位于所述近端反射表面与所述分析物结合分子层之间。
44.如权利要求43所述的组件，其中所述两个反射表面之间的物理距离随分析物与所述分析物结合分子层的结合而降低。
45.如权利要求36所述的组件，其中所述分析物结合分子层位于所述两个反射表面之间。
46.如权利要求45所述的组件，其中所述两个反射表面之间的物理距离随分析物与所述分析物结合分子层的结合而增加。
47.如权利要求45所述的组件，其中所述两个反射表面之间的光程长度随分析物与所述分析物结合分子层的结合而增加。
48.如权利要求36所述的组件，其中所述光学元件进一步包括位于所述反射表面之间的空气隙。
49.如权利要求36所述的组件，其中所述两个反射表面之间的光程长度随分析物与所述分析物结合分子层的结合而变化且所述光程长度变化引起所反射光束之间的干涉改变。
50.如权利要求36所述的组件，其中所述两个反射表面之间的物理距离随分析物与所述分析物结合分子层的结合而变化且所述物理距离变化引起所反射光束之间的干涉改变。
51.如权利要求36所述的组件，其中位于所述两个反射表面之间的材料的反射率随分析物与所述分析物结合分子层的结合而变化且所述反射率变化导致所反射光束之间的干涉改变。
52.如权利要求36所述的组件，其中位于所述两个反射表面之间材料的光学吸收随分析物与所述分析物结合分子层的结合而变化且所述光学吸收变化导致所反射光束之间的干涉改变。
53.如权利要求36所述的组件，其中当分析物结合至所述分析物结合分子层时，所述分析物结合分子层膨胀且所述膨胀导致所反射光束之间的干涉改变。
54.如权利要求36所述的组件，其中所述光学元件永久附接至所述光纤的端部。
55.如权利要求36所述的组件，其中所述光学元件以可拆卸方式附接至所述光纤的端部。
全文摘要
本发明公开用于检测试样溶液中分析物(46)的存在或数量或结合速率的装置和方法。所述装置包括具有相隔大于50nm的距离“d”的第一(42)与第二(40)反射表面的光学组件(26)，其中所述第一表面由一分析物结合分子层(44)形成；和用于将一光束射到所述第一和第二反射表面上的光源(22)。当将所述组件置于分析物溶液中时，所述装置中的检测器(28)运行，以通过检测从所述第一和第二表面所反射的光波的相位移来检测因分析物至所述分析物结合分子的结合而引起的所述第一反射层的厚度变化。
文档编号G01B9/02GK1875243SQ200480031823
公开日2006年12月6日 申请日期2004年11月5日 优先权日2003年11月6日
发明者谭宏, 谭语山, 陈段君, 克丽斯塔·利娅·威特 申请人:佛特比奥公司