专利名称：：土壤中性糖的糖腈乙酰酯衍生毛细管气相色谱分析方法
技术领域：
：本发明涉及土壤碳水化合物的测定，具体地说是一种土壤中性糖的糖腈乙酰酯衍生毛细管气相色谱分析方法。技术背景土壤碳水化合物占土壤有机质的5-25。/()W(Murataetal.1999.SeasonalvariationsinsoilmicrobialbiomasscontentandsoilneutralsugarcompositioningrasslandintheJapaneseTemperateZone.AppliedSoilEcology11,253-259.)，是土壤有机质易变库的重要组成部分，而且是土壤中微生物过程的主要能量来源m(MartensandLoeffelmann.2002.Improvedaccountingofcarbohydratecarbonfromplantsandsoils.SoilBiology&Biochemistry34,1393-1399)。中性糖是土壤碳水化合物的一种，它们对土壤团聚有重要作用[3](Pugetetal.1999.Natureofcarbohydratesassociatedwithwater-stableaggregatesoftwocultivatedsoils.SoilBiology&Biochemistry31,55~63)。土壤中性糖能够被微生物快速代谢，但是它们的降解与它们的存在形式和土壤矿物的性质有关。土壤中性糖与土壤团聚体的结合是以多糖形式存在的f4](RumpelandDignac2006.Gaschromatographicanalysisofmonosaccharidesinforestsoilprofile:Analysisbygaschromatographyaftertrifluoroaceticacidhydrolysisandreduction-acetylation.SoilBiology&Biochemistry38，1478-1481)，因此，了解土壤中性糖的定性和定量组成非常重要。毛细管气相色谱法是分析土壤中性糖的一种常见方法。因为中性糖是非挥发性组分，因此在进行气相色谱测定之前，须将它们衍生为易挥发组分。糖醇乙酰酯衍生法是一种常见的测定土壤中性糖的方法W(Cheshireetal.1990.Labelledandnativesugarsinparticle-sizefractionsfromsoilsincubatedwith"Cstrawfor6—18years.JournalofSoilScience41，29—39)。但此法需大量的准备步骤，尤其是去除还原步骤所用的过量硼酸盐，操作繁琐，消耗时间，不利于日常分析和检测。最近，RumpelandDignae(2006f]将上述方法进行改进，即不用移走过多的硼酸盐，但是，核糖的回收率非常低(只有35%)，且某些糖的变异系数很高。三甲基硅醚衍生法也能用来测定土壤中性糖，Larr6-LarrouyandFeller1997.Determinationofcarbohydratesintwoferralliticsoils:Analysisbycapillarygaschromatographyafterderivatizationbysilylation.SoilBiology&Biochemistry29,1585-1589)。然而这种方法的缺点是每种糖形成两个色谱峰，色谱图复杂，不利于定量分析。Amelungetal(1996)l7](Amelungetal.1996.Determinationofneutralandacidicsugarsinsoilbycapillarygas-liquidchromatographyaftertrifluoroaceticacidhydrolysis.SoilBiology&Biochemistry28，1631-1639)采用O-甲基-肟-三甲基硅垸法来克服形成多重峰的缺点，但只能部分克服多重峰的形成，加之反应产物不稳定，不利于保存W，仍限制了定量分析的可靠性。糖腈乙酰酯衍生法曾被用来测定生物样品中的中性糖和氨基糖问(GuerrantandMoss1984.Determinationofmonosaccharidesasaldononitrile,O-methyloxime,alditol,andcyclitolacetatesderivativesbygaschromatography.AnalyticalChemistry56,633~638)。这种方法比糖醇乙酰酯法操作简单，并且每种糖色谱峰单一，因此也优于三甲基硅醚衍生法。ZhangandAmelung(1996)[9(ZhangandAmelung.1996.Gaschromatographicdeterminationofmuramicacid,glucosamine,mannosamine,andgalactosamineinsoils.SoilBiology&Biochemistry28，1201-1206)建立了用糖腈乙酰酯法测定土壤氨基糖的方法，然而这种方法还没有应用于土壤中性糖的测定。通常土壤中性糖采用硫酸和三氟乙酸(TFA)水解及相应的纯化程序进行纯化[7]。然而当采用糖腈乙酰酯衍生时，哪种水解和纯化程序较合适仍不清楚。
发明内容为了解决现有技术中存在的不足之处，本发明的目的在于提供一种土壤中性糖的糖腈乙酰酯衍生毛细管气相色谱分析方法，并找出适合于糖腈乙酰酯衍生测定土壤中性糖的水解和纯化方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种土壤中性糖的糖腈乙酰酯衍生毛细管气相色谱分析方法，具体步骤如下，(1)土壤样品的水解称取含有4-5mg有机碳的土壤样品，用9-12ml4M三氟乙酸进行水解，水解后，加入IOOng戊五醇溶液振荡摇匀后过滤得水解液；(2)水解液的纯化用氢氧化钾中和水解液，调pH为6.6-6.8，经过离心、旋转蒸发干燥，固体物质用3-4ml蒸馏水溶解，并加入10(Hig肌醇溶液，冷冻干燥，获得干燥样品；(3)样品的衍生采用糖腈乙酰酯法将样品进行衍生；然后进行气相色谱测定。所述水解温度可为103-108。C，时间4-4.5h;滤液用旋转蒸发仪在室温至45。C蒸干，残余物溶解于15-20ml蒸馏水中，并用0.3-0.5mol/LKOH调pH为6.6-6.8，沉淀在2800-3000转/min离心10-15min;中性糖在吡啶-甲醇溶液中，以4-二甲氨基吡啶为催化剂的条件下与盐酸羟胺和乙酸酐发生糖腈乙酰酯反应，所得衍生物可利用气相色谱测定，即可将步骤(3)的样品用体积比l:l乙酸乙酯正己烷溶解后，即可进行气相色谱分析。所述糖腈乙酰酯法将样品进行衍生过程为向干燥样品的衍生瓶中加入290-350pl衍生试剂，加盖密封，在75-80。C下加热25-30min，其间振荡2画5次；冷却至室温后，加入0.9-1.1ml乙酸酐，密封再次加热20-22min，其间振荡2-5次；冷却后加入1.4-1.6ml的二氯甲垸；过量的衍生试剂通过以下两步来去除首先，加入0.9-1.1milmol/LHCl，激烈振摇25-35s后，移走上层液体；其次，与上面步骤相同，用1-1.2ml的蒸馏水洗3-4次，在最后一次洗涤过程中尽可能去除水相，剩余的有机相在40-45t:下用N2吹干后，用200-300^tlv/v=l:1的乙酸乙酯-正己烷混合溶剂溶解后转移至进样瓶中，即可进行气相色谱测定；衍生试剂为4:l的吡啶-甲醇溶液，含有32mg'mL"的盐酸羟胺和40mg-mL"的4-二甲基氨基吡啶。本发明具有如下优点1.重现性好。由于土壤样品成分较复杂，需较多的处理过程，本发明采用内标法(内标为戊五醇)测定土壤中性糖，所得数据准确，重现性好。2.灵敏度高，线性范围宽，其线性范围为10-640吗mr1。3.回收率高，操作快速。平均回收率达到100.1%，且本发明色谱峰单一，所得数据准确可靠。本发明采用的纯化程序和糖腈乙酰酯衍生法操作步骤简单、快速，因此本发明优于糖醇乙酰酯衍生法和三甲基硅醚衍生法，可以满足日常分析的需求。图1:中性糖的气相色谱图，其中a:标样,b:土壤样品1.核糖,2.鼠李糖，3.阿拉伯糖，4.木糖，5.岩藻糖，6.戊五醇，7.甘露糖，8.葡萄糖，9.半乳糖，10.肌醇。具体实施方式下面列举一个实施例，对本发明加以进一步说明。实施例l:按如下步骤测定土壤中性糖的含量。l.l仪器与试剂AgilentHP6890气相色谱仪，配火焰离子化检测器(FID)，DM-1型石英毛细管气相色谱柱(30mx0.25mmx0.25nm)，旋转蒸发仪，冷冻干燥仪，精密加热器，离心机，烘箱，pH计等。8种中性糖标准，如核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖，及内标戊五醇和肌醇都从Sigma-Aldrich公司和Fluka公司购买；盐酸羟胺从Sigma-Aldrich公司购买，4-二甲氨基吡啶从Fluka公司购买；二氯甲垸、乙酸乙酯、正己烷和无水甲醇从Dima公司购买；吡啶、三氟乙酸(TFA)、盐酸和乙酸酐均为分析纯。1.2溶液的配制标准溶液和内标的配制8种中性糖，戊五醇和肌醇的浓度均为1mg/mL。衍生试剂的配制4:l的吡啶-甲醇溶液，含有32mg'mL"的盐酸羟胺和40mg'mi;'的4-二甲基氨基吡啶。1.3供试土壤采用4种不同性质的土壤。红壤采自江西红壤研究试验站，两种黑土分别采自吉林省公主岭(G)和黑龙江省海伦(H)，棕壤采自辽宁省沈阳，4种土壤均为表层土壤(0-20cm)，风千后过250iim筛，基本性质见表l。表1供试土壤基本理化性质(0-20cm)_<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>1.4土壤样品的处理1.4.1水解和纯化一分别称取含有4mg有机碳的上述土壤样品(有机碳含量采用元素分析仪进行测定)放入水解瓶中，加入10ml4MTFA在105。C水解411[7]。水解后，加入100pL的lmg/mL戊五醇溶液(内标)振荡摇匀后过滤。滤液用旋转蒸发仪在45。C蒸干，残余物溶解于20ml蒸馏水中，并用0.4mol/LKOH调pH为6.6-6.8，沉淀在3000转/min离心10min。上清液再次旋转蒸发干燥，固体物质用4ml蒸馏水溶解，然后转移到5ml衍生瓶中并加入10(HiL的lmg/mL肌醇溶液，进行冷冻干燥(8小时以上)。1.4.2衍生分别向上述含干燥样品的衍生瓶中加入300p銜生试剂(4:l的吡啶-甲醇溶液，含有32mg-mL"的盐酸羟胺和40mg'mL"的4-二甲基氨基吡啶)，加盖密封，在75-8(TC下加热30min，其间振荡2-3次。冷却至室温后，加入lml乙酸酐，密封再次加热20min，其间振荡2-3次。冷却后加入1.5ml的二氯甲烷。过量的衍生试剂通过以下两步来去除首先，加入lmllmol/LHCl，激烈振摇30s后，移走上层液体。其次，与上面步骤相同，用lml的蒸馏水洗3次，在最后一次洗涤过程中尽可能去除水相。剩余的有机相在45"C下用N2吹干后，用200|11体积比为l:l的乙酸乙酯-正己垸混合溶剂溶解后转移至进样瓶中，即可进行气相色谱测定。1.5色谱分析梯度升温程序为柱温175'C，保持4min，以4'C/min的速度升温至225°C，保持2min，再以5(TC/min的速度升温至30(TC，保持2min。载气为N2，流速1.2ml/min。进样量为1^1，分流比为30:1。进样口温度为250。C，检测器温度为30(TC，以峰面积内标法定量。本发明中所用的色谱柱为非极性毛细管色谱柱；本实验采用的为DM-1柱，实际上HP-1，OV-l也可以，因为它们都是非极性柱。其中DM陽1，HP-1，OV-l指的是不同厂家生产的柱子。1.6标准曲线，重现性和回收率吸取8种中性糖的标准溶液稀释成一系列含有10、20、40、80、160、320和640叫ml"的溶液，并加入50pL的lmg/mL戊五醇溶液按照上述方法衍生后，进行气相色谱测定。每个样品设3个重复来评价方法的重现性，回收率采用加标回收率法进行评价。其中，戊五醇作为内标一在水解之后加入，肌醇作为内标二在衍生之前加入。2.结果与讨论2.1纯化、衍生和气相色谱技术(1)纯化采用KOH中和TFA水解液，使有机和无机杂质沉淀，然后通过离心去除沉淀。ZhangandAmdung(1996)[9]用无水甲醇溶解氨基糖，而不溶于甲醇的KC1(盐酸与K0H反应生成KC1)通过离心法去除。然而，本发明的试验过程中，加入甲醇时，没有沉淀产生，可能是TFA完全蒸发的结果，因此加入甲醇这步可以省略。通过本发明的纯化步骤之后，获得了较好的色谱峰。说明这种纯化程序适合TFA水解和糖腈乙酰酯衍生。并且本发明的纯化程序比ZhangandAmelung(1996)[9]和Amelungetal(1996)[7]的纯化程序快速且简单。例如Amelungetal(1996)["采用XAD-7吸附树脂和Dowex50WX8阳离子交换树脂来移走有机和无机杂质。(2)衍生本发明的衍生程序比糖醇乙酰酯衍生法快[8]。尽管RumpdandDig皿c(2006)[4]改进了糖醇乙酰酯衍生法，但某些糖的回收率较低，且变异系数较高。且本发明色谱峰单一，因此也优于三甲基硅醚衍生法。(3)气相色谱技术本发明采用非极性柱DM-1来分离8种中性糖的衍生物，非极性与极性柱相比具有柱寿命长和容易清洗的优点。8种中性糖和两种内标的色谱图见图l，都达到了基线分离。保留时间见表2。表28种中性糖和内标衍生物的保留时间(ir)和相对校正因子(i^<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.2线性范围和回收率(1)线性范围本发明8种中性糖的线性范围为10-640吗mr1(7^0.999)。目前已知方法测定土壤中性糖的线性范围还未见报道[7]。8种中性糖标准的平均变异系数小于4.2%(n=3)，仪器的平均变异系数小于2%(n=3)。(2)回收率中性糖相对于戊五醇的回收率见表3。用TFA水解时，8种中性糖的平均回收率为100.1%，说明在整个样品准备过程中，内标与8种中性糖的损失程度是一致的。回收率变异系数的变化范围为1.6-10.6%，且这个变异系数比Amehmgetal(19%)[71报道的数值低。另外，戊五醇相对于肌醇的回收率为85%，说明选用戊五醇作为内标比较合适。此外，实验方法的摸索过程中，本发明研究了硫酸水解中性糖的效果，发现戊五醇相对于肌醇的回收率仅为51%，可能是因为其与BaS04共沉淀的原因(硫酸水解时采用氢氧化钡中和)。另外8种中性糖的变异系数为13-205%,变异系数较大。因此，当采用糖腈乙酰酯衍生法测定土壤中性糖时，硫酸不适合水解中性糖。其硫酸水解中性糖的过程与上述方法不同之处在于土壤样品在lml的12MH2S04室温下水解16h，再用lMH2SO4100。C水解6h(Huetal.1995.Soilcarbohydratesinaggradinganddegradingagroecosystems:influencesofflmgiandaggregates.Agriculture,EcosystemsandEnvironment54,77-88)[1()]。水解后，加入100pg戊五醇(内标)振荡摇匀后过滤。滤液用Ba(OH)2调pH至中性(pH6.6-6.8)，然后以2800-3000转/min离心10-15min去除沉淀。上清液用旋转蒸发仪在室温至45。C蒸干，残留的固体物质用4mL蒸馏水溶解，然后转移到5ml的衍生瓶中并加入100nL的lmg/mL肌醇溶液，进行冷冻干燥(8h以上)。表3TFA水解的中性糖相对于内标戊五醇的加标回收率(means±SD，n=5)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2.3方法的应用采用4种不同性质的土壤对本发明进行验证，测得4种土壤的变异系数为4.6%-7.6%(表4)，在这4种土壤中，中性糖的总含量范围为1622.4-5269.9mgkg"，约占土壤有机质的10%，与Amelungetal(1996)(71和Murataetal(1999产等人的报道一致。阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖在8种中性糖中占主要部分，约占8种中性糖总量的90%，与Angersetal.(1988)[1|](Angersetal.1988.Determinationofcarbohydratecompositionofsoilhydrolysatesbyhigh-performanceliquidchromatography.JournalofChromatography454，444~449)等人的报道一致。表44种土壤的中性糖含量(0-20cm)(means士SD，n=5)_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3.结论总之，本发明涉及一种同时测定土壤8种中性糖的气相色谱分析方法，具有灵敏度高，线性范围宽，重现性好，回收率高，操作快速等优点，可以满足日常分析的需求。109.3士1.693.5±8.2109.7±6.3雨.l±1.7塘醇糖糖,五i路箭岩戊甘葡权利要求1.一种土壤中性糖的糖腈乙酰酯衍生毛细管气相色谱分析方法，其特征在于具体步骤如下，(1)土壤样品的水解称取含有4-5mg有机碳的土壤样品，用9-12ml4M三氟乙酸进行水解，水解后，加入100μg戊五醇溶液振荡摇匀后过滤得水解液；(2)水解液的纯化用氢氧化钾中和水解液，调pH为6.6-6.8，经过离心、旋转蒸发干燥，固体物质用3-4ml蒸馏水溶解，并加入100μg肌醇溶液，冷冻干燥，获得干燥样品；(3)样品的衍生采用糖腈乙酰酯法将样品进行衍生；然后进行气相色谱测定。2.根据权利要求l所述的分析方法，其特征在于水解温度为103-108。C，时间4-4.5h。3.根据权利要求l所述的分析方法，其特征在于滤液用旋转蒸发仪在室温至45。C蒸干，残余物溶解于15-20ml蒸馏水中，并用0.3-0.5mol/LKOH调pH为6.6-6.8，沉淀在2800-3000转/min离心10-15min。4.根据权利要求l所述的分析方法，其特征在于中性糖在吡啶-甲醇溶液中，以4-二甲氨基吡啶为催化剂的条件下与盐酸羟胺和乙酸酐发生糖腈乙酰酯反应，所得衍生物可利用气相色谱测定，即可将步骤(3)的样品用体积比l:l乙酸乙酯正己烷溶解后，即可进行气相色谱分析。5.根据权利要求l所述的分析方法，其特征在于所述糖腈乙酰酯法将样品进行衍生过程为，向干燥样品的衍生瓶中加入290-350pl衍生试剂，加盖密封，在75-80。C下加热25-30min，其间振荡2-5次；冷却至室温后，加入0.9-1.1ml乙酸酐，密封再次加热20-22min，其间振荡2-5次；冷却后加入1.4-1.6ml的二氯甲垸；过量的衍生试剂通过以下两步来去除首先，加入0.9-1.1ml1mol/LHCl，激烈振摇25-35s后，移走上层液体；其次，与上面步骤相同，用1-1.2ml的蒸馏水洗3-4次，在最后一次洗涤过程中尽可能去除水相，剩余的有机相在40-45"C下用N2吹干后，用200-300^1体积比为1:1的乙酸乙酯-正己垸混合溶剂溶解后转移至进样瓶中，即可进行气相色谱测定；衍生试剂为4:1的吡啶-甲醇溶液，含有32mg.mU1的盐酸羟胺和40mg'mL"的4-二甲基氨基吡啶。全文摘要本发明涉及土壤碳水化合物的测定，具体地说是一种土壤中性糖的糖腈乙酰酯衍生毛细管气相色谱分析方法，具体步骤如下，(1)土壤样品的水解称取含有4-5mg有机碳的土壤样品，用9-12ml4M三氟乙酸进行水解，水解后，加入100μg戊五醇溶液振荡摇匀后过滤得水解液；(2)水解液的纯化用氢氧化钾中和水解液，调pH为6.6-6.8，经过离心、旋转蒸发干燥，固体物质用3-4ml蒸馏水溶解，并加入100μg肌醇溶液，冷冻干燥，获得干燥样品；(3)样品的衍生采用糖腈乙酰酯法将样品进行衍生；然后进行气相色谱测定。本发明优点是灵敏度高、精密度和准确度好且操作快速，适合于日常分析和检测。文档编号G01N1/34GK101210864SQ20061015582公开日2008年7月2日申请日期2006年12月29日优先权日2006年12月29日发明者威张,明张,张旭东申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所