专利名称：用于表征清澈和混浊介质中的颗粒的方法和设备的制作方法
用于表征清澈和混浊介质中的颗粒的方法和设备 相关申请的交叉引用根据U.S.C. 119(e)的规定，本申请要求以2005年1月31日提交的第 60/648,513号美国临时专利申请作为优先柏羞础，在此以与本文公开相一 致的程度通过引用的方式将其4^P内容纳入本说明书。关于联邦担〗^研究或开发的声明本发明是在由美国国家卫生研究院(NIH )提供的合同号为 PHS5P41-RR03155号的基金的i^支持下进行的。政府对本发明享有一定的 权利。
背景技术：
在过去的几十年中，光学分析方法已经成为有用并可广泛应用的分析工 具，用于检测和表征各种介质中的痕量组份。在光学分析方法中，电磁辐射 被提供到样本并与该样本的组份相互作用。入射电磁辐射和样本之间的相互 作用产生可被收集和检测的散射、透射和/或发射的电磁辐射。所检测的光 的强度、波长分布、极化状态、散射角度或这些属性的任何组合提供了关于 样本组份的组成、浓度、物理状态和/或化学环境的信息。已经证实的对表 征痕量组份尤其有用的光学分析方法包括吸收和发射光镨技术、Raman和 Mie散射分析方法、磁共振光镨方法以及多维光学频i普技术。的优点。第一，光学分析方法可应用于多种类型的生物系统和生物材料，因 为大多数生物学上有意义的分子(诸如肽、寡聚核苷酸和脂类或它们的聚集 体)会吸收、散射和/或影响在紫外、可见以及红外区域中的电磁辐射的极 化状态。第二，很多光学分析方法，特别是例如荧光标记或红外标签的采用 选择性光标记的技术的方法，提供了识别并表征生物材料的选择性的和灵敏 的方法。第三，光方法经常为非破坏性的表征方法，从而允许分析生物样本 的组份，而不明显影响其生物活性、成分或生理状态。第四，光学分析方法 可提供静态和流动系统中原位实时检测。最后，由于近来能够使用便宜和灵 敏的光电检测器，并且能够在电磁频谱的紫外线、可见和红外区域中的进行 稳定光源操作，从而使得使用光方法的高通量分析在商业和技术上都可以实 行。由于具有这些益处，光学分析方法已广泛用于对生物材料进行识别、分 类和分选。例如，已经证明光流式细胞术可以用于多种试验环境中，包括免疫学应用、DNA分析、功能性分析、细胞分选、细胞和非细胞颗粒的定量分 析以及临床诊断和治疗。在流式细胞术中，将含有细胞和/或非细胞目标颗 粒的悬浮液注射到较快流动的液体流中，其在颗粒周围提供鞘流，从而产生 层流。鞘流要比在^^p为流体动力聚焦(hydrodynamic focusing)的过禾呈中 的样本泵取得更快，它使堵塞程度最小化并精确地将颗粒的样本流聚集到小的分析体积中。颗粒的持续层流空间上分离了颗粒，以^更它们穿过iy企测区域，它们在该区域#^^征。在ib险测区域中，颗粒优选地一次一个与一个或 多个电磁辐射的入射波束(诸如具有选定的波长分布的激光)相互作用，从 而产生被检测为时间函数的散射的、透射的和/或发射的电磁辐射。通常用在常规的光流式细胞术系统中用于表征细胞材料的光学量度包括小角^ 送散射光强度用于表征细胞直径，以;SJE交散射光强度用于确定细胞中颗粒 结构的数量。荧光检测方法广泛用于常规光流式细胞术系统中，特别是与选择性荧光 标记技^M目结合，其中对于穿过光检测区域的每个颗粒，都同时检测对应于 多个波长分布的荧光强度。标记探针和荧光染料过剩、以及染色和插入剂有 助于各种细胞类型和细胞成分的检测。在一些方法中，使用荧光抗体来测量 细胞分析物的具体表面受体的密度，并且因此区别分化细胞类型的亚群。使 用结合光流式细胞术的荧光探针还可以常皿检测并量化细胞内成分，包括 细胞内总DM、 DM或mMA中的具体核苷酸序列、选择的肽和蛋白质以及游 离脂肪酸。因此，光流式细胞术技术使得可以基于大量，而区分个別的细胞，诸 如其在流体流中的位置、大小、颗粒结构的数量以及可检测标记的存在和丰 度。由于这种能力，经常使用光流式细胞仪来产生生物样本中的颗粒幹沐的 诊断性图镨。例如，流式细胞术已经有效地用于在治疗HIV感染期间测量免 疫细胞的下降或维持，并且在癌症患者的诊断和预后过程中用于确定肿瘤细 胞的出现或消失。尽管光流式细胞术对于识别和表征生物样本的成分是一种很有效并且 多功能的技术，但是它具有很多重要的P艮制和缺陷。第一，关于所分析颗粒 的大小，常规光流式细胞仪的动态范围很窄。由于该限制，常常需要多个不 同的流式细胞仪来研究包括不同大小的细胞分布的生物系统。第二，流式细 胞仪的正常运转要求在用于分析的样本中没有细胞团或其它碎片，因为这些 可以阻塞或有害地影响流动细胞的层流条件。因此，样本和鞘流体需要仔细 过滤以防止流阻塞。不以有害方式影响流动条件而又有效地执行必要的过滤 常常是很麻烦的。第三，常规的流式细胞仪包括复杂的装置，这需要受过高 度训练的操作人员以便正确操作。流式细胞仪的对准和校准并不是简单的任 务，并且需要经常执行以获得精确和很好分离开的光学分类。第四，流式细 胞仪的正常运转需要经常清洁流动细胞和冲刷并消毒管道，以防止形成生物 被膜和污染。当使用这些方法来表征包含微生物的样本的时候，清洁和消毒 就特别重要。第五，调查研究的样本在很多流式细胞仪系统中的分析之后就 消失了，因此样本不能用于使用补充技术的进一步分析。i^分析仅仅在几 分钟内可用的样本或m^获取的样本的时候就十分不利。最后，除了其便携 性的明显限制"卜，即^^不能够细胞分类的市售流式细胞仪系统的成本也 相当高，这已经妨碍了这种技术在大的研究和临床机构之外的广泛使用。由上述内容可以发现，4^支术领域当前需要光学方法和设备，用于识别 和表征生物样本中以极少数量存在的样本成分，特别是痕量的样本成分。需 要在被分析颗粒的大小分布、成分和物理状态方面具有大动态范围的光学分 析方法和设备。另外，需要与常规光流式细胞4^目比不太容易形成生物净 和污染物的光学分析方法和设备，并且其不需要对用于分析的样^ii行麻烦 的预过滤。最后，需凓硬宜、简单并且便携式的光学分析设备用于分析生物 样本，其可以由没有经过充Wll练的技术人员操作。发明内容本发明提供了 一种用于分析样本颗粒，特别是以低丰度存在的荧光颗粒 的光学方法、设备和设备组件。本发明提供了扫描共焦显微镜设备以及分析 方法，用于检测、测量透明介质、散射介质和/或不透光介质中的分类颗粒 的浓度，所述分类颗粒包括细胞、微生物、生物学上有意义的分子及其聚集 体和复合体。本发明的方法和设备能够利用短(例如，少于约1分钟)样本 扫描周期对具有较宽的尺寸范围的颗粒进行检测、识别和分类。本发明的目 的是提供光学分析设备和分析方法，所述设备和方法能够检测样本中以极低 浓度(例如阿托摩尔或更低的浓度)存在的颗粒并且能根据物理、化学和/ 或光学特征将其精确分类。本发明的另一个目的是提供不需要样本过滤并且 在分析期间不导致样本丟失或降解的光学分析系统和方法。本发明的又一个 目的是提供可以由没有经过充分训练的技术人员操作的机械简单、机械可 靠、便宜并且十^f更携的光学分析设备。在一个方面，本发明提供了用于分析样本中存在的诸如荧光颗粒的颗粒 的光学分析器以及方法。在本发明的这个方面的一个实施方案中，光学分析器包括用于容纳包含颗粒的样本的至少部分透明的容器；用于产生激发光的 光源，用于收集荧光的装置，用于移动容器的装置以及光电检测器。使用光 学试管(cuvette)，诸如圆柱形试管，作为用于容纳包含颗粒的样本的至少部分透明的容器有益于本发明的这个方面的一些应用。在一个实施方案 中，向样本提供由光源产生的校准激发光，诸如激光或灯。激发光和样本的相互作用使得样本中至少一部分颗粒产生荧光。用于收集荧光的装置，诸如透镜、反射镜光纤光学元件、共焦显微镜或 波导，被定位成与样本光通信，并且被配置以便它从样本内和位于容器中的 观察体积选择性地收集荧光。在可用于分析混浊介质中的颗粒的实施方案 中，观察体积的位置接近(例如，在约500微米内，或一些情况下在约200 微米内)容纳样本的至少部分透明的容器的壁。用于移动容器的装置可^^作 地连接到该容器，以便其能够以通过观察体积传输至少部分颗粒的方式移动 该容器。在一些实施方案中，可用于移动该容器的示例装置能够以对给定样 本扫描周期提供统计独立观察体积的方式旋转和/或转移(例如，垂直转移、 水平转移或两者均有)该容器，并且，可选地，提供用于通过，见察体积一次传输一个颗粒的装置。光电检测器被提供成与收集荧光的装置光通信，并且能够^u见察体积接收焚光，AU见察体积测量荧光的强度以;s^产生荧光的时间曲线。可选地，在样本和光电检测器之间提供一个或多个孔，诸如一个或多 个狭缝，以确保来自观察体积的焚光可被光电检测器检测，而来自其它区域 的相同荧光不被检测。可选地，在光源和样本之间提供激发光滤波器 (filter)和/或在样本和光电检测器之间提供发射光滤波器。在一些实施 方案中，由光电检测器产生的对时间曲线的分析提供了样本中离子的浓度、 大小分布和/或亮度分布的量度。在一个实施方案中，本发明提供了一种光学分析设备，所述光学分析i殳 备结合了新颖的扫描共焦显微镜和具有模式识别算法的处理器，所述处理器 能够对流体样本中以低浓度存在的荧光颗粒进行检测、计数和/或分类。在 这个方面的一个实施方案中，本发明提供了一种用于确定流*本中的颗粒 的浓度的光学分析设备，该设备包括用于容纳流体样本的至少部分透明的容 器、用于产生激发光的光源、共焦显微镜、用于移动容纳样本的容器的装置、 光电检测器以及具有模式识别算法的处理器。在本发明的这个实施方案中， 共焦显微镜被提供成与光源光通信，以便它接收激发光。共焦显艰i镜将'^L 光聚焦于至少部分透明的容器所容纳的样本上，从而使得样本中的颗粒产生 荧光，并且还从样本中的观察体积收集荧光。光电检测器被提供成与共焦显 微镜光通信，从观察体积接收至少部分荧光并且测量其作为时间函数的强 度，从而产生来自观察体积的荧光的时间曲线。在一个实施方案中，在具有 狭缝或针孔区域的光电检测器的前面提供一个共焦孑L,该狭缝或针孔区域提 份沐积范围为大约1 x 10、1113到大约lx 108|111113的观察体积。在一个实施方 案中，共焦孑L是宽度范围为大约1到大约100微米的狭缝。用于移动容器的装置可操作地连接到该容器，以便它能够在光学分析期 间移动该容器。在一个实施方案中，用于移动该容器的装置在光学分析期间 沿选定的轨迹旋转和/或平移该容器，该分析在选定的样本扫描周期期间通 it^见察体积传输(或扫描)包含颗粒的样本，例如，通过在垂直和/或水平 方向上提供容器的旋转和/或位移。可选地，用于移动容器的装置在光学分 析期间旋转该容器，从而系统地改变被分析的颗粒在被传输通过观察体积时 相对于激发光的传播轴的方向。用于移动容器的装置可以提供通it^见察体积 有效传输包含颗粒的样本的该圆柱形或非圆柱形容器的任何方式的运动，可 旋转该容器或提供平移和旋转运动的结合。在一个实施方案中，用于移动容 器的装置为能够旋转、垂直位移和/或水平位移容纳流体样本的容器的马达、 开关电子器件和/或偏心旋转板机构。在一些应用中，优选的移动容器的装 置提供了可选择性调节旋转速度的旋转运动，提供了具有可选择性调节的轨
水平位移。在一个实施方案中，容器的垂直位移速率被选择在大约每秒0. 01 厘米到大约每秒5厘米的范围，和/或容器的旋转it^被选择在大约每秒0.1 转到大约每秒10转的范围。具有模式识别算法的处理器(诸如计算机或其它硬件等同物)被提供成 与光电检测器至少单向通信，用于接收对应于由光电检测器产生的时间曲线 的输出信号。模式识别算法的运算分析该时间曲线，从而确定样本中的颗粒 浓度。在一个实施方案中，模式识别算法将时间曲线中的特征与对应于通过 观察体积的颗粒的时间依赖型荧光强度的预定模式相匹配。在本发明中可用 的预定模式包括作为时间函数的强度分布，并且可以经验性地确定(例如通 过测量对应于,皮充分表征的包含焚光颗粒的样本(例如，包含萸光标记孩沐 的样本)的荧光时间曲线)或从头开始计算。本发明的模式识别算法可以是 较大的数据滤波算法的组件，所述较大的数据滤波算法可识别对应于通it^见 察体积的颗粒的时间曲线的特征。在一些实施方案中，本发明的模式识别算 法和数据滤波算法还能够通过荧光相关频语技术以及光子计数直方图分析 来分析时间曲线。通过在时间曲线中的特征的幅度和形状与预定模式之间建立匹配来识 别离散颗粒检测事件。通过计算与给定样本扫描周期的时间曲线中的特征匹 配的预定模式的数量来确定颗粒的浓度。在一个实施方案中，这是通过在大 矢量的每个点执行最小二乘计算的滤波算法的运算来执行的。该算法计算最 小化局部卡方(chi square)的滤波器最佳幅度，其中该幅^A滤波器强度 的倍数。通过以噪声窗中规定的噪声水平的总和以及说明在大矢量的特定点 处计数的平方根的标准方差的估算来加权原始数据和对预定模式的拟合 (fit)之间的差别，从而计算该卡方。通过在选定的样本扫描周期期间将 匹配的数目除以分析的样本体积iM^分析的时间曲线提取浓度，其可以利用 观察体积的大小、容器的移动速率(例如，垂直和水平位移的速率)以;^样 本扫描周期的持续时间的知识M确计算。利用模式识别的本发明中的数据分析的重要功能性特征在于能够通过 移动(例如，旋转、平移或位移)容纳了被分析的样本的试管来精确校正荧 光和激发光的透射、吸收和/或散射的变化。在一些实施方案中，该校正等 于校正作为时间函数的来自观察体积的背景荧光和/或散射、H光中的变 化。因此，本发明中的模式识别分析增强了使用扫描光学仪器执行的测量的 精确度和再现性，其中样本容器在光照和光分析期间被移动。可选地，模式识別算法的运算基于一个或多个诸如大小、形状以及扩散 速率的物理特性、诸如亮度的光学属性和/或诸如存在荧光和/或荧光丰度和/或关注的带荧光标记的活质分子(例如，肽、蛋白质、脂肪、m-MA、寡核 苷酸或聚集体及其复合体)的化学属性来将样本中的颗粒分类。诸如颗粒大 小分布和颗粒亮度分布的颗粒集合的特征是通过分析与时间曲线中的特征 相匹配的预定模式的强度分布的幅度和形状来确定的。与时间曲线中的特征 相匹配的预定模式的宽度，例如半高全宽，可以与观察本积中的颗粒的驻留 时间(residence time)正相关。替代地，穿过观奮本积的颗粒的大小可以 通过将预先选择模式的宽度改变为时间曲线中的定量匹配的特征来确定。在 另一个实施方案中，时间曲线的特征的积分亮度和/或与时间曲线中的特征 相匹配的预定模式提供了颗粒的物理、光学和/或化学特性的测量，诸如观 察区域中的颗粒的大小和形状。使用用于分析荧光数据的模式识别算法是有益的，因为它提高了灵敏度 并扩展了本发明光分析方法和设备的功能性能力。首先，使用模式识别算法 允许利用少于一分钟的样本扫描周期来险测浓度低至10个颗粒/毫升的具 有低亮度的颗粒。相比于常规的扫描共焦显微镜方法，这提供了大约108倍 的灵敏JL提高。其次，本发明的模式识别算法允许基于具有约10%的任意精 度的大小来对颗粒进行分类。另夕卜，使用具有模式识别算法的处理器提供了 能够基于大小在很宽的大小动态范围，诸如从大约250纳米到数十微米的范 围内对颗粒进行分类的大小分析方法。最后，模式识别算法还提供了基于其 它重要颗粒属性的精确颗粒分类，这些颗粒属性诸如扩散常数、形状、亮度 以及成分。该数据分析方法的另一个优点在于，通过模式识别用于分析的预定模式 及其在这样的分析算法中的使用并不十分依赖于颗粒成分或颗粒分散于其 中的介质的成分。在本发明中，浓度测量包含识别颗賴验测事件的数量以及 确定在样本扫描周期期间扫描的样本的净体积。颗趟农测事件是通过将预定模式与来自观察体积的荧光的观察到的时间曲线的特;M目匹配来识别的。本 发明的预定模式能够被缩放、标准化和/或校正，从而利用样本中存在的颗 粒的类型和包含颗粒的介质的物理属性，诸如密度和离子强度的知识，在经 验上或理论上来说明样本中颗粒的传输速率和扩散中的差别。因此，本技术 允许在不需要严重依赖于经过了分析的系统的精确属性的复杂校准程序的 情况下来确定颗粒的浓度。在颗粒分类的情况中，本方法和设备采用关于与 时间曲线中的特树目匹配的预定模式的幅度和形状的校准程序。例如，颗粒 的大小可以由其通过共焦体所花费的时间来推导。原则上，给定狭缝的大小、 光学倍率以及旋转速率，就可以获得该大小而不需要先验的校准。然而，在本发明中也可以使用利用已知大小的颗粒进行的校准。共焦显微镜和用于移动容纳样本的至少部分透明的容器的装置的结合提供了 一种用于将相当大体积(例如，毫升)的流^v^送穿it^见B积 而不需要使用流动系统的有效手段。在该说明书的上下文中，术i吾扫描指的 是传导或运送包含颗粒的样M过共焦显微镜的观察体积，以《更可以光学地 检测和/或表征颗粒。另夕卜，在本说明书中的扫描还可以指透明容器的移动， 以便例如通过旋转样本容器，使观察体积中的颗粒的位置关于激发光的光轴 而变化。在本发明的一个实施方案中，容器被同时旋转并垂直位移以提供经 过了分析的样本的扫描。容器的垂直位移产生使颗粒穿过》见察体积的容器的 轨迹，并确保了在样本扫描期间被分析的扫描样本体积在统计学上是独立 的。在本说明书的上下文中，关于由本设备和方法分析的观察体积的"统计 学上独立"指的是这一事实，即在后续扫描期间在相同配置中观察到相同颗 粒的概率非常小(例如，低于O. 01%),并且在一些情况下可忽略(例如， 低于0.0001%)。除了将颗粒传送穿过观察体积之外，容器的旋转还系统性 地改变了颗粒关于激发光的光轴的位置，从而提供了一种在光学检测期间扫 描颗粒位置的手段。因此，在光学分析期间容器的旋转提供了一种表征颗粒 的手段，其作为关于激发光的传播轴的观察区域中旋转位置的函数。具体地， 容器的旋转允许从多个光学透视(即，穿过颗粒的轴)来表征颗粒，其提供 了关于颗粒大小、形状以及成分的附加信息。圆柱试管的较慢的垂直反转(大 约2. 5至5厘米/秒)和旋转(大约5至10转/秒)的结合提供了对测量在 亚阿托摩尔浓度下的样本中颗粒浓度并且将它们关于大小分类的有用的容 器城。在光学分析期间传送穿过观察体积(例如，通过旋转、垂直位移和/或 水平位移)的流体样本的净体积取决于扫描周期的长度，和容纳样本的容器 的运动速率以及观察体积的大小。观察体积的大小是由共焦显微镜中采用的 共焦孔的大小，特别是位于样本和光电检测器之间的共焦孔的大小来控制
的。较小的观察体积有益于增加信号背景比，并且确保了颗粒穿过观奮沐积 并且每次检测一个。然而，使用较小的观g积需要更长的样本扫描周期来 分析与使用较大的观察体积的系统中所分析的相比等同的净样本体积。因 此，观察体积和样本扫描时间的选择表示了这些设备性能和属性之间的折 衷。在一些应用中，最好的折^A使用提供所关注颗粒的表征和精确检测的 最大的共焦孔。通过增加观察体积(使用更宽的共焦孔)，对于给定运行时 间所扫描的总体积就更大。替代地，经过了光学分析的样本可以在分析之前 被稀释，以获得确保颗粒每次一个地被运送穿过检测体的浓度。当表征在高 度散射或吸收介质中分軟的颗粒时，样M释也是有用的。在光学分析期间用于扫描样本的设备组件的组合对本发明的这个方面 的方法和设备提供了多个实际好处。第一，结合用于移动样本容器的装置来 使用共焦显微镜，提供了 一种用于将颗粒传送穿过观察区域同时不需要产生 流体流的手段。结果，经过了分析的样本并不要求如同在光学流式细胞术系 统中那样的大范围预过滤以防止与样本流和阻斜目关的问题发生。另外，样本不从设备的内部运转，从而使得本分析系统较不易受到与污染物、细 菌生长和生物被膜形成相关问题的影响。而且，样本在光学分析期间没有被 丢失、毁坏或退化，从而允许样本在通过方法的检测和表征之后进行附加 的以及补充的分析。第二，使用共焦显微镜使得能够使用小至皮升的很小的 观察体积，其对确保颗粒每次一个地穿过观察体积并且改善信噪比是4艮有用 的。然而，容器的垂直位移和旋转允许使用诸如扫描周期等于大约l秒至大 约100秒的相对短的样本扫描周期来表征诸如样本体积等于大约1毫米至 10毫米的大体积样本。第三，使用共焦显微镜允许选择光照焦点，以便使 观察区域位于相对接近于(例如，大约50微米至大约500微米)容纳样本 的容器壁的位置。这一特征允许适用本设备和方法来有效地分析部分透明和 /或高度散射介质例如混浊介质的成分。第四，结合用于移动样本容器的装 置使用共焦显微镜提供了这样一种手段，用于使容纳颗粒的样本传送穿过观 察区域而不需要包括可移动光学组件的复杂光学系统，诸如平移光源、光电 检测器或分色镜。本发明的这个方面是有利地，因为它提供了一种不需要在 扫描之间重复的光学再对准的简单、机械上坚固可靠的试验系统。在另一个方面，本发明提供了用于选择性，测并测量流*本中的颗 粒浓度的方法和设备，以及能够区别具有不同物理属性和/或化学属性的颗粒的光学分析方法和诏:备。在本发明的这个方面的一些实施方案中，通过利 用可以与样本的特异性组分(共价或非共价地)选择性结合的一个或多个荧光探针来处理样本来提供检测特异性，所述荧光探针诸如荧光染料、着色、 共价标签和/或插入剂，所述样本的特异性組分诸如表面结合位点、细胞间 或细胞内蛋白质、肽、寡核苷酸，或它们的任何聚集体或复M。例如，本 方法和设备非常适于分析已经被可与样本的不同組分选择性结合的多个不 同荧光探针处理过的流体样本，所述荧光探针诸如核酸荧光团以及荧光抗 体。在这个实施方案中，利用不同波长分布的光同时或顺序^Ui并且以多个 不同波长进行荧it^测，使得可以进行区别检测并对与一个或多个荧光探针 选择性结合的样本中的颗粒进行定量。替代地，基于穿过观察体积的颗粒的 扩散常数，本发明的一些方法和设备提供了检测特异性。在本发明的这些实 施方案中，分析了观察得到的荧光的时间曲线中的特征的强度分布，以确定 与检测颗粒相关的扩散常数。例如，在一些例子中，时间曲线中的特征宽度 或与时间曲线中的特征匹配的预定模式与观察体积中颗粒的驻留时间或扩 散常数正向相关。由于不同类型的颗粒(诸如不同大小、形状或电荷的颗粒) 具有不同的扩散常数，所以本发明的这个功能能力提供了一种用于区别样本 中不同颗粒类型的手段。替代地，基于测量颗粒亮度，本发明的一些方法和 设备提供了检测特异性。在这些实施方案中，测定了时间曲线中特征的总积 分强度，并用于区别不同类型的颗粒。例如在一些例子中，本发明的这个方 面提供了一种基于诸如蛋白质、肽、脂类以4核苷酸的具体生物分子的出 现或丰度来区别诸如细胞或微生物的颗粒的手段，所述具体生物分子选^^地 与加入到样本中的一个或多个荧光探针相结合。在另一个方面，本发明提供了多信道光学分析器，它能够同时或独立监 测来自与被传送穿过观察区域的颗粒相结合的多个不同荧光探针的荧光。在 一个实施方案中，多个光电检测器、波长区别元件以;M目应的共焦孑W皮提供 成与共焦显微镜光通信，并且向用于分析的流^#本中提供具有不同 _和 /或发射波长的多个荧光探针。选择每种荧光探针的成分，以使其选择地与 样本中目标物质相结合，例如通过使用可选择地结合到不同的表面结合位点或细胞内蛋白质或肽的多个不同核酸荧光或荧光抗体。从一个或多个光源的 光的皿使得标记有一个或多个探针的颗粒发出荧光。荧光的强度和波长分 布取决于与颗丰y目结合的荧光探针的丰度和特性，因此可以用于基于成分对 颗粒分类。多个光电检测器备有波长区别元件，诸如光滤波器、ib断、棱镜、 单色仪或分色反射镜，以便每个都能够检测M定的荧光探针产生的荧光， 而不检测从与颗丰対目结合的其它荧光探针产生的荧光。因此，在这个光配置 中的每个光电检测器都独立产生对应于选择的荧光探针的来自观察体积的 荧光的时间曲线。本发明的这个实施方案另一有益的，因为可以用发射光位于 电磁频镨的不同区域中的多于一个的荧光探针来标记目标颗粒，所以该实施 方案提供了很好的检测特异性，。对一致检测事件的两个或多个光电检测器 的输出结果进行分析，使得可以进行区别检测并对目标颗粒进行定量。在另一个方面，本发明提供了多信道光学分析器，其中提供了多个光电 检测器，每一个具有不同大小的与共焦显微镜光通信的共焦孔径(例如狭 缝)。在这个实施方案中，光电检测器检测来自具有不同有效焦距体积的观4察体积的光。在本发明中同时分析的观察体积可以被定位以便重叠，并JL^ 一些实施方案中被集中布置。对应于不同有效焦距体积的观察体积的荧光时 间曲线的同时分析有助于更精确地解析样本中颗粒的大小分布，因为颗粒的 大小将改变通过共焦狭缝的通行时间。可以使用不同的共焦孔径来更精确地 确定颗粒的大小和/或亮度。而且，使用本实施方案的多信道系统可以确定 颗粒沿光轴方向的位置。本发明还包括采用统计分析方法的方法和设备，所述统计学方法可以与 模式识别分析技术一起使用或替代模式识别分析技术使用。例如在一个实施 方案中，本发明提供了如下设备和方法，其中通过光子直方图分析算法的运 算产生检测光子的直方图，从而分析观察到的时间曲线。使用该分析方法获得的光子计数直方图可表;^u见察体积发出的荧光波动的幅度分布，并且与 概率分布相关，可以检测每采样时间内的给定数量的光子。对于荧光颗粒的某一种类而言，光子计数直方图可以通过两个M来表征观奮沐积中的颗 粒的平均数以及颗粒亮度，颗粒亮度被定义为每个颗粒在每个采样时间内检 测到的光子的平均数。另外，如果各荧光种类具有间隔足够大的亮度量级， 就可以使用光子计数直方图分析来区别样本中出现的不同荧光种类。替代 地，本发明提供如下设备和方法，其中通过荧i^目关分析算法的运算来分析 观察到的时间曲线。本发明的示例性荧i^目关分析算法确定荧光波动的时间 自相关，这提供了作为时间函数的荧光波动的持续时间的量度。这种分析提 供了关于观察体积中分子数量的信息，以及确定观察到的荧光中波动的方法
和員，诸如被检测颗粒的扩散常数和扩M率。在另 一个方面，本发明的光学分析设备和方法能够基于从穿过观察体积 的颗粒的荧光强度曲线导出的控制信号来进行闭环反馈控制。本发明的这个 方面提供了如下光学分析方法和设备，其中可以多次检测和表征流体样本中 的选定颗粒。在本发明的这个方面的实施方案中，通过沿选定的容器轨迹平 移容纳样本的容器，来运送包含颗粒的样本穿过观察体积。收集来自观察区域中的颗粒的荧光，从而产生时间曲线，由处理器对时间曲线进^亍实时分;f斤。 处理器具有用于分析时间曲线的模式识别算法，并且被提供成与能够选择性 调节移动容器的轨迹的控制器至少单向通信。通过分析时间曲线而实时测定 颗粒的特征，并且作为提供给控制器的一个或多个控制信号的基础。在一个 实施方案中，提供给控制器的表示新的容器轨迹的控制信号能够使选定的颗 粒在样本扫描周期期间多次穿过观察体积。例如，被检测颗粒的物理或化学 特性可能表明需要进一步的光学分析以明确分类颗粒，因此，处理器产生控 制信号以起动一次能够使目标颗粒穿过观察体积的经修正的容器轨迹，从而 提供一个或多个另外的颗粒检测事件。本发明还提供了能够对引入经过光学分析的流体样本中的离子浓度进 行积分测量的积分颗粒测量系统。在本发明的这个方面，容纳样本的容器可 操作地连接到将颗粒引入样本的装置。例如在一个实施方案中，在容器上连 接一个试管，用于在光学分析之前或期间使气体起泡穿过样本或持续或滴状 地引入流体。流体引入系统可以连接到能够向样M供包含颗粒的液滴的容 器。在这些实施方案中，颗粒被连续或^t地系统提供给容器。本发明的光 学分析设备周期性地或连续地探测样本，从而提供作为时间函数的样本中的 颗粒的表征。例如在一个实施方案中，本发明的积分颗粒测量系统可以测量 流体样本中积累的颗粒的浓度、大小分布、成分、亮度或者这些特征的任何 组合。本发明的这个方面对于检测环境样本中的病原体和/或污染物特别有 用，所述环境样本诸如室内空气或水中样本。本发明的方法和设备可广泛应用于对共焦显微镜的观察体积中的通过 光致发光、化学发光和/或电致发光过程而发光的颗粒进行光学分析。例如， 本设备和方法可用于对能经历化学发光和/或生物发光的颗粒进行识别、分 类和/或确定其浓度。在本发明的这些方面，不需要向样本^:供激发光就可 以收集、检测和分析来自穿过共焦显微镜的观察体积的颗粒的发射。本发明 方法中的荧光可由单光子吸收过程或多光子吸收过程^L^。本方法中通过使 用诸如两个光子激发方案的多光子激发所提供的优点是在很小的观察体积 内具有强^A够大的'M光，能产生适当的多光子吸收，从而4吏得由，见察体 积中产生的荧光可以净皮收集、检测和分析。本发明方法和设备可用于表征包括各种材料的样本，这些材料包括但不 限于液体、胶体、分散悬液、乳状液，溶胶以及混合物。本发明方法和i殳 备可用于检测高度透明介质、部分透明介质以及高度散射介质中的自然发焚 光的组分或带荧光标记的组分。本发明提供了特别适于分析生物样本的非破 坏性的光学分析方法，所述生物样本诸如体液、组织悬液、食物以及饮料、 从诸如重组细胞表达系统的表达系统产生的流体，以及这些样本衍生的样 本。本方法能够检测和分类低浓度的生物材料，包括但不限于原核细胞， 真核细胞，细菌，病毒，诸如蛋白质、肽、寡核苷酸、DM、 mRNA、脂类的 生物分子，以及它们的所有聚集体和复合体。通过本设备和技术可分析的材 料成分的高度多样性使得它们适用于宽范围的用途，包括但不限于表征细 胞材料和孩￡生物、识别生物样本中存在的生物分子、分析食物中存在的物质、 样本中的病原体的检测、用于临床诊断和治疗应用的生物样本的化验、样本的高通量定量分析以及用于监测蛋白质表达水平的功能测试。在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于分析样本中的颗粒的方 法，包括下列步骤(1)在至少部分透明的容器中提供包含颗粒的样本；(2) 将激发光导向至样本，从而使得样本中的至少一部分颗粒产生荧光；(3) 收集来自样本的观察体积的荧光，并且将来自观察体积的荧光导向至 光电检测器；(4 )移动容器，从而使样本中的颗粒穿过观察体积；以及(5 ) 使用光电检测器测量来自观察体积的作为时间函数的荧光的强度，从而产生 与来自观察体积的荧ibN应的时间曲线。可选地，本发明的这个方面的方法 还可以包括使用模式识别算法分析时间曲线的步骤。在另一个方面，本发明提供了 一种用于测定包含颗粒的样本中的颗粒浓 度的方法，包括下列步骤(1)在至少部分透明的容器中提供包含颗粒的 样本；(2)将激发光导向至与包含颗粒的样本光通信的共焦显微镜；(3) 使用共焦显微镜将激发光聚焦到样本上，从而使得颗粒产生荧光；(4)使 用共焦显微镜收集来自样本中的观察体积的荧光；(5 )平移容器，从而使 样本中的颗粒穿过观察体积；(6)使用定位成与共焦显微镜光通信的光电 检测器，测量来自观察体积的作为时间函数的焚光强度，从而产生与来自观察体积的荧ibf目应的时间曲线；以及(7 )使用才莫式识别算法分析时间曲线， 从而由时间曲线测定样本中颗粒的浓度和大小。
图1A提供了本发明的用于测量流##本中荧光颗粒浓度的光学分析设 备的俯视图的示意图。图1B示出了包括圆柱形试管的容器的放大侧视图， 并且i^示了可用于本发明的一些方法中的一致旋转轴和垂直位移轴。图2提供了本发明的光学分析设备的照片，包括结合了具有模式识别算 法的处理器的扫描共焦显樣支镜。图3示出了使用光学分析器产生的移动穿过观察体积的颗粒的示例性 焚光时间曲线。图4A示出了由光学分析器产生的时间曲线(上图)以及与时间曲线的 特树目匹配的相应预定模式(中图)，图4A还示出了与时间曲线相匹配的 每个模式的相关卡方值(下图)。图4B提供了显示时间曲线中观察到的特 征(曲线A)和适合匹配该特征的预定模式(曲线B)的重叠图。图4C示出 了放大比例的单个模式的强度分布，并且图4D显示了对不均匀样本进行分 析获得的大小分布。图5提供了本发明的多信道光学分析器的示意图。图6提供了说明本发明的示例性模式识别算法中的步骤的功能流應图。图7示出了本发明的设备和方法对包含荧光球体的样本产生的示例性 光子流直方图。图8示出了本发明的设备和方法对包含荧光球体的样本产生的作为颗 粒浓度函数的总计数(荧光时间曲线中的"^值)图。图9示出了用本发明方法对包咱、体细胞的牛奶样本产生的示例性光子 流直方图。图10示出了使用本发明方法和设备产生的作为体细胞浓度的函数的总 计数(阈值附近的荧光时间曲线中的"^值)图。图11示出了使用采用模式识别数据分析的本发明光学分析设备的浓度 -稀^^度研究的结果。图12示出了4艮据细菌的显著衰减焚M焚光时间曲线产生的校准。
图13提供了幅度直方图(即强度分布)，表明了本发明方法基于颗粒 的强度分布对颗粒分类的能力。图14A和14B分别示出了对照样本和AD样本的焚光时间曲线。图14C 示出了从3维扫描产生的类似3维图像，示出了大荧光寡聚物的数量(拉长 的白点)。图15提供了对照样本和AD样本的聚集体浓度和大小的相关图。 图16A-16D示意说明了使用本发明中的多狭缝共焦孔用于测定观察体 积中的颗粒位置。图16A和16B示意图示了使用单狭缝共焦孔的本发明的实 施方案，并且图16C和16D图示了使用双狭缝共焦孔的本发明的实施方案。
具体实施方式
参照附图，类似的标号表示类似的元件，并且在多于一个附图中出现的 相同的标号指的pl:相同的元件。另外，此后，应用下列定义"流体"和"流*本"同义使用，并且指的是能够符合容纳它的容器 的形状的任何材料。本发明的方法中可使用的流体包括但不限于液体以及 多于一种液体的混合物，诸如泡沫、乳状液、溶胶的^^体，颗粒的分歉系， 颗粒悬浮液，以及它们的任何組合。本说明书中的流体包括生物流体，诸如 尿、血、脊髓液、细胞和非细胞血成分(包括血浆、含血小板样本、包含红 细胞的样本、包含白细胞的样本、組织提取物和组织悬液)、食物、由重组 技术产生的发酵介质、由重组技术产生的材料(包括治疗和诊断材料)、由 转基因动物和转基因植物生产的材料(包括治疗和诊断材料)、牛奶和奶产 品、水、々欠料、化学和制药产品以及疫苗。"颗粒"指的是样本中存在的可溶解的以及不可溶解的材料。本说明书 中的颗粒包括但不限于分子、离子、聚合物、生物分子、诸如真核细胞和 原核细胞的细胞、细胞组分、诸如细菌和病毒的微生物、病原体以及它们的 所有组分、复合体和聚集体。"生物分子"指的是由生物体产生或对活生物 体重要的分子，包括但不限于蛋白质、肽、肽激素、脂类、DM分子、RNA 分子、寡核苷酸、碳水化合物、多糖；糖蛋白、脂蛋白、糖，以及它们的衍 生物、变体、聚集体及复合体，包括具有一个或多个荧光标记的这些分子的 被标记类似物。"荧光颗粒"指的是被亂发光齓&时能够产生荧光的颗氺立， 并且包括固有荧光颗粒和利用其与一个或多个荧光团的相互作用(共价的和 非共价的)而发荧光的颗粒，包括荧光标记颗粒、有色颗粒(stained particle )、荧光标签颗粒以及与插入剂或染料相连的颗粒。荧光颗粒可以 与单个荧光团或多个荧光团相连。可以用可选择性结合颗粒的具体类型或这 类颗粒的具体元素的荧光团对荧光颗粒选择性地标记或标签，上述类型的颗 粒诸如蛋白质和/或寡核苷酸。"焚光时间曲线"指的是作为时间函数的荧光强度的分布。荧光时间曲 线中的"特征"是指时间曲线中以作为时间函数的强度变化为特征的的部分， 对于一些应用而言，"特征"优选地指作为时间函数的强度在统计学上显著 的变化。荧光时间曲线的特征可能是由于一个或多个颗粒存在于和/或通过 本发明设备和方法的观察体积而造成的。"光通信"以及"光耦接"在本说明书中同义使用，并且指的是两个或 多个设备元件的结构，其中光能够从一个元件传播到另一个元件。这些设备 元件可以直接被光耦接或使用各种设备组件而间接被耦接，所述各种设备組 件包括但不限于波导、光导纤维元件、反射器、滤波器、棱镜、透镜、光 栅，以及这些i殳备组件的4壬^r组合。术语"强度"和"多个强度"指的是电幅度或光的磁场矢量，所述光诸 如激发光或荧光。术语"强度，，和"多个强度，，可以互换使用，是指在检测 光的时候由光电检测器产生的信号的幅度，例如由光电二fe管或光电倍增管 产生的电流的幅度。术语"电磁辐射，，和"光"在本申请中,皮同义使用，并且指的是电波或 磁场波。可用于本发明的设备和方法中以激发荧光颗粒的电磁辐射包括紫外 线光、可见光、近红外线、远红外线，或这些光线的组合。"部分透明"指的是能够传输至少部分入射其上的电磁辐射的材料、设 备或设备组件的属性。"平移"指的是设备或设备组件的位移，诸如容纳用于分析的样本的至 少部分透明的容器的移动。平移可以包括任何类型的运动，包括但不限于， 垂直位移、7jc平位移、圆形轨道运动、椭圆轨道运动、抛物线运动、直线运 动，以及这些运动方式的任何组合。平移可以提供周期或非周期运动。"预定模式"指的是作为匹配或拟合时间曲线中的特征的时间函数的强 度分布的函数形式。用于匹配特征的预定模式可以由从头开始的方法导出， 诸如使用经适当换算或标准化的高斯函数或洛伦兹(Lorentizian)函数，
或可以例如通过测量与穿过观察体积的已知大小、形状和亮度的颗丰立的通过 相对应的强度分布而经验性地导出。预定模式可以被换算、标准化或调节， 以优化预定模式与荧光时间曲线中的特征的匹配。在本发明中有用的预定模 式的函数形式取决于光检测和表征系统的特征性试验^lt，包括但不限于， 狄和检测光学的对准以及位于光电检测器前面的孔的宽度。另夕卜，在本发 明中有用的预定模式的函数形式还可以取决于被检测和/或表征的颗粒的特 性，诸如相对于共焦显微镜的点传播函数的体积的颗粒的大小、颗粒的形状 以及颗津立的亮度。在下面的描述中，阐述本发明的设备、设备组件和方法的多个具体细节， 以便提供本发明的确切本质的透彻解释。然而，对本领域的普通技术人员显 而易见的是，没有这些具体细节仍可以实施本发明。本发明提供了用于检测、识别、分类和表征流^#本中的颗粒的方法和 设备。具体地，本发明提供了使用模式识别数据分析技术的扫描共焦显微镜 设备，用于测量以很低浓度存在的焚光颗粒的浓度，以及用于基于大小、形 状、扩散常数和/或组分表征荧光颗粒。图u提供了本发明的用于测量流体样本中的荧光颗粒浓度的光学分析 设备的俯视图的示意图。光学分析设备IOO包括光源110、共焦显樣i镜120 以及用于容纳包含颗粒的流体样本135的至少部分透明的容器130，诸如光 学试管，用于移动容器的装置140、光电检测器150以及具有模式识别算法 的处理器160。在图1A示出的实施方案中，共焦显微镜120包括瞄准元件 (例如针孔或狭缝)170、分色反射镜180、笫一物镜190、第二物镜200和 共焦孔210 (例如针孔或狹缝)。可选地，光学分析设备100可以进一步包 括发射滤波器212、氣义滤波器214、 转换器220、显示器230以及设 备控制器240。光源110产生氣t光(由点线300示意表示)，其被提供到共焦显微镜 120。激发光可选地通过瞄准元件170，从而产生射向分色镜180的准直激 发光。至少部分准直激发光穿过第一物镜190，其将激发光聚焦到样本135。 聚焦的激发光至少部分穿it^器130的壁，并且聚焦在位于样本135内的小 观察体积270中。提供到样本的激发光300激发荧光颗粒，其产生荧光。来 自观察体积270的荧光的一部分(由虚线310示意表示)被共焦显微镜120 收集并提供给光电检测器150，其测量作为时间函数的荧光310的强度。尽 管荧光310通常沿与激发光300的传播轴一致的传播轴传播，但是为了描述 这些图，图1A (以及图5)中将荧光310显示为稍微偏离'^t^光300，以便 将激发光与荧光区别开来。在图1A所说明的实施方案中，来自观察体积270 的荧光310被分色反射镜180反射，通过第二物镜200以及共焦孔210，并 且在光电检测器150的感应表面(例如光电阴极或光电二&管)上成像。使 用共焦孔210以防止不是从第一物镜的共焦平面产生的荧光到达光电检测 器150的感应表面。本发明包括不具有瞄准元件170的实施方案，特别当光 源110包括提供不需要进一步瞄准的空间准直激i光束的激光器时。在光学分析过程中，用于移动容器的装置140沿选定的轨迹移动容器 130,从而将包含颗粒的样本传送穿过观察体积270。对于一些应用，优选 地，颗粒被一次一个地传送进和传送出观察体积。在图1A所说明的实施方 案中，用于移动容器的装置140绕穿it^器中心并且与激发光的传播轴相交 的旋转轴旋转容器130，同时沿诸如基本平行于或一致于容器140的旋转轴 的轴垂直位移容器130。容器130的旋转通过箭头350示意说明，并且容器 130的垂直位移通过箭头360示意说明(参见图1B)。图1B示出了包括圆柱形试管的容器130的放大侧视图。图1B还示出了 样本135中的观察体积270。图1B中还示出了旋转-垂直位移轴385和滋义 光的传播轴384。如箭头350和360所示意表示的，容器130同时绕旋转-垂直位移轴385旋转和沿旋转-垂直位移轴385垂直位移。容器的旋转和垂 直平移的结合将包含颗粒的样本传送穿过观察体积270,并且系统地改变观 察体积270中的颗丰ijf目对于激发光的传播轴384的位置。在可用于优化与测 量的荧光强度相应的信噪比的实施方案中，旋转速率和/或垂直位移是可选 择性调节的。本发明包括下述实施方案，其中容器130的移动方式不^^走转 和垂直位移相结合的方式，而包括水平位移与旋转或垂直位移相结合，或者 水平位移与旋转和垂直位移相结合的平移方式。可选地，激发光300穿过位于光源110前面的激发滤波器214，氣发滤 波器214能够传输可^L^样本中颗粒的光波长，并且能够基本上阻止与M 荧光颗粒产生的荧光310相应的光波长的传输。可选地，荧光310穿过位于 光电检测器15 0前面的发射滤波器212 ，发射滤波器212能够传输与焚光310 相应的光波长，并且能够基本上阻止与样本中荧光颗粒的激发波"M目应的光 波长的传输。可选地，分色反射镜180能够诸如通过优选传输激发光300并 优选反射荧光310来区别波长。由'激发滤波器214、发射滤波器212、分色 反射镜180或者这些光组件的任何组合提供的波长区别增强了光学分析设 备100在检测、测量颗粒的浓度以及分析颗粒方面的总体灵敏度。荧光310的强度由光电检测器150作为时间函数检测，从而产生来自观 察体积270的荧光的时间曲线。在图1所示的实施方案中，由m转换器 220将对应于光电检测器150的光电流的输出信号#拟信号转变为数字信 号，并且输出信号被送到处理器160，诸如具有模式识别算法的微计算机。 图1中所示的箭头表示从光电检测器150产生的输出信号的通信。模式识别 算法的操作将预定模式与时间曲线中的特征匹配，并JME给定的样本扫描时 间内对匹配数量计数。用于匹配特征的预定才莫式可以通it^头开始的方法导 出，诸如使用经适当换算或标准化的高斯函数或洛伦兹函数，或可以诸如通 过测量与穿过观奮本积的具有已知大小、形状和亮度的颗粒的通^目对应的 强度分布而经验性地导出。由于匹配预定模式的特征对应于在样本中被检测 的颗粒，所以可以利用在给定样本扫描周期内穿过观务沐积的样本净体积的 结果来实现对颗粒浓度的测量。在一个实施方案中，在给定样本扫描周期内 穿过观察体积的样本净体积是通过用给定样本扫描周期内的容器130轨迹 的净长度乘以共焦显微镜120的点传播函数的体积。使用具有的点传播函数 体积约等于lxl0VW的共焦显微镜，以及1分钟数量级的样本扫描时间， 使得穿过观察区域的净体积为毫升数量级。在一些应用中，优选使用具有点 传播函数的体积范围在1 x 105 jam3至大约5 x 1()7jum3之间的观察体积。本发 明的模式识别算法可以是数据滤波算法的组件，所述数据滤波算法能对与穿 i^见察体积的颗粒的通it^目对应的时间曲线中的特征进行识别并计数。可选地，模式识别算法的运算还基于大小和/或形状对观察中的颗粒分 类。在一个实施方案中，通过评估与时间曲线中的特似目匹配的预定模式的 幅度和形状来实现分类。例如，与时间曲线中的特斜目匹配的预定才莫式的宽 度与观察体积中的颗粒的驻留时间、颗粒的大小、颗粒的形状或颗粒的扩散 常数相关。可选地，模式识别算法的运算还通过测定与时间曲线中的特似目 匹配的预定模式的总积分强度，基于颗粒的亮度对观察体积中的颗粒进行分 类。在一些例子中，基于亮度的对颗粒的区分提供了与结合到选择性荧光标 记的分子的身份和丰度相关的信息，所述选择性焚光标记诸如荧光抗体标签 或荧光DM探针。
可选地，模式识别算法的运算还例如通过4^供诸如卡方值的表示每个匹 配特征的统计学显著性的M，产生表征预定模式对观察到的时间曲线的拟 合质量的一个或多个统计学指标。在一个实施方案中，本发明的才莫式识别算 法利用每个测量的标准差估计，通过对特征和与该特征匹配的预定模式之间 的差别进行加权，来计算每个匹配的卡方。可选地，模式识别算法的运算还 能以很容易由操作人员进行评价的格式产生可以表示处理数据和结果的输 出，所述处理^t据和结杲例如诸如颗粒浓度、颗粒的大小分布和/或颗粒的 亮度分布。例如在一个实施方案中，模式识别算法产生一个直方图，显示与 最大强度或匹配特征的总积分强度相对应的匹配特征的数量。再次参照图1A，光学分析设备100可选地进一步包括设备控制器240 和/或显示器230。设备控制器240可操作地连接到用于移动容器的装置140, 并且被提供成与处理器160至少单向通信。在一个实施方案中，设备控制器 从处理器160接收输出信号(以箭头示意示出)，并且能够产生具有选定位 移速率的容器130的选定轨迹，例如使选定目标颗粒往复穿itifit^见察体积 270的轨迹。显示器230被提供成与处理器160至少单向通信，并且能够显 示未处理的荧光数据、诸如与预定模式匹配的时间曲线的已处理数据以及模 式识别算法运算的其它结果，诸如与预定模式匹配的特征的数量、颗粒的浓度、颗粒的大小分布、颗粒的亮度分布以;ML征与观察到的时间曲线拟合质量的统计学指标。图2提供了本发明的光学分析设备的照片，所述分析设备包括结合了具 有模式识别算法的处理器的扫描共焦显微镜。图2中示出的装置包括具有卧 式形状的小共焦显微镜以及容纳圆柱形试管(直径大约lcm)的M装置， 所述机械装置带有提供旋转运动(大约5转/秒)和较慢垂直反转 (inversion)运动(大约2. 5厘米/秒)的两个马达。慢垂直扫描有利于确 保后续垂直扫描中探测的观察体积的统计独立性。光照焦点集中在距离样本 内的试管壁大约200孩i米处。为了产生激发光，提供了包括耦接到具有60nm的FWHM的525nm带通滤 波器上的卣素灯的光源、提供515nm激发光的氩离子激光器(stabilite 2017， Spectra-Physics )、或提供532nm激发光的钕钇激光器。这个试验 配置中的用于检测颗粒所需要的光源辐射功率低于lmW。提供的物镜是 Kyowa20x (N.A. 0.40)。在光电检测器前面拔_供了长*射光滤波器，以 避免检测由分色M射的任何激发光。使用包括光电倍增管(PMT) HC120 (Hama咖tsu)的光电检测器实现荧光检测。来自PMT的信号被输入到^Uf 道12比特A/D获取卡中。以可变时间分辨率(1/40kHz - 0. 025ms或更少) 对光电流进行采样。作为时间函数每时间门(bin)给出光电流的信号的时 间轨迹被存储在计算机中，并且使用我们称之为simFCS的全面分析软件进 行分析。在很多其它功能中，simFCS计算自相关函数以及光子计数直方图。 simFCS还包括具有颗粒通过模式识别算法的相关滤波器程序。滤波器的功 能是将预定模式与时间曲线中的特似目匹配。与时间曲线中的特征匹配的模 式的宽度与颗粒通过光照体积的时间相关。配置该系统以便获得阳性事件的 直方图并且可观察个体匹配。基于颗粒通过模式识别的相关滤波器程序允许 在少于1分钟的扫描时间中对低亮度的颗粒进行亚阿托摩尔检测。
在本发明中，在光学分析期间分析的总体积与总样本扫描周期(或检测 时间)成正比。通过下面的表达式定义在共焦显微镜中估计的点传播函数体 积(VPSF):
VSPF = (Lx) x (Ly) x (Lz) (1)
其中Lx为沿X方向的观察的长度，Ly为在Y方向上观察的长度，Lz为在Z
方向上观察的长度。当在光电检测器的前面提供矩形狭缝时，Lx和Ly对应
于与激发光的传播轴正交的轴，并且使用狭缝的物理维度和共焦显微镜的放 大因子来计算，并且Lz对应于与激发光的传播轴平行的轴，并且使用系统 的物理光学来计算。在一个实施方案中，Lx、 Ly和Lz分别等于70樹来、500 微米和150微米。用公式1计算出的点传播函数体积等于5 x 106微米3。 VSPF = (70pm) x (500jim) x (150pm) =5xl06(|im)3 使用下面的表达式计算包括旋转和垂直反转的移动的容纳样本的至少 部分透明的容器的轨迹的总长度(L):
L - 7T (d试管)x (Vr) (t) (2) 其中d试管为试管的直径。Vr为试管的旋转速度，t为样本扫描周期(或检 测时间)。对于样本扫描周期等于100秒，试管的直径等于1厘米并且旋转 速度等于5转/秒的情况，使用公式2计算出的轨迹总长度值等于1. 6 x 107 微米
丄=;r(lcm)(^")(100秒)("10戸)=1.6 x 107戸 秒 1，
通过下面的表达式提供在样本扫描周期期间探测的总体积(V):
V = (L) x (截面积) (3 )
其中L是轨迹的总长度，截面积是观察区域的橫截面面积，诸如沿与激发光
的传播轴平行和/或一致的轴的观察区域的冲黄截面面积。在一个实施方案中，
Ly和Lz分别等于500 ^L米和150賴沐，用下面的表达式来计算出截面积
截面积=<formula>formula see original document page 29</formula>
将7. 5 x 104平方微米的截面积和1. 6 x 107微米的轨迹总长度仏)(参见
上面的计算)代入公式3,得到在扫描期间探测的总体积(V)等于1. 2ml。
<formula>formula see original document page 29</formula>
1x10拜
因此，在该试验配置中，在100秒的测量时间内探测了多于lml的体积。 该计算说明本发明的设备和方法在合理的短扫描时间内检测非常低浓度(几 个/毫升)的能力。
重要的是应注意到样本流体从不"i^"设备的内部工作区。仔细过滤 以防止堵塞并不是必需的。不必经常清洁以防止污染物或细菌生长。样本也 没有在流式细胞术中丢失。它保留在试管中，并且因此如果需要可以用于进 行其它试验。本发明的这个属性在针对^^获得的样本时特别有利。
图3示出了使用本发明的光学分析器产生的移动穿过观察体积的颗粒 的示例性荧光时间曲线。Y轴对应于以任意单位表示的强度并且x轴对应于 以任意单位表示的时间。图3中示出的时间曲线是使用约等于300转/分(5 转/秒)的旋转速度的容纳样本的容器的旋转以及约等于1厘米/秒的速率的 容纳样本的容器的垂JL^转的结合来获得的。在时间约等于9， 230和9， 520 的时间曲线中的特征对应于穿过观奮本积的颗粒的通过。图4A示出了由光 学分析器产生的时间曲线(上图)以及与时间曲线中的特似目匹配的相应预 定模式(中图)。图4A中还示出了与时间曲线相匹配的每个模式的相关卡方 值(下图)。图4B提供了显示在时间曲线中观察到的特征(曲线A)以及拟 合匹配该特征的预定;f莫式(曲线B)的重叠图。与该特征匹配的预定模式的 形状是由高斯函数来确定的。使用高斯函数提供了穿过观察体积的颗粒的运 输的第一近似。本发明的方法还包括根据系统和用途而使用具有更复杂功能 性的预定模式。图4C示出了放大比例的单个模式的强度分布，并且图4D显 示了对不均匀样^i^f亍分析获得的大小分布。
图5提供了本发明的多信道光学分析器的示意图。多信道分析器600还 包括分束器601、附加物镜610、附加共焦孔620、附加发射光滤波器630
以及附加光电检测器640。定位分束器601以使其反射来自观奮*积270的 荧光。如图5所示，该反射光穿过附加物镜610和附加共焦孔620，并且在 附加光电检测器640上成像，能够测量作为时间函数的焚光强度。在本发明 的可用于同时地和独立地监测与观察区域中的颗粒相结合的多个不同荧光 探针发出的荧光的实施方案中，光电检测器150和附加光电检测器640分别 带有能透过选定波长分布的光的不同发射光滤波器。因此，本发明的这一实 施方案产生对应于来自不同荧光探针的多个荧光时间曲线，对这些曲线进行 分析可以提供基于成分对颗粒分类的有用信息。替代地，在本发明的其它实 施方案中，光电检测器150和附加光电检测器640分别带有不同大小的共焦 孔。因此，本发明的这一实施方案产生对应于不同大小的观g积的多个荧 光时间曲线，对这些曲线进行分析可以提供基于大小和/或形状对颗粒分类 的有用信息。
图6提供了说明本发明的示例性模式识别算法的步骤的功能流程图。如 该图所示，首先选择诸如高斯函数的函数类型作为用于拟合时间曲线中的特 征的预定才莫式的基础。接着，将滤波器应用到具有选定长度的荧光时间曲线 的区段，所述选定长度诸如近似等于模式长度的长度。改变预定模式的强度 并JL^;I^:极限设置内获得最小二乘拟合。如果获得匹配，那么该特征净皮记 录为颗粒检测事件并且保存该强度。如果还需要获得大小分布，那么在最大 和最小宽度设置之间扫描模式宽度，并保存与最佳拟合相对应的模式宽度。 然后对时间曲线的下一个时间间隔重复该过程。
本发明的方法和设备可以使用各种光学、电子和,设备组件。在本方 法中可用的光源可以包括窄带相干光源，诸如激光器以及窄带灯光源。替4戈 地，只要能提供诸如光千涉滤波器、衍射光栅或单色仪的波长滤波元件而获 得具有足够窄波长分布的激发辐射，使得可以对来自观察区域中的颗粒的发 射进行灵敏的检测，宽带灯也可以被用作本发明中的光源。光源包括但不限 于激光器、窄带灯(例如水4艮弧光灯)、宽带灯(例如氘灯、氙气灯、卣 素灯或荧光灯， 一个或多个发光二极管(LED))。
本发明中可以使用常规共焦光显微镜，常规共焦光显微镜包括与光源光 通信的瞄准元件(例如针孔或狭缝)、分色反射镜、物镜和与光电检测器光
通信的共焦孔(例如针孔或狭缝)。使用与光源光通信的瞄准元件(例如针 孔或狭缝)在本发明中是可选的，特别可用于光源为诸如激光源的具有小的
点大小的空间相千光源的实施方案。本发明中可以使用提供具有固定位置的 共焦体积的共焦显微镜，以及例如通过旋转分色反射镜而提供具有可选择性 变化位置的共焦体积的共焦显微镜。本发明中的共焦显微镜可以具有固定大小的共焦孔或可选择性变化大小的共焦孑L,并且可以水平或垂直几何光学方 式提供。在本方法和设备中可用的容器包括任何形状的容器，所#器至少能部 分透过激发光和来自颗粒的发射光。对于需要高检测灵敏度的光学分析应 用，可用的容器应能高度透过激发光和发射光。对于在光学分析期间要旋转 容器的颗粒分类测量而言，使用在不同旋转位置时对激发光和来自颗粒的发 射光都具有基4^t定的透射率(例如在稳定在大约10%之内，或对一些应用 而言优选地稳定在大约5%之内)的容器(例如圆柱形试管或光学池)是特 别有用的。用于移动容纳样本的容器的任何装置都可以在本发明中用于提供容器的平移、旋转或平移;^旋转，所述装置包括马达、开关电子器件和/或偏心 旋转板机构。对于一些应用而言，优选使用不易受M波动和/或震动影响的移动容纳样本的容器的装置。然而，本发明的光学分析方法和i殳备并不太 容易受由机械波动和/或震动引起的误差的影响，所述4城波动和/或震动发 生的时间尺度比颗粒穿过观察体积的时间尺度长得多(即至少3倍)。任何光电检测设备都可用于本发明，包括但不限于光电倍增管、诸如雪 崩光电二欧管的光电4管和光电导检测器。在本发明中可用的光电检测器 可以带有信号放大器、终端负载、才 转换系统、电子滤波系统或本领域已 知的4壬何等同物。本发明的光电检测器可净皮配置用于光子计数。本发明的方法和设备可与计算机辅助自动控制系统相结合，因此非常适 于大量样本的高通量光学分析。在本发明中可用的处理器包括孩i型计算机、 通用计算机或能够运行应用软件的处理系统。在本发明中可用的示例性计算 机包括微型计算机，诸如IBM个人计算机或其适当的等同物，以及工作站计 算机。优选地，本发明的模式识别算法被M在计算机可读介质中，诸如计 算机压缩光盘(CD ROM )、闪存设备或软盘。此外，计算机可读^h质可以是 石更盘或存储芯片的形式，诸如随机访问存储器或只读存储器。如本领域的普通技术人员所理解的，可以使用《^f可适当的编程语言写出 实现本发明的数据分析方法和模式识别算法的计算机软件代码。示例性语言 包括但不限于，C或C的任何版本、Perl、 Java、 Pascal,或这些语言的4壬 何等同物。尽管对于本发明的一些应用而言，优选地使用计算机实现本发明 的所有步骤，但是也考虑了可以使用计算机来仅执行本方法的特定步骤或选 定的系列步骤。在此已经采用的术语和表达被用作描述而不是限制的术语，并且使用这 样的术语和表达并不意在排除所显示和描述的特征的任何等同物或其部分， 而M当认为在所请求保护的本发明的范围之内可以i^f亍各种修改。因此， 应当理解，尽管已经通过优选实施方案以及可选特征具体公开了本发明，但 是本领域普通技术人员可以对本文公开的思路进行修改和变化，并且认为这 样的修改和变化也在所附的权利要求所定义的本发明的范围之内。在此提供 的具体实施方案是本发明可用的实施方案的实例，并JL^本领域的普通技术 人员显而易见的是，使用大量不同的本说明书中阐述的设备、设备组件、方 法步骤均可以实施本发明。本发明有用的方法和设备可以包括大量可选的设 备元件和组件，包括但不限于光纤元件、温度控制器、诸如FP标准具、高 通截止滤波器和低通截止滤波器的光滤波器、诸如瞄准透镜和反射镜的瞄准 元件、触发脉冲发生器、激光器、单色仪、棱镜、衍射光栅、诸如聚焦透镜 和反射镜的聚焦元件、反射镜、起偏镜、光纤耦合器和发射器、温度控制器、 温>1传感器、宽带光源和窄带光源。下面的参考文献总体涉及数字信号处理和模式识别(1) "Algorithms and Applications", John G. Proakis、 Dimitris G. Manolakis, Prentice Hall,第三版，1995年；(2) "Discrete Time Signal Processing"笫二 版，A.0ppenheim、 Schaf er和J. Buck, Prentice Hall, 1999年；(3) "Discrete-time Processing of Speech Signals" ，J.R.Deller、 Jr.、 J. H.L Hansen和J. G.Proakis， IEEE Press, 1999年以及(4) "Pattern Classification ( 2001 )" Duda、 Hart和Stork, Wiley-Interscience。下 面的参考文献涉及使用光子计数直方图分析和波动相关分光镜分析解析荧 光数据的分析方法(1 )"The Photon Counting Histogram in Fluorescence Fluctuat ion Spectroscopy", Y. Chen、 J. D. Muller、 P. T. C. So和E. Gratton, Biophys. J. ， 1999年7月，页码553-567， 77巻，号码1; ( 2 )美国专利 6, 794, 659; (3) "Two photon fluorescence correlation spectroscopy: method and application to the intracellular environment ，，， K.M. Berland、 P. T'C. So和E. GraUon， Biophys. J. ， 1995年，68巻，页石马 694—701; (4) "Fluorescence Correlation spectroscopy. I.Conceptual Basis and Theory" ， E丄Elson和D.Magde， Biopolymers， 1974年，13巻， 页码 l一27; (5) " Fluorescence Correlation spectroscopy. II. An Experimental Realization ，， ， D. Magde 、 E丄Elson 和 W. W. Webb, Biopolymers, 1974年，13巻，页码29-61; ( 6 ) "Fluorescence correlation spectroscopy: inception, biophysical experimentations and prospectus" ， W. W. Webb, A卯l. Opt, 2001年，40巻，页码3969-3983; 以及(7) "Fluorescence-intensity (Ustribution analysis and Us application in biomolecular detection technology" ，P.Kask、 K.Palo、 D.Ullmann和〖.Gall，Proc. Natl. Acad，Sci，， 1999年，美国，96巻,页码 13756-13761。关于通过51用和变体并入本说明书的声明整个申请所引用的所有参考文献，例如包括颁发或授权专利或等同物的 专利文献；专利申请公开；以及非专利文献或其它来源的资料，在此通过引 用的方式将其4^内容納入本说明书，如同通过个别引用的方式纳入一样， 引用的程度为每个参考文献中至少与本申请中的公开内容相应的部分(例 如，通过引用的方式引入与本申请有部分不一致的参考文献，但是参考文献 中不一致的部分除外)。除非另有声明，在此描述或例示的组件的每个表述和组合都可以用于实 施本发明。无iM可时在说明书中给出范围，例如，温度范围、时间范围或组成或浓 度范围，则意在本发明公开内容中包括所有的中间范围和子范围以及所有包 括在所给范围中的单个值。应当理解的是，本说明书中包括的范围或子范围 中的任何子范围或单个值都可以没有包括在权利要求中。本说明书中提及的所有专利和公开文献都可表示本发明所属技术领域 的普通技术人员的水平。在此所引用的参考文#此通过引用的方式将其全 部内容纳入本说明书，以表示
公开日或提交日时的现有技术，并且意在表示 本文可以使用该信息，并在需要时用于排除现有技术中的具体实施方案。在本文中所使用的"包括"与"含有"、"包含"或"特征在于"同义， 意为包括或开放式的，并且并不排除附加的、未列举的要素或方法步骤。本 文中所使用的"由......组成"排除没有在权利要求要素中指定的任何元件、步骤或成分。本文所使用的"基本由......组成"并不排除本质上不影响权利要求的基本特征或新颖特征的材料或步骤。在本文的任何情况中术语"包 括"、"实际由……组成"和"由……组成"中的任何一个都可以被另外一个 或两个术语替代。本文所述的本发明可以适合在缺少在此没有具#^>开的任 何元件或元素或限制的情况下实施。本领域的普通技术人员应当理解，采用本文未具体示出的那些起始材 料、材料、试剂、合成方法、纯化方法、分析方法、测定方法，不需进行过 多试验，就可以实施本发明。本发明意在包括任何这样的材料和方法的所有 公知的功能等同物。已经采用的术语和表述被用作描述性的而不是限制性的 术语，并且在使用这样的术语和表述时不希望排除所显示或描述的特征的任 何等同物或其部分，但^当认识到在请求保护的本发明的范围之内可以进 行各种修改。因此应当理解的是，尽管本发明已经通过优选实施方案和可选 特征净皮具^^开，但是本领域的普通技术人员可以对在此公开的思路进4刊务 改和变化，并且认为这样的修改和变化也在如所附权利要求定义的本发明的 范围之内。实施例l:在清澈和浑浊介质中分析荧光球体为了mi3晴确测量样本中颗粒的浓度的能力，将本发明的光学分析设备 用于测定含有散射样本的清澈緩冲溶液和Lyposin溶液(20%重量，1: 80稀 释)中的直径为l.Oum的橙色荧光球体(Molecular Probe F-8820)的浓 度。在上述测量中使用带有绿光滤波器(525nmi60nm)的小卣素灯作为4I:供 激发光的光源。使用采用1分钟样本扫描时间的本光学分析设备可以测量在 这些样本中的低至几百个球体/毫升的橙色荧光球体的浓度。图7示出了示例性光子电流直方图，并且图8示出了使用本方法和i殳备 产生的作为颗粒浓度的函数的总计数图(荧光时间曲线中的峰值)。如图8 所示，在所检测的浓度的宽范围上有很好的线性拟合。该研究的结果表明本 方法和设备非常适于测定在光透明样本和散射样本中的荧光颗并立的浓度。为了可重复地险测和测量甚至更低的浓度，例如低至几个颗粒/毫升的 浓度，使用具有坤莫式识别算法的相关滤波器程序分析使用本方法产生的萸光 时间曲线。光子计数直方图除了包括来自目标颗粒的信号^卜，还包括来自 背景的贡献以及^^^转的影响。简单数据滤波(诸如低通^t据滤波)并不 足以实现目标检测灵敏度，特别是当处理散射介质中的微弱颗粒的时候。具 有才莫式识别算法的相关滤波器程序在扫描期间识别光照体积中的目标颗粒 的通过，并将该事件记录为命中，同时还记录其强度幅度并可选地记录其总 积分强度。为了评价模式识别算法的效果，使用荧光球体进行仪器校准。图ll示 出了使用采用模式识别数据分析的本发明光学分析设备所得的浓度-稀释度 研究结果。图11示出了当浓度增加时所检出事件(颗粒)的数量的饱和。 这是预期的结果，这是因为在高浓度时观恭沐积中同时存在多于一个颗并立的 可能性增加了。然而，通it^发射侧改变针孔降^C察体积、执行考虑了堆 积可能性的线性曲线，或通过在光学分析之前简单稀释样本，可以直接校正饱和的影响。然而，在曲线的低浓度部分不需要fcE饱和的影响。在该状态 中，如图11中的插图所示，该线性极好地下降至很低的浓度(几个/毫升)。 对于这些测量来说，采用大约1分钟的扫描时间。实施例2:对牛奶中的体细胞计数的分析。乳腺i^乳牛花费最高的疾病。估计在美国每年由于该疾病导致的总损 失是大约15至30亿美元。由于牛奶中的细胞计数与乳房健康密切相关，所 以体细胞计数(SCC)被作为牛奶质量的国际标准量度。因此，当前需要用 于测量牛奶中体细胞计数的廉价、可靠和便携的方法和设备。用实验验证了本发明光学分析设备测定体细胞的浓度的能力。在这些测 量中，从伊利诺斯州大学的乳牛研究中心获得新鲜的牛奶。在分析之前用 TRIS緩沖液将牛奶样;^释到1/4浓度。最初的试验是对包括来自正接受 治疗乳腺炎的母牛的牛奶的样本ii行的。测得来自这种来源的牛奶中的相应 的体细胞数约为1， 000， 000个细胞/毫升。在这些试验中，对样本ii行十倍 稀释，使得可以分析具有大约105个细胞/毫升到大约106个细胞/毫升的体 细胞数的稀释样本。在光学分析之前向样本中加入洗涤剂(Triton-X 100) 以使细胞膜破裂。另夕卜，加入10孩傳尔级浓度的嗅化乙锭(Molecular Probe， E-1305 )对体细胞进行荧光标记。所添加的嗅化乙锭与细胞中的DM相结合， 结合后其荧光会比游离形式增强大约20倍。
图9示出了用本发明方法对于包含体细胞的牛奶样本产生的示例性光 子电流直方图。图9所示的直方图的展宽明显^t决于样本中荧光颗粒的浓 度。为了产生该系统可用的校准曲线，设置了荧光强度阈值以确定将荧光时 间曲线中的哪个特征识别为体细胞的阳性检测。图io示出了使用本发明方闳中的峰值)图。如图IO所示，在所检测浓度的可用范围内具有很好的线性 拟合。此外，对原始数据的重复分析表明校准曲线的线性对荧光强度阈值的 选捧并不十分敏感。实施例3:大肠杆菌的光学分析用实验验证了本发明测量诸如细菌的微生物浓度的能力。在这些试验 中，将大肠杆菌在温度为37匸、LuriaBroth培养基中以及在振荡式培养箱 (New Brunswick Scientific, C24 )中300转/分的摇动条件下繁殖几个小 时。然后使用MOPS緩冲液稀释样本。用一种DM探针Sytox Orange对细菌 进行标记。图12示出了根据细菌显著衰减荧M荧光时间曲线产生的校准。 如图12所示，采用l分钟扫描时间能够测量远低于100个/毫升的浓度。另 外，用于数据分析的软件还执行强度分析。图13提供了幅度直方图(即强 度分布)，表明了本发明方法基于颗粒强度分布对颗粒分类的能力。实施例4: A0蛋白质聚集体的M测本发明的目的之一是检测和测量生物样本(例如体液)中蛋白质聚集体的浓度。为了评价本发明的这一应用，用实验验证了本发明光学分析设备和方法测量低浓度的淀粉样变蛋白P的寡聚物聚集体的能力。由尸体解剖获得来自阿尔茨海默病受试者和年龄匹配的对照受试者的脑脊髓液样本(AD n=19;对照n=21平均死后时间〈3. 5小时)，用荧光素-人A P (1-42 ) (FL42 ) (Anaspec, Inc )对样本进行标记，并根椐从Pitschke改良的方法通过FCS进行测定。采用两光子激发(780nm，钛蓝宝石激光器，模式锁定，150fs脉冲，6-9mW样本)以降^f树探针的光破坏并更好的确定采样体积。利用以光子计数才莫式工作的EG&G型SPCM-AQR-15雪崩光电二极管进行检测。将激光器光照通过40 x NA-l. 4的油物镜聚焦于在8槽玻片(8-chamber slide)中的10孩i升样本滴上。使用单个分子检测以及焚光
素和荧光素-溶菌酶的相关分析来校准仪器。16比特的数据采样率在 16-32kHz范围内以识别单个分子事件。将10mM NaPi-O. 2%w/v SDS， PH7. 5中的FL-42稀释至100nM，并在CSF 样本中加入0.02"/。 SDS以标记内源性的寡聚复合体。在AD样本中观察到高 于游离荧光肽背景的高亮度颗粒。在测量时间期间，未标记的CSF样本或 10mM NaPi， PH7. 5中的100nM FL-42均不产生在被标记CSF样本中观察到 的高亮度寡聚物。高亮度寡聚物被检测为稀少事件，估计的数量浓度〈1 pM。这些大的寡 聚物扩散很慢，并且大部分采样时间为事件之间的等待时间。我们预计由于 寡聚物的低浓度和慢扩散的双重性质，对于一次测定就将需要数天时间才能 获得足够的统计学数据。为了在最短的时间内采集到足够的事件以便进行有意义的比较，在保持样体积。不扫描共焦图^^续监控约in'的体积。'利用4毫秒周'期扫曰描2:jLim直径的圆中的共焦点，采样约O. 5pl的体积。在X-Y为45 x 45 ym的平 面上进行光栅扫描，在60|im的Z-轴上以3|idi的增量进行扫描，采样约 120pl。图14A和14B分别示出了利用以两光子^t^模式工作的常规扫描共焦显 微镜分别对对照样本和AD样本获得的荧光时间曲线。图14A对应于静态的 对照和AD ( 20分钟)，图14B对应于3维AD样本波束扫描(XY光栅扫描+z 步幅；90秒)。图14A中如测量峰值宽度所示，强烈的尖峰基于其慢扩散被 解释为大的寡聚AP复合体。在该尸体解剖CSF样本的小样本中，对照组受 试者(n=22，平均3， 105 ± 0. 648峰值S. D.)可以以p-0. 00346的显著度与 AD组受试者(n-18，平均6. 053± 0. 800峰值S.D.)相区别。尽管两组之间 是可以分开的，但是部分因为观察到的时间的数量较小，所以在个体上还有 重叠。图14B中示出的3维扫描被转化成准3维图像。图14C示出从3维扫 描产生的准3维图像，示出了大荧光寡聚物的数量(拉长的白点)。使用具有模式识别算法的相关滤波器程序分析使用本方法和设备获取 的荧光时间曲线，并且测定拉长颗粒的大小分布，所述颗粒诸如淀粉样变蛋 白P的聚合体和聚集体。图15提供了对照样本和AD样本的聚集体浓度和大 小的相关图。实施例5:用于更好定位和固有亮度测定的具有多狭缝共焦孔的光学分析器 可选地，本发明的光学分析器和分析方法利用多狭缝的共焦孔光配置。 除了提供颗粒浓度、颗粒亮度和/或大小特征的测量之外，本发明的这个方 面的分析器还能够测量观察体积中的颗粒的位置和/或轨迹。本发明的这个 功能方面使得可以使用大观察体积进行精确的光学分析，从而使得能够在光 扫描期间分析大样本体积。在这些实施方案中确定颗粒位置和/或恥逆的测 定可增强检测颗粒和表征颗粒亮度方面的灵敏度，因为在分析期间获取的位 置信息消除和/或最小化了关于所检测颗粒的绝对强度或亮度的不确定性。在本发明的这个实施方案中，在样本和光电检测器之间提供了多狭缝共 焦孔，以便来自观察体积的至少部分荧光在由光电检测器检测之前穿过多狭 缝共焦孔。本文所使用的术语"多狭缝共焦孔"指的是包括多个狭缝和/或 针孔的设备组件，它们对称或不对称地空间分布在光电检测器的前面，并且 能使入射荧光至少部分透射。多狭缝共焦孔可以具有任何数量的狭缝和/或 针孔，提供对颗粒的精确光检测和/或表征，并且所提供的狭缝或针孔可以 具有相同或不同的面积。对于一些光学分析应用而言，使用包括两个具有基 ^目同的狭缝面积的共焦狭缝的双狭缝共焦孔(及具有两个狭缝)是有益的。 在本发明的这个方面的实施方案中，多狭缝共焦孔可以是共焦显微镜的组 件。本发明的一些应用中，可用的多狭缝共焦孔包括多个宽度范围为大约5 微米到大约IOO微米的狭缝，这些狭缝彼此的间隔是相等的，间隔范围为大 约5微米到大约500微米。本发明的一些应用中，可用的多狭缝共焦孔包括 对称分布在光电检测器前面的多个狭缝。在本发明的分析器和分析方法中，使用多狭缝共焦孔来增强关于光照曲 线的中心的荧光颗粒的位置和/或轨迹的确定。所述多狭缝配置采用在单个 光电检测器前面的多个狭缝，不同于位于单个检测器前面的单个狭缝。图 16A-16D示意说明并比较了在本发明中使用单个狭缝和多狭缝共焦孔用于确 定观察体积中的颗粒位置和/或,。图16A和16B图示了使用单个狭缝共 焦孔的本发明的实施方案，图16C和16D图示了使用双狭缝共焦孔的本发明 的实施方案。图16A和16B示出了精确穿过共焦体积的中心的第一颗粒M (16A) 以及偏离共焦体积的中心的第二颗粒轨迹(16B)。图16A和16B(这些图的 上部)还显示了对每个单个狭缝共焦孔配置的预测的荧光时间曲线。图16A 和16B的比较显示随着颗粒偏离观察体积的中心，荧光时间曲线的宽度增 加。因此，测量时间曲线的特征的宽度提供了一种确定颗粒位置和/或轨迹 的方法。多狭缝共焦孔的引入大大提高了测得的颗粒位置和/或轨迹的准确性和 精确度。图16C和16D示出了精确穿it^见察体积的中心的第一颗粒^LilL( 16C) 和偏离观察体积中心的第二颗粒轨迹(16D)。图16C和16D(这些图的上部) 还显示了对每个双狭缝共焦孔配置的预测的荧光时间曲线。图16C示出了当 颗粒精确穿过观察体积(即共焦体积)的中心时，时间曲线以两个相同的尖 峰为特征。然而，如图16D所示，随着颗粒4^移动远离观察体积的中心， 在荧光时间曲线中的两个峰值展宽并最终合并为单个宽峰(16D)。荧光时间 曲线中的这种从两个峰值到单个峰值的转变提供了 一种表征颗粒位置和/或 轨迹的有用的方法。例如在一个实施方案中，将与一个给定检测事件相对应 的观察到的时间曲线中峰值之间的时间间隔用于定量表征颗粒在观察体积 中的位置(例如，如图16A-16D所示的颗粒沿Z轴的位置)。4吏用多狭^^ 焦孔获取的时间曲线中两个最大值之间的时间4^供了重务f言息，可用于提高 对颗粒位置、颗粒轨迹和/或亮度强度的测量的精确度。使用多狭缝共焦孔 几何光学观察到的峰值形状和间隔的变化也可以用于本发明中以确定颗津立 形状。当颗粒穿i^见察体积时，测量到的荧光取决于颗粒的固有亮度(或强度) 以及其轨迹在光照路线中的具体位置，越靠近共焦体积的中心，亮度就越高。 在一个实施方案中，该系统能够分析使用多狭缝配置产生的不同的荧光时间 曲线(例如通过测量观察到的时间曲线中的两个或多个峰值之间的时间间 隔)，并且正确地定位颗粒沿Z轴的位置(如图16A-16D所识别的)。在知道 颗粒沿Z轴的位置(如图16A-16D所识别的)后，就可以提高计算颗粒的强 度/亮度时的精确度。使用这种新方法，仍然有无法确定的，关于共焦平面 的反射对称，其并不影响光照强度的计算。对使用多狭缝共焦孔光几何学产 生的时间曲线的分析可以使用^^种方法来进行分析，所述方法包括但不限于 模式识别数据分析技术、光子计数直方图分析以及波动相关光谙学方法。
权利要求
1. 一种用于分析样本中颗粒的设备，所述设备包括 至少部分透明的容器，用于容纳包含所述颗粒的所述样本；光源，用于产生提供给所述样本的激发光，从而使得至少部分所述颗粒 产生荧光；用于收集来自位于所述容器内的观察体积的荧光的装置；用于移动所述容器的装置，从而使至少部分所述颗粒传输穿过所述观察体积；以及与所述用于收集荧光的装置光通信的光电检测器，用于接收来自所述观 察体积的至少部分所述荧光并测量其强度，从而产生所述焚光的时间曲 线。
2. 根据权利要求1所迷的设备，其中所述用于移动所述容器的装置绕着穿 过所述容器中心的旋转轴旋转所述容器。
3. 根据权利要求2所述的设备，其中所述用于移动所述容器的装置以在大 约0.1转/秒到大约10转/秒的范围内的速率旋转所ii^器。
4. 根据权利要求1所述的设备，其中所述用于移动所述容器的装置在垂直 方向上損:供所i^器的平移。
5. 根据权利要求4所述的设备，其中所述用于移动所述容器的装置以在大 约0. 01厘米/秒到大约5厘米/秒的范围内的速率垂直反转所il^器。
6. 根据权利要求1所述的设备，其中所述用于移动所述容器的装置同时旋 转和垂J^转所^器。
7. 根据权利要求1所述的设备，其中所述用于移动所i^器的装置是马 达、开关电子器件或偏心旋转板设备。
8. 根据权利要求1所述的设备，其中所述用于收集来自所述观察体积的荧 光的装置是共焦显微镜。
9. 根据权利要求1所述的设备，其中所述光源产生空间上准直的齓发光。
10. 根据权利要求1所迷的设备，其中所述观察体积位于距所述容器壁大约IOO微米到大约2000微米的距离。
11. 根据权利要求1所述的设备，其中所述观察体积具有大约1 x 102 jam3 至大约1 x 10、1113之间的体积。
12. 根据权利要求1所述的设备，其中所述用于移动所述容器的装置使颗 粒一次一个地穿过所述，见^^积。
13. 根据权利要求1所述的设备，进一步包括具有模式识别算法的处理器， 用于接收并分析由所述光电检测器产生的所述时间曲线。
14. 根据权利要求13所述的设备，其中所述模式识别算法使所述时间曲线 中的特征与预定模式相匹配，其中所述预定模式对应于穿过所ii^见察体 积的颗粒的时间依赖型荧光强度。
15. 根据权利要求14所述的设备，其中所述预定模式通过经验确定。
16. 根据权利要求13所述的设备，其中当作为时间函数的预定模式和时间 曲线的强度彼iH^目差在大约20%之内时，即为预定模式与所述时间曲线 的特^目匹配。
17. 根据权利要求13所述的设备，其中当预定模式的宽度和颗粒穿过所述 观察体积的飞行时间相关时，即为预定模式与所述时间曲线的特;^目匹 配。
18. 根据权利要求13所述的设备，其中所述模式识别算法对所述时间曲线 的特征和所述预定模式之间的匹配的数量进行计数。
19. 根据权利要求18所述的设备，其中所述时间曲线的特征和所述预定模 式之间的匹配的数量与所述样本中所述颗粒的浓度成比例。
20. 根据权利要求13所述的设备，其中所述模式识别算法将所述时间曲线 中的特征与预定才莫式相匹配，其中所述预定模式对应于穿过所述观察体 积的颗粒的时间,型荧光强度，并且其中与所述时间曲线中的所述特 征匹配的所述预定模式的宽度与所述颗粒的大小成比例。
21. 根据权利要求13所述的设备，其中所，式识别算法产生包括具有不 同总积分强度的匹配特征的直方图的输出。
22. 根据权利要求1所述的设备，其中所述颗粒是带荧光标记的颗粒、固 有荧光颗粒或既是带荧光标记的颗粒又是固有荧光颗粒。
23. 根据权利要求1所述的设备，其中所述颗粒选自细胞；病毒；细菌； 蛋白质；肽；蛋白质聚集体；寡核苷酸、MA、 DNA蛋白质复合体、RNA、 RNA蛋白质复合体、球体；金属颗粒；磁颗粒；以及抗体包被的珠状物。
24. 根据权利要求1所述的设备，其中所述容器为圆柱形试管。
25. 根据权利要求1所述的设备，包括附加光电检测器，其中所述光电检 测器选择性i^测来自所述观察区域的具有第一波长分布的焚光，并且 所述附加光电检测器选择性地检测具有第二波长分布的光，并且其中所 述第一波长分布不同于所述第二波长分布。
26. —种用于分析样本中颗粒的设备，所述设备包括 至少部分透明的容器，用于容纳包含所述颗粒的所述样本；光源，用于产生提供给所述样本的激发光，从而使得至少部分所述颗粒 产生荧光；用于收集荧光的装置，包括与第一共焦孔和第二共焦孔光通信的光收集 元件，其中所述第一共焦孔具有不同于所述第二共焦孔的^lt截面面积； 第一光电检测器，用于检测来自位于所述容器内的第一观察体积的荧 光，定位所述第一光电检测器以检测穿过所述第一共焦孔的荧光，从而 产生所述荧光的第 一时间曲线；第二光电检测器，用于检测来自位于所述容器内的第二观察体积的荧 光，定位所述第二光电检测器以检测穿过所述第二共焦孔的荧光，从而 产生所述荧光的第二时间曲线；以及用于移动所述容器的装置，从而使至少部分所述颗粒传输穿过所述第一 观察体积以及所述第二观察体积。
27. 根据权利要求26所述的设备，其中所述第一共焦孔具有比所述第二共 焦孔更小的横截面面积，并且其中所述第一观测体积位于所述第二;i见测 体积之内。
28. 根据权利要求26所述的设备，其中所述用于收集来自所述观察体积的 荧光的装置;l共焦显孩t镜。
29. 根据权利要求26所述的设备，进一步包括具有模式识别算法的处理器， 用于接收并分析由所述第 一和第二光电检测器产生的所述第 一和第二 时间曲线。
30. 根据权利要求29所述的设备，其中通过所述模式识别算法分析所述第 一和第二时间曲线而确定所述颗粒的大小分布。
31. —种用于分析包含颗粒的样本中的颗粒的方法，所述方法包括下列步 骤在至少部分透明的容器中提供包含颗粒的所述样本； 将激发光导向至样本，从而使得所述样本中的至少部分所述颗粒产生荧 光；收集来自所述样本中的观察体积的荧光，并且将来自所述观察体积的荧 光导向至光电检测器；移动所述容器，从而使所述样本中的颗粒穿过所i^见察体积；以及 使用所述光电检测器测量来自所述观察体积的作为时间函数的所述荧 光的强度，从而产生来自所述观奮本积的所述荧光的时间曲线。
32. 根据权利要求31所述的方法，其中所述使用模式识别算法分析所述时 间曲线的步骤确定所述样本中颗粒的浓度或所述样本中所述颗粒的大 小分布，或两者均被确定。
33. 根据权利要求31所述的方法，进一步包括在所述样本中对所述颗粒进 行荧光标记的步骤。
34. 根据权利要求31所述的方法，进一步包括提供与所述样本光通信的共 焦显微镜的步骤，其中所述共焦显微镜用于执行所述将所述M光导向 至所述样本、收集来自观察体积的所述荧光以及将来自所述观察体积的 所述焚光导向至光电检测器的步骤。
35. 根据权利要求31所述的方法，进一步包括使用模式识别算法分析所述 时间曲线的步骤。
36. 根据权利要求35所述的方法，其中所述使用所述模式识别算法分析所 述时间曲线的步骤包括将所述时间曲线中的特征与预定模式相匹配的 步骤。
37. 根据权利要求36所述的方法，其中所述使用所述模式识别算法分析所 述时间曲线的步骤进一步包括对在所述时间曲线的特征和所述预定模 式之间的匹配的数量进行计数，从而确定所述检测时间间隔内被检测的 颗粒的净数量的步骤。
38. 根据权利要求37所述的方法，其中所述使用所述模式识别算法分析所 述时间曲线的步骤进一步包括将所述检测时间间隔内祐_检测的颗i^立的 净数量除以所述检测时间间隔内扫描的样本的总体积的步骤。
39. 根据权利要求38所述的方法，其中所述容器是圆柱形，其中所述平移 所述容器的步骤包括同时旋转并垂直反转所述容器，并且其中所述4吏用 所述模式识别算法分析所述时间曲线的步骤进一步包括使用下面的表 达式确定所述样本内的所述观察体积的,总长度的步骤 L = rr (d) x (vr) (t);其中d为容器的直径，Vr为容器的旋转速度并且t是选定的检测时间间 隔。
40. 根椐权利要求39所述的方法，其中使用下面的表达式计算所述检测时 间间隔内扫描的样本的总体积(V):V = (L) x (截面积)；其中L是所M定的皿的长度，并且截面积是沿与所述、M光的传播轴平行的轴的观察体积的横截面面积。
41. 根据权利要求31所述的方法，其中所述来自所述观察体积的所述荧光 强;l作为时间的函数被检测，检测时间为大约0. 5秒到大约10 ^^中的 范围。
42. —种用于分析样本中颗粒的设备，所述设备包括 至少部分透明的容器，用于容纳包含所述颗粒的所述样本；光源，用于产生提供给所述样本的激发光，从而使得至少部分所述颗粒产生荧光；用于收集来自位于所a器内的观察体积的荧光的装置；用于移动所述容器的装置，从而使至少部分所述颗粒传输穿过所述观察体积；与所述用于收集荧光的装置光通信的光电检测器，用于接收来自所述，见 察体积的至少部分所述荧光并测量其强度，从而产生所述荧光的时间曲 线；以及位于所述样本和所述光电检测器之间的多狭缝共焦孔，以便使荧光穿过 所述多狹缝共焦孔，并且被所述光电检测器接收。
43. 根据权利要求42所述的设备，其中所述用于收集荧光的装置以及所述 多狭缝共焦孔是共焦显微镜的组件。
44. 根据权利要求42所述的设备,其中所述多狭缝共焦孔是双狭缝共焦孑L。
45. 根据权利要求42所述的设备，进一步包括具有模式识别算法的处理器， 用于接收并分析由所述光电检测器产生的所述时间曲线。
46. 根据权利要求45所述的设备，其中所述模式识别算法确定所述颗粒在 所述观察体积中的位置。
47. —种用于分析样本中颗粒的积分颗粒测量系统，所述设备包括 至少部分透明的容器，用于容纳包含所述颗粒的所述样本；光源，用于产生提供给所述样本的激发光，从而使得至少部分所述颗粒产生荧光；用于收集来自位于所#器内的观奮本积的荧光的装置；用于移动所ii^器的装置，从而使至少部分所述颗粒传输穿过所述观察体积；与所述用于收集荧光的装置光通信的光电检测器，用于接收来自所述观 察体积的至少部分所述荧光并测量其强度，从而产生所述荧光的时间曲 线；以及用于将颗粒引入样本中的装置，所述装置与所述至少部分透明的容器可 操作地连接，以便将颗粒提供给所述样本。
48. 根据权利要求47所述的设备，其中所述用于将颗粒引入的装置是能够 向所述样^:供包含颗粒的液体或包含颗粒的气体的插入物。
49. 根据权利要求47所述的设备，其中所述用于将颗粒引入到所述样本的 装置是能够连续或滴状地向所述样4*供包含颗粒的液体的插入物。
50. 根据权利要求47所述的设备，其中所述用于将颗粒引入到所述样本的 装置是能够使包含颗粒的气体起泡穿过所述样本的试管。
全文摘要
本发明提供了用于检测、识别、分类并表征流体样本中颗粒的方法和设备。提供了具有可旋转和/或可平移的样本容器的光学分析器，用于测量以极低浓度存在的荧光颗粒的浓度，并且用于基于大小、形状、扩散常数和/或成分表征荧光颗粒。提供了使用模式识别数据分析技术和多信道检测的扫描光学分析器。
文档编号G01N21/64GK101147055SQ200680009509
公开日2008年3月19日 申请日期2006年1月27日 优先权日2005年1月31日
发明者A·塔哈里, E·格拉顿, G·莫托尔西 申请人:伊利诺伊大学评议会