专利名称：林下参与栽培人参的微量化学鉴别方法
技术领域：
本发明属于中药技术领域。具体涉及林下参或栽培人参微量化学鉴别的方法。
背景技术：
人参Panax ginseng C.A.Mey.，为五加科多年生植物，其干燥根入药。
人参在药材商品市场上，主要有野生人参、林下参、栽培人参之分，三者在植物学上是同一种源。
“野生人参”，亦称野山参，是自然生长在深山密林中，在天然的气候条件、土壤、坡向、森林郁闭度、水分及自然的伴生植物等的环境中生长，没有任何人为因素干扰，又经过一定生长年限而长成的人参，为国家珍稀濒危植物。《中国红皮书》第一辑将野生人参列为国家一类保护物种。通常不允许采挖作为商品流通。
“林下参”，亦称林下山参，或山参，是在未被破坏的自然森林生态环境条件下，人工播种在山林，在野生状态下自然生长而成，生长时间通常为15-20年或更长，习称“籽海”人参。这种栽培方式利用了阔叶林和针阔叶混交林林下的肥沃土壤及温、光、水资源，是一种模拟山参野生环境的栽培方式，因此可能将野播或栽植的人参诱生出与野山参相同的特点。在野山参资源日益紧缺甚至濒临灭绝的情况下，这种仿野生栽培的林下参在国内外受到了一致的认可和欢迎。
“栽培人参”，亦称园参，是在砍伐树林后的林间适宜山地中，经过人工作床种植栽培，培育达5-6年后采收的人参。
林下参和园参均收载于《中华人民共和国药典》(2005年版)。
由于人参因生长年限和生长环境不同，其内在有效活性物质存在差异。人们公认在防治疾病和医疗保健中野生人参和林下参(林下山参)的质量和疗效均显著优于栽培人参(园参)。然而，长期以来，人们在人参真伪优劣的鉴别上，主要是以人参外表性状特征和人参组织粉末特征作为鉴别依据。所谓外表性状特征，是用芦(芦头)、艼(生长在芦上的不定根)、体(主根)、纹(主根肩部或上1/3部位的环纹)、须(支根上生长的细根)等五形的形状特征作为经验鉴别依据。但是外表性状特征并不能真正全面反映人参的内在质量。因过分强调和夸大外表性状等特征作为人参真伪优劣的依据，造成市场的混乱和消费者权益的损失。
人参挥发油是具有特有香味的化学成分，早在1939年即见有报道，而较大量的研究报道始于20世纪60年代。人参挥发油所含化学成分十分复杂，从中已分析出的成分已有200余种，其按化学结构分为以下几类(1)萜类包括单萜类化合物如α-蒎烯、β-蒎烯、二氢香芹酮、香芹酮、茨烯等；倍半萜类成分，如直链倍半萜橙花叔醇、顺-金合欢烯、反-金合欢烯等，单环倍半萜如β-没药烯、α-榄香烯、β-榄香烯等，双环倍半萜如α-芹子烯、β-芹子烯、β-石竹烯、β-檀香醇等，及以人参中征性的一类双环倍半半萜——氢化薁类化合物，这种氢化薁类成分是薁类化合物的一种原始形式，是双环倍半萜在人参挥发油中特有的一种形式。
(2)脂肪族包括烷烃、烯烃、炔烃、醇类、醚类、醛类、酮类、酸类、酯类等。
(3)芳香族如乙苯、叔丁基苯、1，2-二甲基苯、萘、醇醛萘胺等。
(4)杂环类化合物2-戊基呋喃、5-甲基-2-糠塞呋喃、苯骈呋喃、四甲基吡嗪，1，2-二甲基蒽醌等。
人参挥发油中各类化学成分的数目及含量受人参栽培的年限、产地及所取部位的影响而有一定的变异，这为用化学的手段来鉴别不同类型的人参提供了依据和可能性。
目前，国家颁布的2000年版或2005年版《中国药典》对人参的检测方法中均未记载关于用挥发油成分的检测手段。
中药色谱指纹图谱是中药所含化学成分的整体表征，它可表达出中药材复杂混合体系中各种不同化学成份浓度分布的整体状况，反映组分浓度的变化消长，是一种综合、整体的鉴定手段；对指纹图谱进行相似性的计算可表征出1个或2个样本在整体化学成分上的差异性，利用指纹图谱的相似性可鉴别药材真伪优劣、评价药材质量的均一性和稳定性。
指纹图谱相似性计算是指通过量化的过程比较各指纹图谱上相互对应谱峰的异同，计算出各指纹图谱间的相似度。它包括以下2个步骤(1)指纹图谱信息的数字化(谱峰测量参数，如峰面积、峰高等)在早期的指纹图谱研究中，数字化的过程是通过将色谱中主要色谱峰的峰高或峰面积抽提出来作为表征该色谱的特征而实现的，但这种方法只用部分色谱特征表征整个色谱指纹图谱，因此会导致一些信息的丢失，最终使指纹图谱的鉴别灵敏度下降。
现代波谱或色谱分析仪器所测得的谱都是以二进制保存于计算机内的一组数据，这样的一组数据称为一个矢量，它表达了整个谱的全息信息。以这样的矢量进行相似性度量，反映的是化学样本的完整色谱指纹图谱的相似性；对任何一个化学样本，都可以用一个矢量来表示，化学样本间的相似度就可由两个矢量间的相似性来进行度量。
(2)计算指纹图谱间的相似度指纹图谱相似度可以采用一个或几个指纹峰进行比较计算，也可以采用指纹图谱上所有谱峰进行比较计算。为了全面度量中药的化学组成的整体波动情况，一般采用后一种计算方法。因为现代波谱或色谱分析仪器所测得的谱是以二进制保存的一组数据，作为一个矢量，可以按以下公式进行相似度计算相关系数算法S=Σi=1n(xi-x‾)(yi-y‾)Σi=1n(xi-x‾)2Σi=1n(yi-y‾)2]]>其中，x和y分别表示两组色谱数据的均值，xi，yi表示两组色谱数据的对应点，求得的相关系数S∈
，以此方法判断两组数据的相似程度；以这种方法计算得到的相似度，反映的是两个化学样本完整图谱的相似性。
气相色谱法(Gas chromatography，GC)是一种以气体为流动相的色谱法；利用样品中各组分在固定相与载气两相中的分配系数不同而实现分离，具有分离效能高、选择性好、分析速度快及应用广等优点，特别适合于植物药的挥发油成分及其它易挥发性成分、或可转化为可挥发性成分的测定。
气相色谱质谱联用技术(GC-MS)是将质谱仪作为检测器与GC联用的一种技术。这种联用技术在色谱分离过程中同时记录了各流出组分的质谱数据，为指纹图谱中各谱峰的识别和鉴定提供了分子结构的化学信息。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于应用气相色谱与质谱联用技术测定人参挥发油的化学成分建立指纹图谱，从而用于鉴别林下参与栽培人参。
本发明提供了一种林下参或栽培人参的微量化学的鉴别方法。
本发明的方法基于下列实验1.供试品溶液制备方法的确定对制备供试品溶液的提取溶剂(正己烷、乙醚、丙酮)、提取方法(超声、冷浸)、提取时间(30min，1hr，2hr)、提取温度(室温、30℃)及纯化方法(液液萃取)进行了比较，确定用以下方法进行供试品溶液的制备。
各人参样品分为主根、侧根及须根三个部位，分别研磨粉碎。称取各部位药材粉末约50mg，精密称定，置1ml Eppendorf管中，加入0.5ml正己烷，超声提取1小时，离心，吸取上清液进行GC-MS分析。
2.色谱条件色谱柱固定，对不同色谱条件，包括进样量(1μL，3μL)，载气流速(1.0，1.2，1.3，1.5mL/min)及升温程序(13个升温程度)进行调整、比较和优化，最后确定色谱条件为Dikma DM-1(30mm×0.25mm×0.25μm)毛细管柱；柱温100℃；进样口温度270℃；程序升温(见下表1)；进样量1μL；进样方式分流，分流比2.0；载气流速1.30mL/min.
表1.气相色谱升温程序
通过上述实验条件的选择，确定本发明的检测条件。
(1)样品制备按常规方法将人参的试样称定后，加入正己烷，超声提取1小时，离心，吸取上清液即得鉴别样品；(2)气相色谱——质谱GC-MS分析气相色谱条件Dikma DM-130mm×0.25mm×0.25μm毛细管柱；柱温100℃；进样口温度270℃；程序升温；进样量1μL；进样方式分流，分流比2.0；载气流速1.30mL/min.
质谱条件离子源温度200℃；接口温度250℃；溶剂切除时间5min；质量扫描范围m/z 35～380；扫描间隔0.5秒.
在上述条件下检测样品的GC-MS图谱；(3)样品的鉴别通过步骤(2)获得的样品指纹图谱，选择8-9个峰进行相似度计算，然后将此计算值与标准相似度值进行比较，即可鉴别该样品为林下参或为栽培人参。
林下参主根0.88～0.91中位数模式，0.77～0.88均值模式；侧根0.78～0.96中位数模式，0.78～0.96均值模式；须根0.81～0.96中位数模式，0.90～0.92均值模式；园 参主根0.38～0.57中位数模式，0.36～0.54均值模式；侧根0.24～0.57中位数模式，0.24～0.58均值模式；须根0.25～0.61中位数模式，0.24～0.71均值模式。
以林下参主根、侧根及须根GC-MS图谱建立指纹图谱共有模式，利用待检测人参样品与此共有模式的相似度值大小可以区分林下参和园参。
本发明对药材商品中林下参和园参中的挥发油成分进行分析并对所获得的色谱图全谱进行分析，不同于现行国家药典的常规检测方法，有较大的实用价值。
本发明采用常规方法将人参中的挥发油成分提取后，应用本发明所建立的测试条件，进行GC-MS分析，以所获得的挥发油GC-MS图谱作为矢量，通过计算机辅助相似性评价系统处理，计算出商品药材中林下参、园参的相似度值，达到鉴别园参与林下参的目的，用于鉴别的样品可以是人参的不同部位。
本发明采用微量化学分析方法对珍贵的人参药材进行鉴别，能节约资源，具有较大的经济效益和社会效益。本发明的方法也可用于人参粉产品的鉴别。
图1林下参主根挥发油GC-MS图谱。
图2园参主根挥发油GC-MS图谱。
图3林下参(15年生)主根挥发油GC-MS图谱。
图4林下参(15年生)侧根挥发油GC-MS图谱。
图5林下参(15年生)须根挥发油GC-MS图谱。
图6林下参(18年生)主根挥发油GC-MS图谱。
图7林下参(18年生)侧根挥发油GC-MS图谱。
图8林下参(18年生)须根挥发油GC-MS图谱。
图9园参(集安市，4年生)主根挥发油GC-MS图谱。
图10园参(集安市，4年生)侧根挥发油GC-MS图谱。
图11园参(集安市，4年生)须根挥发油GC-MS图谱。
图12园参(靖宇县，6年生)主根挥发油GC-MS图谱。
图13园参(靖宇县，6年生)侧根挥发油GC-MS图谱。
图14园参(靖宇县，6年生)须根挥发油GC-MS图谱。
图15三批林下参主根挥发油GC-MS图谱用于时间校正的谱峰。
图16校正后三批林下参主根挥发油的GC-MS图谱。
图17三批林下参主根挥发油共有模式图谱(取均值)。
图18三批林下参主根挥发油共有模式图谱(取中位数)。
图19校正后的三批林下参及五批园参主根挥发油GC-MS图谱。
图20校正后三批林下参侧根挥发油GC-MS图谱。
图21三批林下参侧根挥发油共有模式图谱(取均值)。
图22三批林下参侧根挥发油的共有模式图谱(取中位数)。
图23校正后的三批林下参及五批园参侧根挥发油GC-MS图谱。
图24校正后的三批林下参须根挥发油GC-MS图谱。
图25三批林下参须根挥发油共有模式图谱(取均值)。
图26三批林下参须根挥发油共有模式图谱(取中位数)。
图27校正后的三批林下参及五批园参须根GC-MS图谱。
具体实施例方式实例1林下参与园参鉴别1、仪器与试剂Shimadzu GC-MSMS-QP2010气相色谱质谱仪Crest超声清洗机(型号1875HTAG)Spectrafuge 16M离心机正己烷Lab-Scan Analytical Sciences，农残级2.样品来源本发明所用的人参及林下参样品均采购自吉林省各地，见表2。
表2.人参样品的类型及产地
注上表中的园参即为栽培人参。
3.供试品的制备各人参样品分为主根、侧根及须根三个部位，分别研磨粉碎。称取各部位药材粉末约50mg，精密称定，置1ml Eppendorf管中，加入0.5ml正己烷(n-Hexane)，超声提取1小时，离心，吸取上清液进行GC-MS分析。
4.实验条件4.1)色谱条件Dikma DM-1(30mm×0.25mm×0.25μm)毛细管柱；柱温100℃；进样口温度270℃；程序升温(见表1)；进样量1μL；进样方式分流，分流比2.0；载气流速1.30mL/min.
4.2)质谱条件离子源温度200℃；接口温度250℃；溶剂切除时间5min；质量扫描范围m/z35～380；扫描间隔0.5秒.
5.色谱图在上述实验条件下得到的林下参主根挥发油的GC-MS色谱图，见图1
林下参主根挥发油的主要成分见表3。
园参主根挥发油的GC-MS色谱图，见图2。
园参主根挥发油的主要成份见表4。
表3.林下参主根挥发油中的主要成分
表4.园参挥发油中的主要成分
由图可见，人参挥发油中的化学成分十分复杂，尤以低沸点和高沸点的成分数量较多，含量亦高；其中高沸点部分的聚炔乙醇类(保留时间在50min左右)在各样品中含量为最高。
本发明用上述实验条件对5批林下参样品及5批园参样品进行检测，其中3批林下参的GC-MS谱图如图.3，图4，图5，图6、图7、图8。2批园参的GC-MS图谱如图9、图10、图11、图12、图13、图14。
上述测定表明同一人参样品不同部位的挥发油成分在数量和含量上均有较大差异，此差异大于不同人参样品同一部位的差异。相近的样本同一部位的挥发油成分较为一致，相似程度高，表明同一部位之间的挥发油成分具有可比性。对不同的林下参及园参同一部位的挥发油成分进行比较，可排除由于部位不同带来的差异，而将样本本身的差异表现出来。
以上述实验所得到的3批林下参主根、侧根及须根的GC-MS图谱用均值法及中位数法分别产生林下参主根、侧根及须根的共有GC-MS模式。以此共有模式为标准，计算2批林下参及5批园参与此共有模式的相似度，结果如下1.林下参主根挥发油共有GC-MS模式及相似度计算1.1)林下参主根共有模式的产生样品4，5，6号样品，即11年生，15年生，18年生林下参数据的前处理三批林下参的GC-MS图谱，选取8个峰，(如图15中以数字标明)选取峰的原则如下1.1.1)选择GC-MS图谱中响应值较高的主要的峰，这些峰易于辨认，因此也易于校正；1.1.2)所选择的峰在所有样品中共有，这样才能够对每一张图谱进行校正；1.1.3)据选择的色谱峰应较均匀地分布在色谱图中；本软件采用最小二乘法进行色谱峰的校正，对一个色谱峰的校正会使相邻色谱峰同时位移，因此选择均匀分布在整个色谱图的峰进行校正可使色谱图的全谱都得到校正；
对比例2取2.0克活性棕B-R的染料重复实施例12。
测试结果见表2。
表2
测试数据表明，其水洗牢度、摩擦牢度、汗渍牢度和匀染性均有明显提高。
表5.三批林下参侧根的组内相似度
2.2)相似度的计算以上述方法产生的林下参共有模式为标准，对2批林下参及5批园参侧根GC-MS图谱(图23)进行相似度计算，结果如下(表6)表6.不同人参样品与林下参侧根共有模式的相似度
3.林下参须根挥发油共有GC-MS模式及相似度计算3.1)林下参须根共有模式的产生样品11年生，15年生，18年生林下参；
数据的前处理三批林下参须根GC-MS图谱，选取9个峰(见图24中以数字标记的峰)进行时间校正，校正后的图谱见图24，产生的共有模式见图25、26，组内相似度见表7。
表7.三批林下参须根的组内相似度
3.2)相似度的计算以上述方法产生的林下参共有模式为标准，对林下参及园参须根GC-MS图谱(图27)进行相似度计算；结果如下(表8)表8.不同人参样品与林下参须根共有模式的相似度
4.鉴别效果以主根、侧根及须根的GC-MS指纹图谱的相似度可很好地区分林下参与园参样品(表9，10)。
表9.不同类型人参样品与林下参共有模式相似度(相关系数_中位值)的比较
表10.不同类型人参样品与林下参共有模式相似度(相关系数_均值)的比较
以林下参主根、侧根及须根GC-MS图谱建立指纹图谱共有模式，利用相似度值的大小可以区分林下参和园参。
实例2鉴别人参粉末样品样品人参粉末样品2个，分别标记为A，B；按本方法所描述的气相色谱条件进行分析检测，对所得到的GC-MS图谱进行相似度的计算；由于人参样品中的主根通常占人参全株重量的70～90％，因此将未知样品的GC-MS图谱与林下参主根的GC-MS共有模式进行比较，计算得到的相似度结果如下表11.未知人参样品与林下参共有模式的相似度计算及鉴别结果
权利要求
1.一种林下参与栽培人参的微量化学鉴别方法，该方法包括下列步骤(1)样品制备按常规方法将人参的试样称定后，加入正已烷，超声提取1小时，离心，吸取上清液即得鉴别样品；(2)气相色谱——质谱GC-MS分析气相色谱条件Dikma DM-1 30mm×0.25mm×0.25μm毛细管柱；柱温100℃；进样口温度270℃；程序升温；进样量1μL；进样方式分流，分流比2.0；载气流速1.30mL/min，质谱条件离子源温度200℃；接口温度250℃；溶剂切除时间5min；质量扫描范围m/z 35～380；扫描间隔0.5秒，在上述条件下检测样品的GC-MS图谱；(3)样品的鉴别通过步骤(2)获得的样品指纹图谱，选择8-9个峰进行相似度计算，然后将此计算值与标准相似度值进行比较，即可鉴别该样品为林下参或为栽培人参。
2.根据权利要求1所述的一种林下参与栽培人参的微量化学鉴别的方法，其特征在于其中所述的标准相似度为林下参主根0.88～0.91中位数模式，0.77～0.88均值模式；侧根0.78～0.96中位数模式，0.78～0.96均值模式；须根0.81～0.96中位数模式，0.90～0.92均值模式；园参主根0.38～0.57中位数模式，0.36～0.54均值模式；侧根0.24～0.57中位数模式，0.24～0.58均值模式；须根0.25～0.61中位数模式，0.24～0.71均值模式。
3.根据权利要求1所述的一种林下参与栽培人参的微量化学鉴别的方法，其特征在于其中所述步骤(2)气相色谱-质谱分析时，气相色谱的升温程序为由100.0℃升温至170℃，升温速度为1.5℃/min，再由170℃升温至190.0℃，升温速度为8.0℃/min，最后由190.0℃升温至240℃，升温速度为2.0℃/min。
4.根据权利要求1所述的一种林下参与栽培人参的微量化学鉴别的方法，其特征在于其中所述步骤(3)样品的鉴别中，所述选择的峰为在图谱中响应值较高的主要峰，并在所有样品中共有。
全文摘要
本发明采用常规方法将人参中的挥发油成分提取后，通过GC－MS分析方法应用本发明建立的测试条件，将提取的挥发油成分的GC－MS图谱作为矢量，通过计算机辅助相似性评价系统处理，计算出林下参或园参的相似度值，达到鉴别园参或林下参的目的。采用微量分析方法，能节约资源，有较大的经济效益和社会效益。本发明的方法也可用于人参粉的相关产品的鉴别。
文档编号G01N15/00GK1858582SQ20051003008
公开日2006年11月8日 申请日期2005年9月28日 优先权日2005年9月28日
发明者沈百华, 严仲铠, 牛贺明 申请人:沈百华, 严仲铠, 牛贺明