专利名称：一种低丰度蛋白靶上一步除盐与富集的方法
技术领域：
本发明属生化分析技术领域，具体涉及一种痕量样品除盐和富集的方法。
背景技术：
伴随着人类基因组计划(HGP)的顺利实施，人们认识到功能基因组学重在提示基因的生物学功能，在基因组整体水平上阐明基因活动的规律，而基因仅仅是遗传信息的载体，而生命活动的执行者和体现者是基因的表达产物---蛋白质。后基因组时代中，生命科学的中心任务则是阐明基因组所表达的真正执行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生物功能，即生命科学的研究中心将从基因组学转移到蛋白质组学(Proteome)。蛋白质组比基因组复杂的多，蛋白质组学的发展不仅需要包括数据库整合在内的新技术的发展和新实验战略的建立，而且还需要学科转移和跨学科合作的精神。随着新技术的整合极其广泛扩散以及各个领域的科学计划之间的广泛合作，人类以及各种模式生物基因组测序计划开始时确定要完成的任务必将取得最终的实现。
蛋白质组学研究主要包括样品或组织中的蛋白质分离和鉴定两个关键步骤。生物质谱随着新的软电离方式——基质辅助激光解析离子源(MALDI)的广泛应用已经成为蛋白质组学技术平台中最为重要的技术手段。日本科学家田中耕一先生正是因为发明了MALDI而荣获2002年诺贝尔化学奖。因为蛋白质组是一个在时间和空间动态变化着的整体，样品体系及其复杂，蛋白动态分布范围非常广，在样品预处理过程中必须加入一些表面活性剂、去垢剂、尿素等溶剂来增加蛋白的溶解度，随之带来的问题是这些杂质或盐分会大大降低蛋白或肽段的质谱信号，使样品收集不到足够的质谱鉴定信息，所以除盐是蛋白质组学研究工作中必须用到的处理步骤；而蛋白质组样品中高中低丰度蛋白分布广泛，低丰度蛋白又往往担负着生物体内各种重要的生理功能，它的有效分离与检测目前是国际难题，因为样品处理有很多步骤，寻找富集低丰度蛋白有效方法的同时也要简化步骤以减少器皿内壁对蛋白样品的吸附，除盐也是目前提高低丰度蛋白检测灵敏度的有效手段。
蛋白质组研究的进一步拓展和深入，尤其是对低丰度蛋白质的分析鉴定已经对MALDI技术提出越来越高的要求。现有的MALDI技术由于仅依靠有机基质辅助样品离子化，这样由于溶剂扩散程度的不同、金属靶板表面的微区多样性、溶剂挥发时间不同、基质和样品的溶解性不同、以及盐和其它无机杂质的干扰等因素而导致质谱检测样品灵敏度低和重复性差，这给低丰度蛋白质的检测造成了屏障。科学家一方面在寻求新型的基质，如无机基质和离子液基质，试图彻底改善样品和基质的分布来实现MALDI信号的定量化；另一有效途径是科学家们发展了聚合物印迹样点技术以实现提高样品检测灵敏度和重复性。早期的做法是用聚合物涂层作为吸附固定相，这样虽然在复杂体系下吸附了蛋白或肽消除了盐和表面活性剂的干扰，但是对蛋白或肽的吸附量非常有限，不符合低丰度蛋白的检测要求；另一传统的做法是用印迹方法在金属靶的非点样部分表面自组装上一层非极性分子，而在点样部分涂覆极性聚合物，把肽样品点覆在极性聚合物涂层上后再用水洗掉表面活性剂和盐，最后再点加基质。这样不但水洗过程需要一定的经验技术，否则会照成盐洗脱不充分或样品被洗脱而损失，并且影响了分析过程的高通量和高速度，不太适合蛋白质组学规模化的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、灵敏度高、重现性好的对痕量蛋白或多肽样品进行靶上一步除盐和富集并直接进行质谱分析的方法。
本发明提出的对痕量蛋白或多肽进行靶上一步除盐和富集的方法，具体步骤如下1、首先用疏水性聚合物在MALDI靶板每个样品池的中央部位形成均匀印迹涂层。
2、利用制作的疏水性聚合物微印迹涂层进行痕量蛋白质或多肽的靶上一步除盐和富集工作。将多肽或蛋白样品0.3～1.0微升点覆在疏水性聚合物印迹涂层上，室温自然干燥，由于蛋白质或多肽与疏水性聚合物有很强的疏水性相互作用，从而被富集在印迹涂层表面。
3、将稍过量体积的有机基质溶液(例如4～10mg/mL的2-氰基-4-羟基肉桂酸(α-CHCA))点覆在带有上述样品的疏水性聚合物印迹涂层上。由于疏水性聚合物对蛋白质或多肽具有强吸附作用而对无机盐等污染物具有弱吸附作用，并且固体表面的液滴干燥过程中在液滴内部具有外流作用，所以过量的基质溶液会携带无机盐等与疏水性聚合物弱吸附的污染物、并扩散出印迹涂层至周围的不锈钢靶板区域。室温自然干燥后，印迹涂层表面形成样品和基质均匀细致的结晶。
4、被富集的样品无需额外洗脱除盐步骤，直接用激光激发印迹涂层表面进行MALDI-TOF-MS分析，(即基质辅助激光解析离子化质谱分析)。
5、根据质谱结果，鉴定多肽或蛋白质。
上述方法中，步骤1中形成疏水聚合物印迹涂层的具体操作如下(1)在一定厚度(例如35-50微米)的Kapton粘性膜(杜邦公司)上按照MALDI靶的形状和样品池位置、使用红外激光精确定位打孔，使Kapton膜上形成与靶样品池位置对应的、直径为池直径一半的小孔，并黏在MALDI靶的表面；(2)将0.2微升疏水性聚合物溶液(10-18mg/mL，溶于四氢呋喃)点覆于每个Kapton膜的小孔内，溶剂迅速挥发，将Kapton膜揭去，MALDI靶板每个样品池内形成均匀的疏水性聚合物微印迹涂层。
本发明的疏水性聚合物微印迹MALDI样点技术，可以非常有效的实现样品一步除盐和富集的效果，并且无需额外的水洗过程就能达到提高检测肽段灵敏度的目的。1997年NATURE上有科学家报道固体表面的、处在挥发过程中的液滴内部存在“Outward Flow”的过程(外流过程)，我们巧妙的利用这一自然现象，首先将疏水性聚合物微印迹在MALDI-MS靶板每个样品池的中央，再把样品点覆在聚合物涂层上，室温自然干燥后将稍过量体积的基质溶液点覆其上，由于液滴内部“Outward Flow”把无机盐等杂质源源不断带到样品池外圈的不锈钢表面上，而蛋白质或肽段由于和聚合物表面存在疏水性相互作用力而仍被浓缩在聚合物表面上和基质形成均匀的共结晶，从而实现了样品一步除盐与富集技术。然后将靶板送入MALDI-MS，用激光直接激发印迹涂层表面即可获得高灵敏度、高重现性的质谱信号。
本发明由于样品的样点面积相比传统方法缩小了，而且在平整的聚合物表面上样品分子与基质分子更容易形成细小、均匀的共结晶，这样在每次脉冲激光的激发下样品分子更容易被大批量的解析离子化，从而提高体系的灵敏度和重现率。
本发明使用的疏水性聚合物可以是聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲脂及其C60富勒烯官能团衍生物，它们都是世界上首次应用于MALDI-MS靶板涂层。
本发明还可使用硝基纤维素、聚乙烯、聚二氟乙烯、聚氨基甲酸酯、Nylon、Teflon等疏水性聚合物作为印迹涂层。
本发明的疏水性聚合物分子量为1万至5万道尔顿较为合适，线性、星形聚合方式都适用，其中，疏水性强的聚苯乙烯(PSt)要比疏水性次之的聚甲基丙烯酸甲脂(PMMA)灵敏度高，进行了C60富勒烯官能团衍生化的聚合物要比未衍生的同源聚合物灵敏度高，原因在于(1)聚合物疏水性越强，与蛋白质或多肽的疏水性相互作用越强，除盐能力就越强；(2)C60富勒烯官能团能有效地吸收紫外激光并把能量传递给基质和样品分子，提高其解吸化的效率，从而提高样品检测灵敏度。
聚合物性质表
本发明不仅成功实现了样品一步除盐与富集，而且具有灵敏度高、重现性好、通量高、耐盐能力强、经济和省时等特点，可广泛用于蛋白质组学领域。
图1为本一步除盐和富集方法流程示意图。
图2为60fmol/μL马心肌红蛋白酶解肽段样品的MALDI-TOF-MS谱图。(a)是通过传统不锈钢光板得到的，(b)是通过PMMA微印迹涂层得到的。(b)得到的样品信号的信噪比是传统方法(a)的3～4倍。
图3为拍摄的靶板上样点准备过程的显微数码照片。使用的印迹涂层材料是PMMA，样品是牛血清白蛋白的酶解肽段。(a)是做好的聚合物印迹涂层，(b-e)是0.35微升样品点覆在涂层上并自然干燥的过程，(f-o)是0.7微升基质溶液点覆在涂层上并自然干燥形成均匀结晶的过程。其中(b)是在样品点覆后马上拍摄的，(c)是2分钟后，(d)是4分钟后，(e)是6分钟后，(f)是在基质溶液点覆后马上拍摄的，(g)是15秒后，(h)是30秒后，(i)是45秒后，(j)是1分钟后，(k)是2分钟后，(1)是3分钟后，(m)是4分钟后，(n)是5分钟后，(o)是6分钟后，我们可以看到在样品池中央的聚合物表面上形成了一层均匀细致的结晶。
图4为利用PSt-C60涂层得到的浓度40fmol/μL牛血清白蛋白酶解肽段样品(人为加入100mM的碳酸氢氨作为干扰污染物)的MALDI-TOF-MS谱图。(a)是在样品池中央的聚合物涂层上得到的样品信号，(b)是在样品池外圈的不锈钢光板得到的样品信号。可以看到样品主要被富集在样品池中央的聚合物涂层上，并且PSt-C60涂层上得到的样品离子峰非常强。周围的区域几乎收集不到样品离子峰的信号。
图5为40fmol/μL牛血清白蛋白酶解肽段样品(人为加入100mM的碳酸氢氨作为干扰污染物)的MALDI-TOF-MS谱图。(a)是传统不锈钢光板得到的信号，(b)是PMMA涂层上得到的信号。可以看到在这么大浓度盐的干扰下，传统方法根本测不到这么痕量的肽段，而PMMA涂层却可以得到非常好的信号。
图6为使用PSt涂层、40fmol/μL牛血清白蛋白酶解肽段样品(人为加入100mM的碳酸氢氨作为干扰污染物)的MALDI-TOF-MS谱图。(a)是使用50％乙腈、50％水、0.1％三氟乙酸作为溶剂的4mg/mL基质α-CHCA溶液，(b)是使用40％乙腈、60％水、0.1％三氟乙酸作为溶剂的4mg/mL基质α-CHCA溶液。可以看出随着基质溶液水相比例的提升，基质溶剂溶解盐的能力更强，导致除盐能力也进一步提升。
图7为使用不同聚合物涂层得到的40fmol/μL牛血清白蛋白酶解肽段样品的三个代表肽段峰的MALDI-MS谱图的平均信噪比。(I)是没有加100mM的碳酸氢氨的样品得到的，(II)是加了100mM的碳酸氢氨的样品得到的。
图8为使用不同聚合物涂层得到的60fmol/μL马心肌红蛋白酶解肽段样品的三个代表肽段峰的MALDI-MS谱图的平均信噪比。(I)是没有加100mM的碳酸氢氨的样品得到的，(II)是加了100mM的碳酸氢氨的样品得到的。从图7和图8可以看出本方法的重现性很好，信噪比的相对偏差很小；并且疏水性强的苯乙烯(PSt)要比疏水性次之的聚甲基丙烯酸甲脂(PMMA)灵敏度高，进行了C60富勒烯官能团衍生化的聚合物要比未衍生的同源聚合物灵敏度高。
图中标号1为192样品池MALDI靶板，2为一个放大的样品池中的疏水性聚合物印迹涂层，3为点覆样品溶液在涂层表面，4为室温自然干燥，5为点覆基质溶液在涂层表面，6为伴随液体内部外流作用的过量液体溢出涂层表面扩散至周围靶板区域，7为室温自然干燥，8为送至MALDI-MS质谱分析。
具体实施例方式
下面的实例是对本发明提出的利用疏水性聚合物微印迹技术进行低丰度蛋白靶上一步除盐与富集过程的进一步说明。
实施例1通过红外激光精确定位打过孔的Kapton粘性膜制备好PMMA的印迹涂层靶板，每个印迹点直径为990微米，正好为样品池直径的一半；将0.35微升体积的60fmol/μL马心肌红蛋白酶解肽段样品溶液(溶剂为50％乙腈、50％水、0.1％三氟乙酸)点覆于印迹涂层上，室温自然干燥；然后将稍过量的体积为0.7微升的有机基质溶液(α-CHCA，溶剂为50％乙腈、50％水、0.1％三氟乙酸)点覆在印迹涂层表面，过量的溶液会溢出涂层至周围不锈钢区域，室温自然干燥；将制备好的样品送入MALDI-TOF/TOF质谱(4700Proteomics Analyzer，Applied Biosystems)检测。质谱条件激光器为Nd-YAG激光器，波长355nm，激光脉冲频率200Hz，加速电压20kV，正离子模式，反射式TOF检测。得到的质谱图如图2所示。
实施例2-4不同聚合物性质对MALDI-MS测定的影响调整聚合物涂层底物为PMMA-C60、PSt、PSt-C60，其它条件不变，重复上述除盐和富集实验。得到的结果参见附图8所示。
实施例5-8验证不同聚合物性质对MALDI-MS测定的影响调整样品溶液为40fmol/μL牛血清白蛋白酶解肽段溶液(溶剂为50％乙腈、50％水、0.1％三氟乙酸)，聚合物涂层底物分别为PMMA、PMMA-C60、PSt和PSt-C60，其它条件不变，重复上述除盐和富集实验。得到的结果参见附图7所示。
实施例9耐盐性的研究调整样品溶液为加了100mM浓度碳酸氢氨的40fmol/μL牛血清白蛋白酶解肽段溶液(溶剂为50％乙腈、50％水)，采用PMMA涂层，其它条件不变，重复上述除盐和富集实验。得到的结果参见附图5所示。
实施例10耐盐性的进一步验证提升α-CHCA基质溶液的水相比例为60％，样品溶液仍为加了100mM浓度碳酸氢氨的40fmol/μL牛血清白蛋白酶解肽段溶液(溶剂为50％乙腈、50％水)，采用PSt涂层，其它条件不变，重复上述除盐和富集实验。得到的基质溶液水相比例对比结果参见附图6所示。
实施例11样品溶液为加了100mM浓度碳酸氢氨的40fmol/μL牛血清白蛋白酶解肽段溶液(溶剂为50％乙腈、50％水)，采用PSt-C60涂层，调整激光激发靶板表面的范围，一是激发聚合物表面，二是激发聚合物周围的不锈钢表面，其它条件不变，重复上述除盐和富集实验。得到的不同区域质谱对比结果参见附图4所示。
权利要求
1.一种低丰度蛋白靶上一步除盐与富集的方法，其特征在于具体步骤如下(1)首先用疏水性聚合物在MALDI靶板每个样品池的中央部位形成均匀印迹涂层；(2)将0.3～1.0微升多肽或蛋白样品点覆在疏水性聚合物印迹涂层上，室温自然干燥，由于蛋白质或多肽与疏水性聚合物有很强的疏水性相互作用，从而被富集在印迹涂层表面；(3)将过量体积的有机基质溶液点覆在带有上述样品的疏水性聚合物印迹涂层上，过量的基质溶液会携带无机盐等与疏水性聚合物弱吸附的污染物、并扩散出印迹涂层至周围的不锈钢靶板区域，室温自然干燥后，印迹涂层表面形成样品和基质均匀细致的结晶；(4)被富集的样品直接用激光激发印迹涂层表面进行MALDI-TOF-MS分析；(5)根据质谱结果，鉴定多肽或蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中形成印迹涂层的操作步骤如下(1)在Kapton粘性膜上按照MALDI靶的形状和样品池位置、使用红外激光精确定位打孔，使Kapton膜上形成与靶样品池位置对应的、直径为池直径一半的小孔，并黏在MALDI靶的表面；(2)将0.2微升疏水性聚合物溶液点覆于每个Kapton膜的小孔内，溶剂迅速挥发，将Kapton膜揭去，MALDI靶板每个样品池内形成均匀的疏水性聚合物微印迹涂层。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所用疏水聚合物为聚甲基丙烯酸甲脂或其C60富勒烯衍生物、聚苯乙烯或其C60富勒烯衍生物，或者为硝基纤维素、聚乙烯、聚二氟乙烯、聚氨基甲酸酯、Nylon或Teflon。
全文摘要
本发明是一种通过疏水性聚合物微印迹技术与基质辅助激光解析离子化质谱联用，进行痕量蛋白或多肽的靶上一步除盐与富集的方法。微印迹的疏水性聚合物对蛋白质和多肽有很好的吸附富集效果，但是对无机盐和其他污染物吸附很少，利用固体表面液珠蒸发过程中的外流作用，被疏水性聚合物吸附的样品无需额外的洗脱除盐步骤就可实现除盐并直接进行MALDI－TOF－MS分析。本发明不仅成功实现了样品一步除盐与富集，而且具有灵敏度高、重现性好、通量高、耐盐能力强、经济和省时等特点，可广泛用于蛋白质组学领域。
文档编号G01N30/08GK1811407SQ20061002367
公开日2006年8月2日 申请日期2006年1月26日 优先权日2006年1月26日
发明者贾韦韬, 陆豪杰, 吴慧霞, 蔡瑞芳, 杨芃原 申请人:复旦大学