在反射模式下工作的发光传感器的制作方法

专利名称：在反射模式下工作的发光传感器的制作方法
在反射模式下工作的发光传感器
本发明涉及定性和域定量的发光传感器，例如在反射模式下工作的发 光生物传感器或发光化学传感器。更具体地，本发明涉及包括至少一个填 充有介质的孔的发光传感器。本发明还涉及用于检测由一个或多个发光体 产生的发光辐射的方法，其中所述一个或多个发光体位于这种发光传感器 中的孔或狭缝结构中。
传感器广泛用于测量物理特性或物理事件。它们输出该测量的功能读 数作为电信号、光信号或数字信号。该信号是可以由其它装置转换成信息 的数据。传感器的具体例子是生物传感器。生物传感器是在诸如血液、血 清、血浆、唾液……的流体中检测目标分子是否存在(即定性)或测量其 特定量(即定量)的装置，所述目标分子例如为蛋白质、病毒、细菌、细胞成分、细胞膜、孢子、DNA、 RNA等，但不限于此。目标分子还被称为 "分析物"。在几乎所有的情况下，生物传感器都使用包括用于捕获分析物 的特定识别元件的表面。因此，传感器装置的表面可以由特异性结合材料 形成或者可以通过将特定分子附着到其上来修饰，所述特定分子适合于结 合存在于流体中的目标分子。
对于分析物与特定分子的最佳结合效率而言，大表面面积和短扩散长 度是非常有利的。因此，已经有人提议将微米或纳米多孔衬底(膜)作为 生物传感器衬底，其将大面积与快速结合动力学相结合。尤其是在分析物 浓度很低(例如低于lnM或低于lpM)时，扩散动力学在生物传感器化验 的总性能方面起着重要的作用。
所结合的分析物的量可以通过发光例如荧光来检测。在这种情况下， 分析物本身可能携有发光(例如荧光)标记，或者可以利用被发光标识(例 如被荧光标识)的第二识别元件进行附加温育。
检测所结合的分析物的量会受到几个因素的妨碍，如发光体的散射、 变白、衬底的背景发光以及激发光的不完全去除。此外，为了能够在被结 合的标记和溶液中的标记之间进行区分，必须进行一次或多次清洗步骤， 以除去未被结合的标记。
在具有子衍射受限(sub-diffraction-limited)空间分辨率的在流体内操 作的发光传感器中，光在子衍射受限孔或狭缝上反射。这在孔或狭缝内产 生渐逝场(evanescent field),其可以用于激发存在于此的发光体。用来自 传感器的第一侧的激发辐射照射发光传感器。产生的发光可能在与第一侧 相反的一侧，即与照射传感器的那一侧相反的一侧，射出传感器的孔或狭 缝，并且可以在此对其进行检测，以这种方式分离激发和发光辐射。或者， 由发光体产生的发光可能在第一侧，即在与照射传感器相同的一侧，射出 孔或狭缝，然后可以在此对其进行检测。
US 2003/0174992 Al描述了如何在生物传感器中使用子衍射受限孔。 孔的横向尺寸在激发光的衍射极限之下，这意味着激发光不能穿过这些孔。 这在孔内产生渐逝场。在与照射传感器相同的一侧上检测荧光辐射。然而， 该渐逝场的穿透深度与孔的横向尺寸的结合导致非常小的激发体积 (excitationvolume)。鉴于孔的受限横向尺寸，荧光体进入孔的机会很低。 结果，通常在激发体积内至多有一个荧光体，甚至在孔的外部具有相对高 的荧光体浓度。对于孔中的荧光体的数量的限制使得难以测量相对低浓度 的荧光体。
本发明的目的是提供包括孔或狭缝结构的改进的定性或定量的发光传 感器，例如发光生物传感器或发光化学传感器，以及用于检测由存在于这 种发光传感器中的至少一个孔或狭缝结构中的一个或多个光学可变分子 (例如发光体)产生的发光辐射的方法。本发明的优点是能够测量相对低 浓度的光学可变分子，例如荧光体。
更具体地，本发明涉及包括至少一个孔的发光传感器，所述至少一个 孔具有第一横向尺寸，其大于激发辐射在填充至少一个孔的介质中的衍射 极限。所述孔还具有第二横向尺寸，其小于激发辐射在填充至少一个孔的 介质中的衍射极限。
本发明的特别和优选的方案在独立权利要求和从属权利要求中体现。 来自从属权利要求的特征可以与独立权利要求的特征组合并且和其它从属
权利要求的特征进行适当组合，而不仅仅如权利要求所明确述的那样。
在本发明的第一方案中，提供一种发光传感器例，例如发光生物传感
器或发光化学传感器。该发光传感器包括 -至少一个孔，用于被介质填充； -存在于至少一个孔中的至少一个光学可变分子；
-激发辐射源，用于用激发辐射照射至少一个孔，所述激发辐射用于激 发至少一个光学可变分子；以及
-检测器，用于检测由至少一个光学可变分子产生的发光辐射，
其中所述至少一个孔具有第一横向尺寸和第二横向尺寸，所述第一横 向尺寸大于激发辐射在介质中的衍射极限，所述第二横向尺寸小于激发辐 射在介质中的衍射极限，并且其中所述激发辐射源和检测器位于传感器的 同一侧。
根据本发明的实施例，至少一个孔例如可以是狭缝或椭圆形孔或者可 以是具有第一横向尺寸和第二横向尺寸的任何其它孔，其中所述第一横向 尺寸大于激发辐射在填充至少一个孔的介质中的衍射极限，所述第二横向 尺寸小于激发辐射在填充至少一个孔的介质中的衍射极限。
光学可变分子可以是用其标识分析物分子的分子，并且其在被照射束 照射时总在发光。被结合的光学可变分子被显现，而未被结合的光学可变 分子被洗掉。或者，光学可变分子可以是用其标识分析物分子的标记分子， 并且其只在与附着到衬底上的分子结合时才发光。这形成施主-受主对。使 用清洗来获得严格性。松散结合的分子被清洗掉。在另一实施例中，在分 析物分子与它们结合时附着到衬底上的分子发光。使用清洗来获得严格性。 松散结合的分子被清洗掉。
或者，要被检测的分析物分子在用激发辐射如激发光照射时可以自身 发光，例如发荧光。在这种情况下，不需要标记，并且分析物分子自身用 作光学可变分子。
检测器例如可以是CCD或CMOS检测器。根据本发明的实施例，发光 传感器可以是发光生物传感器，例如荧光生物传感器。
根据本发明，激发辐射源和用于检测发光(例如荧光)辐射的检测器 位于传感器的同一侧。这意味着根据本发明的传感器在反射模式下工作。
在反射模式下工作的传感器相对于在透射模式下工作的传感器具有以下优 点可以收集更多的发光辐射，例如荧光辐射。而且，通过使用具有如上 所述的尺寸的孔，根据本发明的传感器可以用于检测相对低浓度的发光体。
因此，根据本发明的发光传感器具有比现有技术生物传感器高很多的 效率，即所检测到的发光(例如荧光)辐射的功率与用于存在于孔中的光 学可变分子如发光体(例如荧光体)的激发辐射(例如光)的功率之间的 比。
根据本发明的实施例，孔的第二横向尺寸可以小于激发辐射(例如光)在填充至少一个孔的介质中的波长的50%。更优选地，孔的第二横向尺寸 可以小于激发辐射(例如光)在填充至少一个孔的介质中的波长的40%。 后者与激发辐射(例如光)在填充至少一个孔的介质中的衍射极限的80% 相对应，因此，优选地，孔的第二横向尺寸可以小于激发辐射(例如光) 在填充至少一个孔的介质中的衍射极限的80%。
根据本发明的实施例，激发辐射(例如光)可具有波长，并且第一横 向尺寸可以大于激发辐射(例如光)在填充孔的介质中的衍射极限，但是 同时也可以小于激发辐射(例如光)的波长。
在本发明的实施例中，第一横向尺寸可以大于从光学可变分子发射的 辐射的波长，即大于发光(例如荧光)辐射的波长。
根据本发明的实施例，孔包括内表面壁，并且配合体可以固定在孔的 内表面壁上。通过使用识别一个或多个感兴趣目标的固定配合体，可以提 高发光传感器例如发光生物传感器或发光化学传感器的选择性。
优选地，可以使激发辐射(例如光)偏振，以抑制在孔后面以及在一 些情况下在孔内部的激发辐射。优选地，在光学可变分子的后面，即在与 设置激发辐射源的光学可变分子的那一侧相反的光学可变分子的一侧，可 以尽可能地抑制激发辐射，例如激发光。另一方面，优选在光学可变分子 前面的激发辐射，即在设置激发辐射源的光学可变分子的一侧的激发辐射 可以尽可能地高，即可以优选不对其进行抑制。
根据本发明实施例的发光传感器可以包括孔阵列。在一些实施例中， 孔阵列可以是周期性的孔阵列。
根据本发明的实施例，发光传感器还可以包括在传感器和用于抑制反射的激发辐射的检测器之间的波长滤波器。因此该滤波器的目标是阻挡被 孔反射的不需要的激发辐射。波长滤波器对于激发辐射(例如光)应该表 现出强抑制性，优选好于两个数量级，但是对于发光(例如荧光)辐射应
该基本上不表现出抑制性。发光(例如荧光)辐射的透射可以优选好于10%， 更优选地可以好于50%。
在本发明的第二方案中，提供一种用于检测由位于传感器的至少一个 孔中的至少一个光学可变分子产生的发光辐射的方法，所述至少一个孔用
于被介质填充。该方法包括
-通过从激发辐射源发射出来的激发辐射来激发至少一个光学可变分 子，所述激发辐射源位于至少一个孔的前侧；
-检测由被激发的至少一个光学可变分子产生的发光辐射；
其中所述至少一个孔具有第一横向尺寸和第二横向尺寸，所述第一横 向尺寸大于激发辐射在填充孔的介质中的衍射极限，所述第二横向尺寸小 于激发辐射在填充孔的介质中的衍射极限。该方法还包括在传感器的与设 置激发辐射源相同的一侧检测发光辐射。
根据本发明的实施例，至少一个孔例如可以是狭缝或椭圆形孔，或者 可以是具有第一横向尺寸和第二横向尺寸的任何其它孔，所述第一横向尺 寸大于激发辐射在填充至少一个孔的介质中的衍射极限，所述第二横向尺 寸小于激发辐射在填充至少一个孔的介质中的衍射极限。
光学可变分子可以是用其标识分析物分子的分子，并且其在被照射束 照射时总在发光。被结合的光学可变分子被显现，而未被结合的光学可变 分子被洗掉。或者，光学可变分子可以是用其标识分析物分子的标记分子， 并且其只在与附着到衬底上的分子结合时才发光。这形成施主-受主对。使 用清洗来获得严格性。松散结合的分子被清洗掉。在另一实施例中，在分 析物分子与它们结合时附着到衬底上的分子发光。使用清洗来获得严格性。 松散结合的分子被清洗掉。
或者，要被检测的分析物分子在用激发辐射如激发光照射时可以自身 发光，例如发荧光。在这种情况下，不需要标记，并且分析物分子自身用 作光学可变分子。
检测器例如可以是CCD或CMOS检测器。根据本发明的实施例，发光传感器可以是发光生物传感器，例如荧光生物传感器。
根据本发明，在传感器的同一侧进行激发光学可变分子和检测发光(例如荧光)辐射。这意味着根据本发明的方法是在反射模式下进行的。在反 射模式下检测光学可变分子或发光体相对于在透射模式下检测它们具有以 下优点可以收集更多的发光辐射，例如荧光辐射，即测量的效率更高。 而且，通过使用包括具有如上所述的尺寸的孔的传感器，根据本发明的方法可以用于检测相对低浓度的发光体。
因此，根据本发明的方法具有比用于检测光学可变分子的现有技术方 法高很多的效率，即所检测到的发光(例如荧光)辐射的功率与用于存在于孔中的发光体(例如荧光体)的激发辐射(例如光)的功率之间的比。
根据本发明的实施例，孔的第二横向尺寸可以小于激发辐射(例如光) 在填充至少一个孔的介质中的波长的50%。更优选地，孔的第二横向尺寸可以小于激发辐射(例如光)在填充至少一个孔的介质中的波长的40%。 后者与激发辐射(例如光)在填充至少一个孔的介质中的衍射极限的80% 相对应，因此，优选地，孔的第二横向尺寸可以小于激发辐射(例如光) 在填充至少一个孔的介质中的衍射极限的80%。
根据本发明的实施例，激发辐射(例如光)可具有波长，并且第一横 向尺寸可以大于激发辐射(例如光)在填充孔的介质中的衍射极限，但是同时也可以小于激发辐射(例如光)的波长。
优选地，可以通过使用激发辐射(例如光)来执行根据本发明的方法， 所述激发辐射由TE偏振辐射(例如TE偏振光)构成，将TE偏振辐射(例如光)定义为辐射，例如光，其电场的方向沿孔的第一横向尺寸。
根据本发明的实施例，孔包括内表面壁，并且该方法还可以包括在孔的内表面壁上固定配合体。通过在孔的内表面壁上固定识别一个或多个感兴趣目标的配合体，可以提高用于执行根据本发明的方法的发光传感器例如发光生物传感器或发光化学传感器的选择性。
本发明的上述和其它特点、特征和优点将通过以下结合附图进行的详细说明中变得显而易见，附图以举例的方式示出了本发明的原理。本说明书只用于举例，不限定本发明的范围。以下引用的参考图请参见附图。


图1示意性地示出具有狭缝孔的发光传感器中的"透射模式"和"反射模式"；
图2示意性地示出根据本发明的实施例的传感器；
图3示出对于TE和TM偏振以及对于不同狭缝宽度(w)的沿狭缝中心线的归一化强度(相对于XTO处的强度的归一化)；
图4示出对于TM偏振的沿狭缝中心线的归一化强度(相对于x=y=0 处的强度的归一化)；
图5示出对于在反射模式下工作的狭缝生物传感器的激发和发光检测 的效率；
图6示出对于在透射模式下工作的狭缝生物传感器的激发和发光检测 的效率。
在不同的附图中，相同的参考标记表示相同或相似的部件。
下面将针对具体实施例并参考特定附图来对本发明进行说明，但是本 发明不限于此，而仅受权利要求的限制。权利要求中的任何参考标记都不 应该视为限制保护范围。所述的附图只是示意性的而非限制性的。在附图 中，为了说明的目的，某些部件的尺寸会被放大而没有按比例绘制。在本 说明书和权利要求中使用的术语"包括"并不排出其它部件或步骤。在涉 及单数名词时使用不定冠词和定冠词，如"一"或"一个"、"该"，这包括 该名词的复数形式，除非有特定说明。
此外，说明书和权利要求中的术语第一、第二、第三等用于区别相同 的部件，并非一定用于描述连续或时间顺序。应该理解的是，如此使用的 术语在适当的情况下可以互换，并且这里所述的本发明的实施例能够按这 里所述或所示之外的其它顺序来操作。
本发明提供一种发光传感器，例如发光生物传感器或发光化学传感器。 在下文中，将主要参考发光生物传感器来对本发明进行说明，但这只是为 了便于说明，并非限制本发明。
根据本发明的发光传感器包括设有至少一个孔的衬底。根据本发明的 实施例，该传感器可以包括孔阵列。在一些实施例中，孔阵列可以是周期 性的孔阵列。在使用中，至少一个孔填充有介质。该介质可以是液体或气体，但也可以是真空的。在一些实施例中，介质包括要被检测的至少一个 光学可变分子，例如发光颗粒，如荧光颗粒。这些要被检测的颗粒将被表 述为"光学可变分子"或"发光体"。这种分子例如可以是荧光分子、电致 发光分子、化学发光分子等。光学可变分子可以用于标识存在于介质中的 分析物。
对于在分析物的标识中使用光学可变分子，有至少三个可行的解决方案
1) 用始终发光(例如发荧光)的光学可变分子标识分析物分子。那些 被结合的分子可以被显现，所有其它光学可变分子可以被洗掉。
2) 用标记分子标识分析物分子，所述标记分子只在其与附着到衬底上 的分子结合时才发光(例如发荧光)。以这种方式形成施主受主对。在这种 情况下采用清洗步骤来获得严格性，因为松散结合的分子将被洗掉。
3) 当分析物分子与附着到衬底上的分子结合时，所述附着到衬底上的 分子发光(例如发荧光)。再次使用清洗来获得严格性，因为松散结合的分 子被洗掉。
或者，要被检测的分析物分子在用激发辐射如激发光照射时可以自身 发光(例如发荧光)。在这种情况下，不需要标记，并且分析物分子自身用 作光学可变分子。
将对于附着到介质中的分析物的光学可变分子(即发光标记)对本发 明进行说明，与识别标记结合的分析物被洗掉，标记在由扫描传感器并撞 击到其上的照射束照射时发光。应该理解的是，这不限制本发明，本发明 还适用于上述的其它情况。
传感器与激发辐射源例如光源一起使用。光源以特定的波长或波长范 围发射光。对于其他波长具有类似激发特性的传感器可以通过使至少一个 孔的尺寸与激发辐射例如激发光的波长成比例来获得，只要孔材料和填充 至少一个孔的材料的折射率的波长相关性合理即可。例如，在所产生的发 光辐射是荧光辐射的情况下，激发辐射的光波长(在真空中)通常可以在 300到2000 nm的范围内，并优选可以在400到1100nm的范围内。
根据本发明，至少一个发光体(例如荧光体)存在于至少一个孔中， 用于被具有特定波长的激发辐射例如激发光来激发。至少一个孔具有第一
横向尺寸和第二横向尺寸，所述第一横向尺寸大于激发辐射例如激发光在 填充至少一个孔的介质中的衍射极限，所述第二横向尺寸小于激发辐射例 如激发光在填充至少一个孔的介质中的衍射极限。优选地，第二横向尺寸
可以小于激发辐射在填充孔的介质中的衍射极限的80% (进一步参见)。横 向尺寸是指孔在衬底的表面的平面中的尺寸，即横向尺寸不包括在衬底中 的深度。术语"孔"应该被广泛地解释。例如，可以适用于本发明的传感 器的孔可以是狭缝、洞、间隙或椭圆形孔，但是本发明不限于此。
应该知道，当孔的横向尺寸小于入射辐射在填充至少一个孔的介质中 的波长的一半时，几乎没有辐射例如光透过孔。通常，为了不使辐射在至 少一个孔内传播，需要隐失波，其为空间频率超出衍射极限的波。这意味 着对于给定波长X、填充孔的介质(即例如将传感器浸入在其中的介质)的 给定折射率n、以及适当选择的偏振(进一步参见)，孔的最小横向尺寸应 该小于X/(2*n)。因此，如果使用一个横向尺寸例如宽度小于浸渍流体中的 衍射极限的孔，例如，在该结构浸入在水中的情况下对于水孔的一个横向 尺寸例如宽度小于270 nm (在700nm的激发波长)，则只有渐逝场能够穿 透到孔中。
下面将通过具有相对于填充孔的介质的衍射极限来限定的横向尺寸的 孔来对本发明进行说明。
还相对于用于浸入在介质如流体中的发光传感器装置来对本发明进行 说明。然而，这不限制本发明。根据本发明的发光传感器装置包括用介质 填充的至少一个孔，所述至少一个孔具有第一横向尺寸和第二橫向尺寸， 所述第一横向尺寸大于激发辐射在介质中的衍射极限，所述第二横向尺寸 小于激发辐射在介质中的衍射极限。不必将发光传感器浸入在介质中；介 质还可以例如被喷射在传感器上并喷射到至少一个孔中，所述至少一个孔 具有大于激发辐射在介质中的衍射极限的一个横向尺寸和小于激发辐射在 介质中的衍射极限的一个横向尺寸，其优选小于填充孔的介质(例如流体) 的衍射极限。
本发明提供一种发光传感器，例如发光生物传感器或发光化学传感器， 其使用具有如上所述的横向尺寸的孔并在"反射模式"下工作。其优点在 于与在"透射模式"下工作的发光传感器相比，根据本发明的发光传感器将具有额外的效率，即所检测到的发光(例如荧光)辐射的功率与激发 辐射的功率之间的比。
下面将说明在"透射模式"和"反射模式"之间的差别。针对包括狭
缝的传感器进行说明，所述狭缝具有第一横向尺寸或长度L和第二横向尺 寸或宽度w，所述第一横向尺寸或长度L大于激发辐射在填充孔的介质中 的衍射极限，所述第二橫向尺寸或宽度w小于激发辐射在填充孔的介质中 的衍射极限。然而，应该理解的是，这还适用于包括狭缝以外的任何其它 孔的传感器，只要这些孔具有大于激发辐射在介质中的衍射极限的第一横 向尺寸和小于激发辐射在介质中的衍射极限的第二横向尺寸即可，例如椭 圆形孔。
图1示意性地示出这种发光传感器10，其中狭缝1用于发光体2 (例 如荧光体)的渐消失激发(evanescent excitation)。这可以通过利用例如由 狭缝1反射的TE偏振(沿着狭缝1的纵向的E场)激发辐射3 (例如激发 光)照射狭缝1来实现，因为激发辐射3 (例如激发光)在填充狭缝1的介 质中的衍射极限大于狭缝l的宽度w。这产生反射光束4。
在狭缝1内，存在渐逝场，用于激发发光体2，例如荧光体，以产生在 所有方向发射的发光辐射，例如荧光辐射。在狭缝1的前侧6 (即照射一侧) 的方向上发射发光辐射5，例如荧光辐射，并且朝狭缝1的背侧8，即位于 与照射一侧相反的一侧，发射发光辐射7，例如荧光辐射。大部分激发辐射 3 (例如激发光)被反射成反射束4，但在图1中由参考标记9表示的一些 激发辐射例如激发光可以在狭缝1的背侧8从传感器10泄漏出去。然而， 该剩余激发辐射9 (例如激发光)基本上受到狭缝1的抑制，因此它具有低 强度。
在本发明的进一步说明中，将提及"透射模式"和"反射模式"。这些 模式之间的差别在于在"反射模式"下，在检测器收集在基本上与激发 辐射3 (例如激发光)的方向相反的方向上传播的发光辐射5，例如荧光辐 射，所述检测器位于狭缝1的前侧6或位于设置用于照射传感器10的激发 辐射源(图1中未示出)的狭缝1的同一侧上，而在"透射模式"下，在 检测器检测在基本上与激发辐射3 (例如激发光)相同的方向上传播的发光 辐射7，例如荧光辐射，所述检测器位于狭缝1的背侧8或位于与设置激发辐射源的那一侧相反的一侧上。
如可以从图1中看到的那样，使用"透射模式"下的发光传感器的优 点在于所收集的发光辐射7 (假设对于在"透射"/ "反射"模式下工作 的传感器方向为离开背侧/前侧的所有激发辐射3分别由传感器12检测)和 所收集的激发辐射之间的比与在"反射模式"下相比要大。这是因为当激
发辐射9 (例如激发光)穿过狭缝1时受到抑制。狭缝1对发光辐射7 (例 如荧光辐射)的抑制要少得多，因为在大多数情况下发光体2(例如荧光体) 的取向是随机的，即包括TE和TM发光辐射，并且狭缝1对TE偏振辐射 (电场在狭缝1的长尺寸上的方向)例如TE偏振光的抑制比对TM偏振辐 射(电场在狭缝l的小尺寸上的方向)例如TM偏振光的抑制更强。然而， 仍然有相当一部分(即大约50%)的发光辐射7 (例如荧光辐射)受到狭 缝1的抑制。因此，使用"反射模式"相对于使用"透射模式"的优点是 可以收集到更多的发光辐射5，例如荧光辐射。
如由本发明在具有大于激发辐射的衍射极限的第一横向尺寸和小于激 发辐射的衍射极限的第二横向尺寸的孔中所引入的'反射模式'与目前的 现有技术传感器不一致，因为
US 2003/0174992 Al中的如上所述的反射模式系统不太适合于检测相 对低浓度的发光体，例如荧光体，这是由于分子行进到孔中的机会低，所 述孔的所有横向尺寸小于激发辐射在填充孔1 (例如狭缝)的介质中的衍射
基于2D子衍射极限(sub-diffiaction-limit)孔(即在两个横向方向上具 有子衍射极限尺寸的孔1)的生物传感器具有的发光(例如荧光)辐射5的 透射与根据本发明的传感器10相比差很多。这是因为在孔l内产生的发光 (例如荧光)辐射5只能耦合到被充分抑制的渐逝场。
因此，本发明提供发光传感器10，其在"反射模式"下工作并具有比 US 2003/0174992所述的生物传感器高很多的效率，即所检测到的发光(例 如荧光)辐射的功率与用于存在于孔中的发光体(例如荧光体)的激发辐 射(例如光)的功率之间的比。
在本发明的第一实施例中，提供发光传感器10，例如发光生物传感器 或发光化学传感器(参见图2)。发光传感器10包括设有至少一个孔1的衬底ll，所述至少一个孔1具有第一横向尺寸和第二横向尺寸W，所述第一 横向尺寸大于激发辐射在填充至少一个孔1的介质中的衍射极限，所述第 二横向尺寸w小于激发辐射在介质中的衍射极限。根据本发明的实施例，
第一横向尺寸可以大于激发辐射3 (例如激发光)在填充？L 1的介质中的衍 射极限，但是同时也可以小于激发辐射3 (例如激发光)的波长。优选地， 至少一个孔1的第二横向尺寸w可以小于激发辐射3在填充至少一个孔1 的介质中的波长的50%，最优选地，小于激发辐射3在填充至少一个孔1 的介质中的波长的40%。后者对应于激发辐射3在填充至少一个孔1的介 质中的衍射极限的80%。
第一和第二横向尺寸可以是孔1的长度L和宽度w。如上所述的孔1 可以具有某种细长的形式，因为在两个方向上有尺寸差。可以用于本发明 的孔1的例子是狭缝或椭圆形孔。
在本发明的实施例中，术语"衬底"可以包括任何基底材料或可以使 用或者可以在其上形成器件、电路或外延层的材料，只要其至少一部分对 于激发光不是透明的即可。在其它可选实施例中，该"衬底"可以包括半 导体衬底，例如掺杂硅、砷化镓(GaAs)、磷砷化镓(GaAsP)、磷化铟(InP)、 锗(Ge)、或硅锗(SiGe)衬底。除了半导体衬底部分之外，该"衬底"可
以包括例如绝缘层，如Si02或Si3N4层。因此，术语衬底还包括玻璃上硅、
蓝宝石上硅衬底。因此术语"衬底" 一般用来限定用于在感兴趣的层或部 分下面的层的部件。而且，"衬底"可以是在其上形成层的任何其它基底， 例如玻璃、塑料或金属层。例如，至少一个孔1可以形成在沉积在玻璃板 或另一透明衬底的顶部上的非透明材料中。在另一例子中，可以通过对于 激发辐射3 (例如激发光)是非透明的层来限定和刻蚀至少一个孔l，而无 需具有支撑底部以便例如流体可以流过衬底11。
对于衬底材料的主要要求是，与孔1相邻，对于激发辐射3 (例如激发 光)是非透明的，换言之，对于激发辐射3衬底材料具有大的衰减。这意 味着孔1延伸到其中的材料叠层的至少一部分对于激发辐射3(例如激发光) 应该是非透明的，或者在孔1之间的衬底材料对于激发辐射3(例如激发光) 是非透明的。这是很重要的，即使在本发明的情况下也是如此，其中利用 反射进行测量，因为假如在仍然具其至少一个横向尺寸小于激发辐射3 (例如光)的衍射极限的孔1的同时材料叠层是完全透明的，则激发辐射3(例 如光)可以穿过所述叠层进行传播。
根据本发明的实施例，晶片衬底11可以包括具有如上所述的横向尺寸的孔1的阵列。根据本发明的实施例，孔1的阵列可以是孔1的周期性阵列，即相邻孔1之间的距离相等的阵列。然而，这不是必须的；相邻孔1之间的距离也可以不同或者是可变的。
当使用具有第一横向尺寸和第二横向尺寸的孔1时，其中所述第一横向尺寸大于激发辐射例如光在填充孔1的介质中的衍射极限，所述第二横向尺寸小于激发辐射例如光在填充孔1的介质中的衍射极限，与使用所有横向尺寸都小于填充针孔的介质的衍射极限的子波长针孔相比，可以获得 更好的检测效率。这是因为在第一种情况下对发光辐射(例如荧光辐射)的抑制要小得多，因为这种抑制与偏振有关。这种偏振相关性将在下面通 过包括至少一个狭缝1的传感器来解释。然而，应该理解的是，这不限制 本发明，并且这也可以适用于包括任何具有第一横向尺寸和第二横向尺寸的孔1的传感器，其中所述第一横向尺寸大于激发辐射在填充孔1的介质 中的衍射极限，所述第二横向尺寸小于激发辐射3 (例如激发光)在填充孔l的介质中的衍射极限，优选小于其80%或更小。
下面将解释场如何在孔1内延迟以及TM偏振发光辐射为什么可以逃离孔1。图3和4示出沿着狭缝1的中心(x-O)的归一化强度(相对于x=y=0 处的强度的归一化)。在计算中，假设金衬底中的狭缝具有0.038-j*5.07的 复数折射率和700 nm的激发波长。图3以对数坐标[dB]示出针对TE偏振 光对于宽度w为200 nm、深度d为1000 nm (曲线13)和300 nm (曲线 14)的狭缝1的辐射的透射的偏振相关性，以及针对TM偏振光对于宽度w 为200 nm、深度d为300nm (曲线15)、 600nm (曲线16)和1000 nm (曲 线17)的狭缝1的辐射的透射的偏振相关性。图4示出对于TM偏振光沿 着狭缝1的中心线(x=0)和对于深度为300 nm (曲线18)、 600 nm (曲 线19)和1000 nm (曲线20)的狭缝1的强度(线性坐标)。
从图3或图4中可以得出如下结论-
1 、对于TM偏振辐射光穿过如上限定的孔的透射明显大于TE偏振(参见图3)。
2、 对于TM偏振光的强度图形看起来好像驻波(在y方向上的干涉图 形)(参见图4)。
3、 比较曲线18到20，它们都是在TM偏振辐射的情况下，但是针对 狭缝l的不同深度，对于较高的深度仍然存在驻波图形(对于TM偏振)(参 见图4)。可以看到，对于增加的深度d (曲线18到20)，激发辐射例如光 仍然存在于狭缝1的输出(y=d)，并且对于更深入到狭缝1中的位置y没 有明显衰减。
4、 似乎有某种取决于狭缝l的深度d的谐振效应(参见图4，特别是 曲线19)。
因此，辐射穿过孔l的透射表现出强的极化相关性，即对于TE偏振状 态(E场平行于狭缝的长度L)的透射明显低于TM偏振状态。对于孔l内 的TM偏振辐射的强度分布是驻波图形，这表示Fabiy-Perot效应；这还得 到对于600nm (曲线19)的狭缝高度的更强的最大归一化强度的支持，即 谐振效应。在孔1的后面，TE偏振辐射的强度快速下降，这归因于狭缝l 后面的自由空间中的发散。
在子衍射受限针孔的情况下，如在上述的现有技术发光传感器中使用 的那样，由于针孔对于发光(例如荧光)辐射也具有子衍射受限横向尺寸， 因此也出现涉及检测效率的问题。这意味着正如激发辐射那样，荧光辐射 也受到针孔的抑制，使得荧光辐射难以被检测，即荧光辐射难以到达检测 器。
由于上述原因，根据本发明，激发辐射3例如激发光优选被偏振，使 得其受到孔l的充分抑制。然而，由于所产生的发光辐射5、 7例如荧光辐 射在大多数情况下被随机偏振，平均有至少50%的所产生的发光辐射5、 7 例如荧光辐射可以离开孔1而基本上不受抑制。这是因为在孔1的内部产 生的发光(例如荧光)辐射5、 7的TE偏振部分受到孔1的充分抑制。发 光(例如荧光)辐射5、 7的TM偏振部分可以经由孔1的底部和顶部出离 孔1。为了避免孔1对发光(例如荧光)辐射5、 7的明显抑制，所发射的 辐射的波长应该小于对于其孔1的第二尺寸小于衍射极限的最小波长。该 波长等于2*L*n，其中n是填充孔1的介质的衍射极限，L是孔1的长度。 与已知的"透射模式"相比，这大大增加了检测所产生的发光辐射5、 7例
如荧光辐射的效率。
根据本发明，检测器12可以设置在衬底11的与设置激发辐射源(未 示出)相同的一侧上，即与朝向发光传感器10发出激发辐射3例如激发光 相同的一侧。在进一步的说明中，衬底11的设置激发辐射源和检测器12 的一侧将被称为前侧6，而相反的一侧将被称为衬底11的背侧8.
在使用中，根据本发明的发光传感器10可以浸入在浸渍介质中，例如 所述浸渍介质可以是液体或气体，如水或空气。液体或气体可以包括也被 称为分析物分子的物质，例如珠或分子或被标识的目标分子，通过根据本 发明的发光传感器IO对其进行感测或检测。
用激发辐射例如激发光(由箭头3所示)从前侧6照射如图2所示的 发光传感器10。根据本发明，发光传感器10的衬底11中的孔1具有第一 横向尺寸，例如长度L 一在图2中未示出，其大于激发辐射3例如激发光 在填充孔1的介质中的衍射极限，以及第二横向尺寸，例如宽度w，其具 有子衍射受限尺寸，即第二横向尺寸小于激发辐射3例如激发光在填充孔1 的介质中的衍射极限。 -
孔1应该具有小于激发辐射3例如激发光在浸渍流体中的衍射极限， 即应该小于在填充孔l的介质内部的波长的一半，即<^(2*11);其中n是填 充孔1的介质的折射率，X是辐射源在真空中的波长。
这样，根据本发明，检测器12设置在发光传感器10的与激发辐射源 (未示出)相同的一侧，即位于晶片衬底11的前侧6，并因此位于发光传 感器10的前侧，通过检测器12检测在晶片衬底11的前侧6离开孔1的发 光辐射5，例如荧光辐射。
可以通过任何适当的检测器12，例如使用电荷耦合装置(CCD)或互 补金属氧化物半导体(CMOS)检测器，来进行对发光辐射5例如荧光辐射 的强度的检测。或者，可以使用扫描方法，其中只获得小的成像视图。在 特定时间内在光电二极管上收集光，使得可以获得最佳信噪比。这可以大 大增加传感器10的灵敏度。
应该注意的是，与在透射模式下工作的子衍射受限制传感器相比，本 发明具有以下缺陷孔1并不有助于对由孔1反射的激发辐射3例如激发 光的抑制。对于"透射模式"下的子衍射受限传感器10也是如此，因为这些传感器至少部分地分离激发辐射3 (例如激发光)和发光辐射7 (例如荧 光辐射)。然而，在"反射模式"下工作的传感器10不抑制反射的激发辐 射4，例如激发光，因此反射的激发辐射4 (例如激发光)也到达检测器12。 结果，根据本发明的发光传感器10在检测器12的前面，即在传感器10的 前侧6和检测器12之间还需要波长滤波器。可以用于本发明的滤波器的例 子如下
1) 陷波滤波器，其抑制激发辐射3例如激发光的波长周围的非常窄的 频带，有效地几乎完全地滤除激发辐射3，例如激发光，而基本上不对发光
(例如荧光)辐射5进行滤波，因为在多数情况下发光辐射例如荧光辐射 为最大的波长不同于激发辐射3例如激发光的波长，并且发光辐射5例如 荧光辐射的波长带宽一般明显大于激发辖射源的带宽。
2) 作为可选方案，可以使用带通滤波器，其使发光(例如荧光)辐射 5通过而充分抑制激发辐射3，例如激发光。
3) 基于类似理由，在对于大于激发辐射3例如激发光的波长的波长基 本上产生发光(例如荧光)辐射5的情况下也可以使用高通滤波器，或者 在对于较小的波长基本上产生发光(例如荧光)辐射5的情况下也可以使 用低通滤波器。后者可以是对于例如第二谐波产生的情况。
4) 也可以使用光谱仪(specto-meter)，其在光谱上分解所组合的反射 激发辐射3 (例如激发光)和发光(例如荧光)辐射5。
波长滤波器对于反射激发辐射4例如激发光应该表现出强抑制性，优 选高于两个数量级，但是对于在传感器12的方向上照射的发光辐射5例如 荧光辐射应该表现出基本上没有抑制性。发光(例如荧光)辐射5通过波 长滤波器的传输优选好于10%，更优选可以好于50%，进一步优选大于70 %。因此该滤波器的目的是阻挡不需要的被孔1反射的激发辐射4，因为孔 1的宽度w小于激发辐射3例如激发光在填充孔的介质中的衍射极限，同 时尽可能多地传输所产生的发光辐射5。
根据本发明的实施例的发光传感器10的优点在于由于它包括具有第 一横向尺寸和第二横向尺寸的孔1，其中所述第一横向尺寸大于激发辐射在 填充孔1的介质中的衍射极限，所述第二横向尺寸小于激发辐射在填充孔1 的介质中的衍射极限，并且由于它在"反射模式"下工作，因此发光传感器10能够有效地测量发光体2例如荧光体的浓度。
在"反射模式"下使用的发光传感器IO具有比在"透射模式"下使用 的传感器更好的效率的原因可以理解如下。由发光体2例如荧光体经受的 TE偏振激发辐射3例如激发光的强度随着发光体2例如荧光体在孔1中的 深度的增加(远离设置激发辐射源的前侧)而呈指数减小。
对于TM偏振发光(例如荧光)辐射，这意味着假设TM偏振发光(例 如荧光)辐射基本上不受孔1的抑制，则"利用反射"检测到的发光(例 如荧光)辐射5随着从孔1中的发光体2例如荧光体的前侧测量的距离的 增加而呈指数减小。对于TM偏振发光(例如荧光)辐射，在透射和反射 模式之间不存在效率差别。
对于TE偏振发光(例如荧光)辐射，发光(例如荧光)信号乘以附加 因数，该附加因数随着从在孔l内部的发光体2例如荧光体到检测器12的 距离的增加而呈指数减小。相对简单的数学分析表明组合效率与孔1中的 发光体2例如荧光体的距离y成比例，在所述数学分析中假设孔1内部的 辐射的衰减常数a对于激发辐射4 (例如光)和发光(例如荧光)辐射5 是相似的，依据如下
Exp(-2*a*y) (1) 对于反射模式下的检测，以及
Exp(-a*d) (2) 对于透射模式下的检测，d是孔l的深度，
这显示出在距离y〈d/2，对于发光体2例如荧光体，反射模式下的组合 效率比透射模式好。而且，透射模式下的效率与发光体2例如荧光体的距 离y无关，因此对于y^/2的效率大于y〉d/2的效率。在平均情况下，其中 假设发光体2例如荧光体的位置y正常分布在孔1的深度d上，反射模式 下的效率好于透射模式，因为这种传感器的组合效率不仅取决于光学可变 分子在孔l内的位置。
平均起来，根据本发明的在反射模式下使用的发光传感器IO与在透射 模式下使用发光传感器10时相比要具有更高的效率。
在本发明的优选实施例中，发光传感器IO包括作为孔的狭缝1。在这 种情况下，第一横向尺寸是狭缝1的长度(L)，第二横向尺寸是狭缝l的 宽度。在这种情况下，狭缝1的长度大于激发辐射3例如激发光在填充狭 缝1的介质中的衍射极限。狭缝1的宽度w小于激发辐射3例如激发光在填充狭缝l的介质中的衍射极限，例如，在水是存在于狭缝l中的流体时，小于水的衍射极限。在特殊情况下，第一横向尺寸或长度L可以大于激发辐射3例如激发光在填充狭缝1的介质中的衍射极限，但同时可以小于激 发辐射3例如激发光的波长。
图5示出对于在反射模式下工作的狭缝生物传感器作为在狭缝1内的 位置的函数，对于发光体2 (在例子中给定为荧光体)的激发效率(曲线 21)、检测效率(曲线22)和组合效率(曲线23)。狭缝l的深度是狭缝l 内部的场的衰减长度的两倍。在该图中，可以看出激发效率(曲线21)在 狭缝1的入口处最高，因为这是激发辐射3例如激发光具有最高强度的地方。由于在"反射模式"下使用生物传感器，因此发光辐射(例如荧光辐 射)检测效率(曲线22)在这一点也是最高的。在狭缝l的出口处，激发 和检测效率(分别为曲线21和22)最低。应该注意的是，当假设平均状态下由发光体2例如荧光体产生的辐射是50XTE偏振和50XTM偏振化时， 由于如上所述的偏振效应，而使最低点处的检测效率(曲线22)为50%。
为了比较，图6示出了相同的曲线，即激发效率(曲线21)、检测效率 (曲线22)和组合效率(曲线23)，但是现在是对于在"透射模式"下工作的狭缝生物传感器。如预期的那样，检测效率(曲线22)现在在狭缝1 的出口处最高。
通过组合激发和检测效率的效果，可以比较在"反射模式"和"透射模式"下的狭缝1。已经发现通过使用等式(1)和(2)，"反射模式"下的狭缝l比在透射模式下多给出40%的发光信号，例如荧光信号，如假设 狭缝1的深度是狭缝1中的场的衰减长度的两倍。
因此，根据本发明的在"反射模式"下工作的发光传感器10与在"透射模式"下工作的现有技术子波长生物传感器相比具有更大的发光信号，例如荧光信号。与利用如前所述在"反射模式"下的现有技术2D子波长生 物传感器获得的值相比，效率的增益大约为47%。
在根据本发明的另一实施例中，孔1可以是椭圆形孔。在椭圆形孔的情况下，第一横向尺寸稍微大于激发辐射3例如激发光在填充椭圆形孔1的介质中的衍射极限，第二横向尺寸稍微小于激发辐射3例如激发光在填 充椭圆形孔1的介质中的衍射极限。优选地，第二横向尺寸小于激发辐射
(3)在所述介质中的衍射极限的80%。
与狭缝相比，这些椭圆形孔1表现出更大的表面面积，为发光体2例 如荧光体提供更多的结合位置。此外，当在晶片衬底11上都形成椭圆形孔 l时，使得它们可以在流过安装(flow-through set-up)中使用，与在晶片衬 底11上都形成狭缝时相比，该晶片衬底11在机械上将更强。然而，狭缝1 表现出比椭圆形孔1更好的偏振相关性，这是由于大长度L，而使对TM偏 振光的抑制将显著降低，只要椭圆形孔1的长度L明显小于狭缝1的长度L 即可。这导致更好的检测效率。因此，使用具有包括狭缝1的衬底11的传 感器IO优选于使用具有包括椭圆形孔1的衬底11的传感器10。
在根据本发明的实施例中，通过使用可以识别一个或多个感兴趣的目 标(也称为分析物)的表面固定不动的配合体，可以提高发光传感器10例 如发光生物传感器或发光化学传感器的选择性。在必须检测一个以上的分 析物的情况下，发光传感器10可以包括不同配合体的阵列。适当的配合体 的例子可以是蛋白质、抗体、适体、縮氨酸、低聚核苷酸、糖、凝集素等。 可以将配合体例如通过适当的表面化学方法固定到至少一个孔1的内表面 壁上(由图2中的附图标记24所示)。表面化学方法的选择只取决于内表 面壁24的化学成分。
例如，当孔l形成在诸如金、银、Cu或Al的金属中时，可以将自组 装单体沉积在内表面壁24上，例如使用包括第一反应基团的反应物，第一 反应基团例如为巯基(sulfhydryl group)和/或羧基，其适合于与孔1的内 表面壁24结合。反应物还应该包括可以用于固定配合体的第二反应基团。 例如，第二反应基团可以是能够在化学上被激活以与水溶液中的配合体的 伯胺基结合的羧基。其它的与各种不同化学表面的固定策略在本领域是已 知的。
在本发明的实施例中，包括分析物的溶液可以受压穿过孔l，以便便于 例如通过抽吸(pumping)使分析物与配合体结合。这种抽吸可以重复几次。 或者，可以使用横向流，其中流体的一部分流过孔l。
应该理解的是，尽管在本文中对于根据本发明的装置已经讨论了优选 实施例、特殊构造和结构以及材料，但是在不脱离本发明的范围和精神的 情况下可以做出形式上的和细节上的各种改变或修改。例如，应该理解的
是，本发明不限于使用狭缝或椭圆形孔作为孔l，还可以使用任何其他形状 的具有第一横向尺寸和第二横向尺寸的孔1，所述第一横向尺寸大于激发辐
射在介质中的衍射极限，所述第二横向尺寸小于激发辐射在介质中的衍射 极限，例如小于填充孔1的介质的衍射极限。
权利要求
1、一种发光传感器(10)，包括用于被介质填充的至少一个孔(1)；存在于所述至少一个孔(1)中的至少一个光学可变分子(2)；激发辐射源，用于利用激发辐射(3)照射所述至少一个孔(1)，以激发所述至少一个光学可变分子(2)；以及用于检测由所述至少一个光学可变分子(2)产生的发光辐射(5)的检测器(12)，其中所述至少一个孔(1)具有第一横向尺寸和第二横向尺寸，所述第一横向尺寸大于所述激发辐射(3)在所述介质中的衍射极限，所述第二横向尺寸小于所述激发辐射(3)在所述介质中的衍射极限，并且其中所述激发辐射源和所述检测器(12)位于所述传感器(10)的同一侧。
2、 根据权利要求1所述的发光传感器(10)，其中所述第二横向尺寸小于所述激发辐射(3)在所述介质中的衍射极限的80%。
3、 根据权利要求1所述的发光传感器(10)，所述激发辐射(3)具有波长，其中所述第一横向尺寸小于所述激发辐射(3)的波长。
4、 根据权利要求1所述的发光传感器(10)，其中所述第一横向尺寸大于从所述光学可变分子发射的辐射的波长。
5、 根据权利要求1所述的发光传感器(10)，所述至少一个孔(1)包括内表面壁(16)，其中将配合体固定在所述至少一个孔(1)的所述内表 面壁(16)上。
6、 根据权利要求1所述的发光传感器(10)，其中使所述激发辐射(3) 偏振，使得所述激发辐射(3)在所述至少一个孔(1)中受到抑制。
7、 根据权利要求1所述的发光传感器(10)，包括孔(1)的阵列。
8、 根据权利要求1所述的发光传感器(10)，其中所述至少一个孔(1) 是狭缝或椭圆形孔。
9、 根据权利要求1所述的发光传感器(10)，还包括在所述传感器(10) 和所述检测器(12)之间的波长滤波器，所述波长滤波器用于抑制反射的激发辐射(4)。
10、 根据权利要求1所述的发光传感器(10)，其中所述检测器(12) 是CCD或CMOS检测器。
11、 根据权利要求1所述的发光传感器(10)，其中所述传感器(10) 是发光生物传感器。
12、 根据权利要求11所述的发光传感器(10)，其中所述发光生物传 感器(10)是荧光生物传感器。
13、 一种用于检测由存在于传感器的至少一个孔(1)中的至少一个光学可变分子(2)产生的发光辐射(5)的方法，所述至少一个孔(1)用于被介质填充，该方法包括通过从激发辐射源发射的激发辐射(3)激发所述至少一个光学可变分子(2)，所述激发辐射源位于所述至少一个孔的前侧(6);检测由所述被激发的至少一个光学可变分子(2)产生的发光辐射(5);其中所述至少一个孔(1)具有第一横向尺寸和第二横向尺寸，所述第一横向尺寸大于所述激发辐射(3)在所述介质中的衍射极限，所述第二横向尺寸小于所述激发辐射(3)在所述介质中的衍射极限，并且该方法包括:在传感器的与所述激发辐射源相同的一侧上检测所述发光辐射(5)。
14、 根据权利要求13所述的方法，其中所述第二横向尺寸小于所述激发辐射(3)在所述介质中的衍射极限的80%。
15、 根据权利要求13所述的方法，所述激发辐射(3)具有波长，其 中所述第一横向尺寸小于所述激发辐射(3)的波长。
16、 根据权利要求13所述的方法，其中所述激发辐射(3)由TE偏振 辐射构成。
17、 根据权利要求13所述的方法，所述至少一个孔(1)包括内表面 壁(16)，其中该方法还包括将配合体固定到所述至少一个孔(1)的所述 内表面壁(16)上。
全文摘要
本发明涉及一种发光传感器(10)，例如发光生物传感器或发光化学传感器，其包括具有第一横向尺寸和第二横向尺寸的至少一个孔(1)，所述第一横向尺寸大于激发辐射(3)在填充至少一个孔(1)的介质中的衍射极限，所述第二横向尺寸小于激发辐射(3)在填充至少一个孔(1)的介质中的衍射极限。本发明还涉及用于检测由至少一个孔(1)中的至少一个光学可变分子(2)如荧光体产生的发光辐射(5)如荧光辐射的方法。优选地，使激发辐射(3)偏振以抑制孔(1)中的激发辐射(3)。根据本发明的发光传感器(10)能够检测相对低浓度的光学可变分子(2)，例如荧光体。
文档编号G01N21/63GK101346621SQ200680048526
公开日2009年1月14日 申请日期2006年12月19日 优先权日2005年12月22日
发明者D·J·W·克隆德, H·R·施塔伯特, M·M·J·W·范赫佩恩 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司