包含骨桥蛋白和癌胚抗原的标记物组合在结肠直肠癌的评估中的用途的制作方法

专利名称：：包含骨桥蛋白和癌胚抗原的标记物组合在结肠直肠癌的评估中的用途的制作方法200680048492.5包含骨桥蛋白和癌胚抗原的标记物组合在结肠直肠癌的评估中的用途本发明涉及帮助评估结肠直肠癌(=CRC)的方法。公开了包含骨桥蛋白和癌胚抗原的标记物组合在结肠直肠癌的评估中的用途。此外，它特别涉及通过测量样品中至少标记物骨桥蛋白和癌胚抗原来从来自个体的液体样品评估结肠直肠癌的方法。包含骨桥蛋白和癌胚抗原的标记物组合可以，例如，用于结肠直肠癌的早期检测或用于监督经历了治疗例如手术的患者。尽管在检测和治疗方面有进展，癌症仍然是主要的公共卫生挑战。在各种类型的癌症中，结肠直肠癌(=CRC)是西方世界最常见的癌症之一。结肠直肠癌最经常地从腺瘤(息肉)发展为恶性癌。CRC的不同阶段曾经根据Dukes，阶段A到D来分类。癌症的分期是就程度、发展和严重度而言的疾病的分类。它将癌症患者分组，从而关于预后和治疗选择可以进行普遍化。当今，TNM系统是癌症的解剖学范围上最广泛使用的分类法。它代表了国际公认的、统一的分期系统。其中有三种基本变量T(原发肿瘤的程度)、N(区域性淋巴结的状态)和M(远距离转移的存在或不存在)。由UICC(国际癌症防治联合会)公开了TNM指标(Sobin,L.H.andFleming,I.D.,Cancer80(1997)1803-1804)。特别重要的是，CRC的早期诊断转变为好得多的预后。大多数结肠直肠的恶性肿瘤看起来来自于良性胂瘤，即，来自腺瘤。因而，最好的预后是在腺瘤阶段诊断出的那些患者。在早至阶段I^,N0，MO或Tl-3;NO;MO诊断的患者如果适当地治疗，在诊断后有超过90%的5年存活机会，相比较的，当已经存在远距离转移时诊断的仅10%的5年存活率。在本发明的意义上，CRC的早期诊断是指处于前恶性状态(腺瘤)或处于完全没有转移(既没有近端也没有远端)的胂瘤阶段的诊断结论，即，存在腺瘤、Tis、NO、M0或Tl-4;NO;MO。丁18表示原位癌。进一步优选的，当完全没有生长通过肠壁因而既没有腹膜脏层穿孔也没有其他器官或结构被侵入时诊断CRC,即，该诊断结论在阶段Tis、N0、M0或Tl-3;NO;M0(=Tis-3;NO;MO)^故出。癌症被检测/诊断越早，总体存活率越好。这对于CRC是特别符合的。在肿瘤的发展阶段中的预后是不良的。在诊断后五年内超过三分之一的患者将死于进行性疾病，相应于约40%的五年存活率。当前的治疗仅仅治愈一小部分患者，对于在疾病的早期阶段诊断的那些患者明显具有最好的效果。对于作为公众健康难题的CRC，必须的是开发对于结肠直肠癌的更有效的筛选和预防措施。当前对于结肠直肠癌可用的最早期的检测过程涉及使用粪便潜隐血或内窺镜操作。然而，在检测出粪便血液之前一般必须有显著的肿瘤大小。基于愈创木脂的粪便潜隐血测试的敏感性是-26%,其意味着具有恶性病变的74%的患者将仍未被测出。(Ahlquist,D.A.,Gastroenterol.Clin.NorthAm.26(1997)41-55)。前癌性和癌性病变的可视化是早期检测的最好方法，但是结肠镜检查是侵入性的，具有显著的费用、风险和并发症。(Silvis,S.E.,等人，JAMA235(1976)928-930;Geenen,J.E.，等人，Am.J.Dig.Dis.20(1975)231-235;Anderson,W.F.,等人，J.Natl.CancerInstitute94(2002)1126-1133)。为了具有临床实用性，作为单一标记物的新的诊断标记物应当至少与本领域已知的最好的单一标记物一样好。或者，新的标记物应当产生诊断敏感性和/或特异性方面的进展，如果分别地单独使用或与一种或多种其他标记物组合使用。测试的诊断敏感性和/或特异性通过它的接受者操作特征来最好地评定，其将在下文详细描述。结肠直肠癌中生物化学标记物的临床实用性近来已经由关于肿瘤标记物的欧洲集团(EGTM)(Duffy，M丄，等人，Eur.J.Cancer39(2003)718-727)综述了。目前，基于肿瘤相关糖蛋白癌胚抗原(CEA)的检测的主要诊断性血液测试可以用于帮助CRC领域的诊断。CEA在患有结肠直肠、胃和胰腺癌以及在大部分乳腺、肺以及头颈癌症的患者获得的95%的组织样品中提高(Goldenberg，D.M.，等人，J.Natl.CancerInst.(Bethesda)57(1976)11-22)。提高的CEA水平还在患有非恶性疾病的患者中报道，具有新近岸企测的结肠直肠癌的许多患者具有血清中的正常CEA水平，特别是在疾病的早期阶段(Carriquiry,L.A.，和Pineyro，A.，Dis.ColonRectum42(1999)921-929;Herrera,M.A.,等人，Ann.Surg.183(1976)5-9;Wanebo,H.J.,等人，N,Engl.J.Med.299(1978)448-451;Wanebo,H,J.，等人，上文)。在检测复发中从血清或血浆测量的CEA的实用性据报道是争议性的，尚未被广泛地应用(Martell，R.E.,等人，Int.J.Biol.Markers13(1998)145-149;Moertel,C.G,,等人，JAMA270(1993)943-947)。根据可获得的数据，血清CEA测定对于允许它在无症状群体中作为结肠直肠癌的筛选测试既没有敏感性也没有特异性(Reynoso,G.,等人，JAMA220(1972)361-365;Sturgeon,C.，ClinicalChemistry48(2002)1151-1159)。全血、血清或血浆是在临床常规实验中最广泛使用的样品来源。将帮助可靠的癌症检测或提供早期预后信息的早期CRC肿瘤标记物的鉴定可以产生将很大地帮助这种疾病的诊断和管理的诊断性分析.因而，存在着急迫的临床需求来改善CRC的体外评估。改善CRC的早期诊断是特别重要的，因为与在疾病的发展期诊断的那些患者相比，早期诊断的患者存活率机会要高得多.本发明的任务是研究是否可以鉴定出可以在评估CRC使用的生物化学标记物。令人惊讶地，发现的是，包含骨桥蛋白和癌胚抗原的标记物组合可以至少部分地克服本领域现有技术已知的难题。发明概述本发明涉及体外评估结肠直肠癌的方法，包括测量样品中骨桥蛋白的浓度、测量样品中癌胚抗原的浓度、和任选地测量一种或多种其他结肠直肠癌标记物，并且组合分别对骨桥蛋白、癌胚抗原和任选的一种或多种其他结肠直肠癌标记物所测定的浓度用于评估结肠直肠癌的步骤。还公开的是标记物组合骨桥蛋白和癌胚抗原在结肠直肠癌的评估中的用途，以及包含骨桥蛋白、癌胚抗原和一种或多种其他结肠直肠癌标记物的标记物组(panel)在结肠直肠癌的评估中的用途。本发明进一步涉及用于根据本发明进行评估CRC的方法的试剂盒，其包含特异性地测量骨桥蛋白和癌胚抗原所需的试剂。发明的详细说明在优选的实施方式中，本发明涉及体外评估结肠直肠癌的方法，包括步骤a)测量样品中骨桥蛋白的浓度，b)测量样品中癌胚抗原的浓度，和c)任选地测量一种或多种其他结肠直肠癌标记物，以及d)组合在步骤(a)、(b)中测定的浓度，和任选地在步骤(c)中测定的浓度用于评估结肠直肠癌。骨桥蛋白(OPN):OPN在正常血浆、尿液、奶和胆汁中发现(US6,414,219;US5,695,761;Denhardt,D.T.andGuo,X.，FASEBJ.7(1993)1475-1482;Oldberg,A.,等人，PNAS83(1986)8819-8823;Oldberg,A.,等人，J.Biol.Chem.263(1988)19433-19436;Giachelli,C.M.,等人，TrendsCardiovasc.Med.5(1995)88-95)。已经分离和测序了人类OPN蛋白质和cDNA(KieferM.C.，等人，Nucl.AcidsRes.17(1989)3306)。OPN功能在于细胞粘附、趋化性、巨噬细胞指导的白细胞介素-10(IL-10)抑制、逆境依赖性血管生成、细胞凋亡的防止、通过调节细胞-基质相互作用的锚依赖性的胂瘤细胞生长，以及通过与整联蛋白和CD44受体结合的细胞信号转导。虽然OPN的组成型表达在几种细胞类型中存在，已经在改型过程例如炎症、缺血-重灌注、骨吸收和胂瘤发展中的T淋巴细胞、表皮细胞、骨细胞、巨噬细胞和胂瘤细胞中检测到诱导的表达(由Wai,RY.&KuoP.C.J,Surg.Res.121(2004)228-241综述)。已知OPN与许多整联蛋白受体相互作用。已经报道了在许多人类癌症中检测到提高的OPN表达，已经鉴定了它的同源受体(av-b3、av-b5和av-bl整联蛋白和CD44)。Irby,R.B.,等人，Clin.Exp.Metastasis21(2004)515-523的体外研究表明，内源OPN表达(经由稳定的转染)以及外源OPN(添加到培养基)增强了体外的人类结肠癌细胞的运动性和侵入能力。OPN看起来通过与CD44相互作用调节运动性。OPN表达还降低细胞间(同型的)粘附，其被认为是转移性癌细胞的特征。用OPN稳定转染四种不良致瘤性的人类结肠癌细胞系也引起了体内增加的肿瘤发生，具有提高的增殖和提高的CD31阳性微血管计数，与OPN表达的程度一致。Mor,G.,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA102(2005)7677-7682报道了根据OPN和三种其他被分析物的同时定量的上皮卵巢癌的早期诊断的血液(血清)测试。在优选的实施方式中，本发明涉及通过生物化学标记物体外评估CRC的方法，包括测量样品中骨桥蛋白的浓度并在CRC的评估中使用测定的浓度。癌胚抗原(CEA):CEA(癌胚抗原)是具有大约45-60%可变碳水化物成分的单体糖蛋白(分子量大约180.000道尔顿)(Gold,P.andFreedman,S.O.,J.ExpMed121(1965)439-462)。CEA,如AFP,属于胎儿癌性抗原的组，其在胚胎和胎儿时期期间产生。CEA基因家族由属于两个亚群的约17种活性基因组成。第一组含有CEA和非特异性交叉反应抗原(NCA);第二组含有妊娠特异性糖蛋白(PSG)。CEA主要在胎儿胃肠道和胎儿血清中存在。它还以微小数量在健康成年人的肠、胰腺、和肝组织中存在。CEA的形成在出生之后被抑制，从而在健康成年人中血清CEA值几乎不可测量。高的CEA浓度经常在结肠直肠腺癌的情况下发现。(Fateh-Modhadam,A.等人(eds.),TumormarkerundihrsinnvollerEinsatz,JuergenHartmannVerlagGmbH，Marloffstein-Rathsberg(1993)，ISBN-3-926725-07-9)。轻微到中度的CEA升高(很少>10ng/mL)在20-50%的肠、胰H肝脏和肺部的良性疾病中发生(例如，肝硬化、慢性肝炎、胰腺炎、溃疡性结肠炎、Crohn's病、肺气胂)(Fateh-Moghadam,A.,等人，上文)。吸烟也可以提高CEA值。CEA测定的主要适应症是患有结肠直肠癌的患者的治疗管理和跟踪。CEA测定不被建议用于一般人群的癌症筛选。正常范围内的CEA浓度不能排除恶性疾病的可能存在。在由RocheDiagnostics生产的分析中抗体与CEA(如几乎所有的CEA检测方法一样)并与阿片抗原(NCA2)反应。与NCA1的交叉反应性是0.7%(Hammarstrom,S.，等人，CancerRes.49(1989)4852-4858;和Bormer,O.P.，TumorBiol.12(1991)9-15)。已经根据厂家的说明书使用Roche产品号码11731629在Elecsys分析仪上测量的CEA。如在此使用的，在本节中，以下每一个术语具有与之相关的含义。在此使用的冠词"一个"和"一种"是指冠词的一个或超过一个(即，至少一个)语法上的目标。举例来说，"一标记物"是指一个标i己物或超过一个标记物。在此使用的术语"标记物"或"生物化学标记物，，是指用作目标用于分析患者测试样品的分子。这些分子目标的实例是样品中存在的蛋白或多肽本身以及抗体。用作本发明中的标记物的蛋白或多肽预期包括所述蛋白的任何变体以及所述蛋白或所述变体的片段，特別是免疫学可检测的片段。本领域的技术人员将认识到，例如，在炎症期间由细胞释放或存在于变得损坏的细胞外基质中的蛋白质可以被降解或裂解成这样的片段。某些标记物以无活性的形式合成，其随后可以通过蛋白水解作用活化。熟练技术人员将理解，蛋白或其片段也可以作为复合物的部分存在。这种复合物也可以用作本发明意义上的标记物。标记物多肽的变体由相同的基因编码，但在它们的PI或MW,或两者上(例如，作为选择性mRNA或前mRNA加工的结果，例如选择性剪接或限制的蛋白水解)不同，此外地或可选择地，可以来自不同的翻译后修饰(例如，糖基化、酰化和/或磷酸化)。术语"评估结肠直肠癌"被用于表明，例如，根据本发明的方法将(单独地或与其他方法或参数如UICC(参见上文)阐述的指标一起)帮助医师确定或确认CRC的不存在或存在，或在预后、治疗效力的监碎见(例如，在手术、化疗或放疗之后)以及复发的4全测(治疗后患者的跟踪)方面帮助医师。在此使用的术语"样品"是指为了体外评估的目的获得的生物样品。在本发明的方法中，样品或患者样品优选地可以包含任何体液。优选的测试样品包括血液、血清、血浆、尿液、唾液和滑液。优选的样品是全血、血清、血浆或滑液，血浆或血清是最优选的。熟练技术人员将理解，任何测量和相应的评定是在体外进行的。患者样品后来被丟弃。患者样品单独地用于本发明的体外诊断方法，患者样品的材料不转移回患者体内。一般地，所述样品是液体样品，例如全血、血清或血浆。诊断的理想情况将是一种情况，其中单独的事件或过程将引起相应的疾病，例如在传染性疾病中。在所有其他情况下，正确的诊断结论将是非常困难的，特别是当疾病的病因不被完全理解时，如CRC的情况。熟练的技术人员将理解，没有生物化学标记物，例如在CRC的情况中，是具有100%特异性同时具有100%敏感性的诊断性的。然而生物化学标记物，例如，被用于以某些可能性或预测价值来评估疾病的存在或不存在。因而在常规临床诊断中，一^殳地各种临床症状和生物标志物在原发疾病的诊断、治疗和管理中一起考虑。生物化学标记物可以分别地测定，或在本发明的优选的实施方式中，它们可以使用基于芯片或珠子的阵列技术同时地测定。然后为每个标记物使用单独的截止值(cut-off)独立地打断生物标记物的浓度，或组合它们用于解释。优选的，对CEA和骨桥蛋白测量的值使用数学的或统计学的函数组合。在本发明中公开的包含骨桥蛋白和CEA的标记物组合可以改善CRC的评估。包含骨桥蛋白和CEA的标记物组合在一个或多个以下方面可能是特别有用的筛选；诊断帮助；预后；治疗和跟踪的监视。筛选CRC是发达国家男性和女性的第二常见的恶性肿瘤。由于它的高发病率、它的长无症状阶段和前恶性病变的存在，CRC满足了筛选的许多指标。明显地，与FOB测试或内窥镜检查相比，具有可接受的敏感性和特异性的血清肿瘤标记物将更适合于筛选。如在实施例小节中给出的数据展现了单独的标记物OPN和单独的标记物CEA都不足以容许例如CRC的风险群体的一般性筛选。对于这两种标记物，在筛选所需的特异性水平下，敏感性不够高。然而，本发明中确定的数据表明，标记物OPN和CEA的组合将形成适合于筛选目的的标记物组的整体部分。因而本发明涉及使用OPN和CEA作为CRC标记物组的核心用于CRC筛选目的。当前的数据进一步表明，这两种标记物与一种或多种其他标记物的某些组合将在CRC的筛选中是有益的。词而，本发明还涉及使用包含OPN、CEA和NSE的标记物组，或包含OPN、CEA和NNMT的标记物组，例如，用于筛选CRC的目的。诊断帮助外科手术前的CEA值具有有限的鉴定价值。尽管如此，胂瘤标记物欧洲委员会(ECTM)建议，CEA应当在手术前测量以建立基准值和用于评估预后。根据本发明的标记物组合预计优于单独的标记物CEA。因而预期的和代表本发明的优选的实施方式的是，包含OPN和CEA的标记物组合被用于诊断帮助。一旦在手术之前确定了基准值，标记物组合可以有特别好的诊断帮助。因而本发明还涉及使用标记物组合OPN和CEA用于在CRC手术之前确定基准值。预后在CRC患者中用于确定预后的金标准是Dukes，、TNM或其他分阶段系统所定义的疾病的扩展。如果标记物如CEA将用于预测结局，它必需提供比现有分阶段系统提供的更强壮的预后信息，提供独立于现有系统的信息，或提供由现有制备定义的特定亚群，例如在Dukes'B或淋巴结阴性患者中的预后数据。近来，美国癌症联合委员会(AJCC)共识会议建议，CEA应当被加入用于结肠直肠癌的TNM分阶段系统。CEA水平应当如下指定CX,不能评估CEA;CO,CEA没有提高(<5μg/l);或CEA1，CEA提高(>5μg/l)(Compton，C.,等人，Cancer88(2000)1739-1757)。在优选的实施方式中，标记物组合CEA和OPN被用于预测患有CRC的患者的疾病进程。在进一步优选的实施方式中，如AJCC对于CEA所建议的，OPN和CEA的外科手术前水平与用于CRC和/或TNM分阶段系统的一种或多种其他标记物组合，并用于患有CRC的患者的疾病结局的预测。化疗的监视许多报导已经描述了在监视患有高级CRC的患者的治疗中使用CEA(forreview,seeDuffy,M丄，Clin.Chem.47(2001)625-630;Fletcher,R.H.,Ann.Int.Med.104(1986)66-73;Anonymous,J.Clin.Oncol.14(1996)2843-2877)。大多数这些研究是回顾性的、非随机的，并含有少量的患者。这些研究表明a)与CEA水平未能降低的那些患者相比，具有CEA水平的降低的患者当接受化学治疗时一般具有更好的结局，和(b)对于几乎所有的患者，CEA水平的提高与疾病进展相关。由于在实施例小节中显示的数据，必需预计的是，如果用于化疗的监视，包含OPN和CEA的标记物组合将优于单独的CEA。因而本发明还涉及在化疗的CRC患者的监视中使用包含OPN和CEA的标记物组合。跟踪经历了目的在于治愈的外科切除术的大约50%的患者，以后发展出复发性的或转移性的疾病(Berman,J.M.,等人，Lancet355(2000)395-399)。大多数这些复发发生在诊断的前2-3年内，通常限于肝脏、肺或本地区域。因为复发性/转移性疾病总是致死的，相当多的研究已经集中于它在早期并因而是潜在可治疗阶段时的鉴定。因此，这些患者中的许多经历了手术后的监视计划，其经常包括CEA的常规监视。已经显示了CEA的连续监视以大约80%的敏感性和大约70%的特异性检测复发性/转移性疾病，并提供了5个月的平均提前时间(综述参见Duffy,M丄，等人，上文，和Fletcher,R.H.,上文)。此外，CEA是无症状患者中复发的最常见指标(Pietm,N.,等人，Dis.ColonRectum41(1998)1127-1133;和Graham,R.A.，等人，Ann.Surg.228(1998)59-63)并且比用于潜在可治疗的复发疾病检测的放射学更为经济。关于再发生/转移的位点，CEA对于肝脏转移的检测是最敏感的(几乎100%)。另一方面，CEA对于诊断本地复发是不太可靠的，敏感性仅约60%(Moertel,C.G.,等人，Jama270(1993)943-947)。作为患者方便性、费用和疾病才佥测的效力之中的权衡，EGTM组如ASCO组(Anonymous,J.Clin.Oncol.14(1996)2843-2877)建议了在最初的诊断之后至少3年每2-3个月进行CEA测试。在3年之后，测试可以较不经常地进行，例如，每6个月。然而，不存在证据支持这种测试频率。如本领域技术的以上讨论所显示的，手术后CRC患者的跟踪是利用合适的生物化学标记物或合适的标记物组合的最重要的领域。由于标记物组合OPN和CEA在所研究的CRC患者中的高度敏感性，预计的是，单独的或与一种或多种其他标记物组合的这种标记物组合将在CRC患者的跟踪、特别是手术后的CRC患者中具有4艮大帮助。包含OPN和CEA以及任选的一种或多种其他CRC标记物的标记物组在CRC患者的跟踪方面的使用代表了本发明的进一步优选的实施方式。本发明公开了，以及因而在优选的实施方式中涉及了分别在CRC的i貪断领域或在CRC的评估中标记物OPN和CEA的用途。在又进一步的实施方式中，本发明涉及包含与一种或多种结肠直肠癌标记分子组合的OPN和CEA的标记物组才艮据从个体获得的液体样品在结肠直肠癌的评估中的用途。就此来说，"一种或多种，，的表述表示1到20种、优选的1到10种、优选的1到5种、更优选的3或4种。OPN和CEA和一种或多种其他标记物形成了CRC标记物组。这样，本发明的优选的实施方式是与一种或多种结肠直肠癌标记分子组合的OPN和CEA的标记物组合根据从个体获得的液体样品在结肠直肠癌的评估中的用途。OPN和CEA测量可以与之组合的优先选择的其他CRC标记物是NSE、ASC、丽MT、CA19國9、MASP、CYFRA21-1、FREE和/或CA72-4。再进一步优选的，在CRC的评估中使用的标记物组包含OPN和CEA以及选自NSE和NNMT的至少一种其他的标记分子。以下更详细地分别讨论了与OPN和CEA组合的、或形成包含OPN和CEA的CRC标记物组的部分的优选的一种或多种其他标记物。NSE:NSE(神经元特异性烯醇酶)也称为糖酵解酶烯醇酶(2-磷酸-D-甘油酸水解酶，EC4.2.1.11，分子量大约80kD)以各种二聚同种型存在，包含称为α、β和γ的三种免疫学上不同的亚单位。烯醇酶的α-亚单位在哺乳动物中以很多类型存在，而β-亚单位主要在心脏和横紋肌组织中存在。烯醇酶同种型αγ和γγ,其被称为神经元特异性烯醇酶(NSE)或γ-烯醇酶，主要在神经元和神经内分泌细胞中以及在从它们发源的肿瘤中以高浓度可检测。(LamerzR.，NSE(Neuronen-spezifischeEnolase),y-Enolase,In:ClinicalLaboratoryDiagnosis,Thomas,L.(ed.)，TH曙Books,Frankfurt,1stEnglishedition(1998),pp.979-981,5.deutscheAuflage(1998)pp.1000-1003)。NSE净皮描述为监视小细胞支气管肺癌(Lamerz,R.,NSE(Neuronen-spezifischeEnolase),y-Enolase，上文)的首选标记物,而对于非小细胞支气管肺癌CYFRA21-1优于NSE(Ebert,W.,等人，Eur.J.Clin.Chem.Clin,Biochem.32(1994)189-199).60-81%的小细胞支气管肺癌情况中发现提高的NSE浓度。对于NSE,对于转移的部位或对于脑部转移没有相关性，蛋儿对于临床阶段，即疾病的程度有很好的相关性。响应于化疗，作为肿瘤细胞的细胞溶解的结果，在第一次治疗周期后24-72小时NSE水平上有短暂提高。在一周之内或到第一次治疗周期结束时这跟随这血清值的快速降低(其在治疗之前是提高的)。相反，对于治疗的非应答者显示了恒定地提高的或未能降低到参考范围的水平。在症状緩解期间，80-96%的患者具有正常值。提高的NSE值在复发的情况下发现。在某些情况下升高以l-4个月的潜伏期发生，通常是指数性的(10-94天的倍增时间)并与存活时期相关。NSE在小细胞支气管肺癌疾病的治疗和过程的监视期间作为单一的预后因子和活性标记物是有用的诊断敏感性93%、阳性预测价值92%(Lamerz,R.,NSE(Neuronen-spezifischeEnolase),y-Enolase,上文)。在成神经细胞瘤中，30ng/ml以上的NSE血清值在62%的患病儿童中发现。中值根据疾病的阶段提高。在病理性NSE值的数量或频率以及疾病的阶l爻之间存在显著的相关性；与无疾病存活存在着负相关性。患有精原细胞瘤的68-73%的患者具有临床上显著的NSE提高((Lamerz,R.,NSE(Neuronen-spezifischeEnolase),y-Enolase，上文)。存在着与疾病的临床进程之间的可利用的相关性。NSE还在其他肺瘤中测量到非肺部恶性疾病在22%的病例中显示了超过25ng/ml的值(所有阶段的癌症中)。脑肺瘤例如胶质瘤、脑膜瘤、纤维神经瘤和神经鞘瘤仅仅是偶尔地伴随有提高的血清NSE值。在原发脑肺瘤或脑转移中和在恶性黑色素瘤和嗜铬细胞瘤中，提高的NSE值可能在CSF(脑脊液)中发生。对于14%的器官限制的和46%的转移性肾脏癌症中报告了提高的NSE浓度，具有作为独立的预后因子级别的相关性。在良性疾病中，提高的血清NSE浓度(〉12ng/ml)已经在患有良性肺部疾病和脑部疾病的患者中发现。主要在体液中提高的值以及在脑血管脑膜炎、散布脑炎、脊髓小脑退化、大脑局部缺血、脑梗死、脑内血肿、蛛网膜下出血、头部损伤、炎症性的脑疾病、器质性癫痫、精神分裂症和Jakob-Creutzfeld病中发现(Lamerz,R.,NSE(Neuronen-spezifischeEnolase),"Enolase,上文)。可以根据厂家的说明书使用Roche产品号码12133113在Elecsys⑧分析仪上测量的NSE。NNMT:蛋白质烟酰胺N-曱基转移酶(NNMT;Swiss-PROT:P40261)具有29.6kDa的表观分子量和5.56的等电点。NNMT催化烟酰胺和其他吡啶的N-甲基化。这种活性对于许多药物和生物体内异物化合物的生物转化是重要的。该蛋白质已经被报道主要在肝脏中表达并位于细胞质中。NNMT已经从来自人类肝脏的cDNA中克隆，并含有编码具有29.6kDa计算的分子量的264氨基酸蛋白质的792核苷酸开放阅读框(Aksoy,S.，等人，J.Biol.Chem.269(1994)14835-14840)。关于这个酶在人类癌症中的潜在作用在文献中知道的;[艮少。在一篇论文中，提高的肝脏NNMT酶活性被报道作为小鼠中癌症恶病体质的标记物(Okamum，A.,等人，Jpn.J.CancerRes.89(1998)649-656)。在新近的报告中，展现了NNMT基因在放射敏感性细胞系中相应于放射的减量调节(Kassem,H.，等人，Int.J.Cancer101(2002)454-460)。近来发现(WO2004/057336)的是，NNMT在CRC的评估中是感兴趣的。在WO2004/057336中描述的免疫分析已经被用于测量当前研究的样品(CRC，健康对照和非恶性结肠疾病)。CA19-9:测量的CA19-9(碳水化合物抗原19-9)值通过使用单克隆抗体1116-NS-19-9来定义。血清中的1116-NS-19-9反应性决定簇主要在含有高数量的CA19-9表位的粘蛋白样蛋白质上表达(Magnani,J丄.，Arch.Biochem.Biophys.426(2004)122-131)。3-7%的群体具有Lewisa-阴性/b-阴性血型结构，并且不能表达具有反应性决定簇CA19-9的粘蛋白。当解释发现时必需考虑这一点。含有CA19-9的粘蛋白在胎儿胃、肠和胰腺上皮细胞中表达。在成年人组织中在肝脏、肺和胰腺中也可以发现低的浓度(Fateh誦Moghadam,A,,等人,上文；Herlyn,M.，等人.,J.Clin.Immunol.2(1982)135-140)。CA19-9分析值可以帮助患有胰腺癌的患者的区分诊断和监视(敏感性70-78%)(Ritts，R.E.，Jr.,等人，Int.J.Cancer33(1984)339-345)。在肿瘤质量和CA19-9分析值之间没有相关性。然而，具有高于10,000U/mL的CA19-9血清水平的患者几乎总是具有远端转移。CA19-9的测定不能用于胰腺癌的早期检测(Steinberg,W.M.,等人，Gastroenterology90(1986)343-349)。在肝胆癌中，CA19-9值提供了50-75%的敏感性。在胃癌的情况中建议了CA72-3和CEA的伴随性测定。在结肠直肠癌中，单独的CEA测定是足够的；仅在有限数量的CEA阴性病例中，CA19-9可能是有用的。由于粘蛋白由肝脏专门地分泌，在某些情况下甚至轻微的胆汁郁积可以引起明显提高的CA19-9血清水平。还在胃肠道和肝脏的许多良性和炎症性疾病中以及在嚢性纤维化中发现提高的CA19-9值。已经根据厂家的说明书使用Roche产品号码11776193在Elecsys⑧分析仪上测量的CA19-9。ASC:"含有半胱氨酸蛋白酶相关的募集结构域的细胞凋亡相关斑点样蛋白质"(ASC)也被称为"甲基化诱导的沉默的目标1"(TMS1)(Swiss-PROT:Q9ULZ3)。ASC具有21,627Da的理论分子量和pH6.29的理论等电点。半胱氨酸蛋白酶相关募集结构域(CARDS)介导接头蛋白质例如APAF1(细i包凋亡蛋白酶活化因子1)和参与细胞凋亡的半胱氨酸蛋白酶的前体形式(例如，CASP9)之间的相互作用。ASC是含CARD接头蛋白质家族的成员。通过免疫筛选早幼粒细胞系，Masumoto等人分离了编码ASC的cDNA。推断的195氨基酸蛋白质含有N-末端pyrin样结构域(PYD)和87残基C-末端CARD。Western印迹分析显示了22kDa蛋白质的表达，并且表明了ASC可能通过提高白血病细胞系对抗癌药的细胞凋亡刺激的易感性来具有促细胞凋亡活性(Masumoto,J.,等人，J.Biol.Chem.274(1999)33835-33838)。Conway等人的甲基化敏感限制PCR和曱基化特异性PCR(MSP)分析表明，ASC的沉默与围绕外显子1的CpG岛的超甲基化相关，DNMT1(DNA胞嘧啶-5-曱基转移酶-l)的过量表达促进了超甲基化和ASC的沉默。乳腺癌细胞系，而不是正常的乳腺组织，展现了ASC的完全甲基化，并且不表达ASC信息。在乳腺癌细胞系中ASC的表达抑制生长并降低幸存克隆的数量。Conway等人断定，ASC功能在于促进半胱氨酸蛋白酶依赖性细胞凋亡，以及ASC的过量表达抑制乳腺癌细胞的生长(Conway,K.E.,等人，CancerResearch60(2000)6236-6242)。McConnell和Vertino显示了，ASC的可诱导表达抑制了细胞增殖，并诱导了可以被半胱氨酸蛋白酶抑制物阻断的DNA段裂。免疫荧光显微术表现了，细胞凋亡的诱导引起了从弥散的细胞质表达向球形核周聚集物的CARD依赖性转移(McConnell,B.B.,andVertino，P.M.,CancerResearch60(2000)6243-6247)。Moriani等人观察到ASC基因的曱基化不仅在乳腺癌细胞中，而且在胃癌中。他们提出在涉及促细胞凋亡ASC基因的减量调节的乳腺癌和胃癌的进展中ASC基因的异常曱基化的指导作用(Moriani，R.,等人，AnticancerResearch22(2002)4163-4168)。Conway等人检查了原始乳腺组织的TMS1甲基化，并将结果与健康组织中的曱基化相比较(ConwayK.E.,等人，CancerResearch60(2000)6236-6242)。Levine等人发现，ASC沉默不与特定CpG位点的曱基化相关，而是与ASCCpG岛的密集甲基化相关联。含有专门地甲基化的ASC拷贝的乳腺肿瘤细胞系不表达ASC,而在部分曱基化的细胞系中，ASC表达的水平与细胞群体中存在的曱基化的ASC等位基因的百分比直接相关(Levine,JJ，等人，Oncogene22(2003)3475-3488)。Virmani等人检查了肺癌和乳腺癌组织中的ASC的甲基化状态。他们发现，ASC的异常曱基化在46%的乳腺癌细胞系和32%的乳腺胂瘤组织中存在。曱基化在非恶性乳腺组织中是稀有的(7%)(Virmani,A.,等人，IntJ.Cancer106(2003)198-204)。Shiohara等人发现，ASC的增量调节与人类嗜中性细胞中的炎症和细胞凋亡紧密相关(Shiohara,M.，等人，Blood98(2001)229a)。Masumoto等人观察到，高水平的ASC在上皮细胞和白细胞中丰富地表达(Masumoto，J.,等人，JournalHistochem.Cytochem.49(2001)1269-1275)。已经为ASC的测量开发了自有的夹心免疫分析。这种分析以微量滴定板形式进行。使用链霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板。针对ASC的生物素化的多克隆抗体用作捕获抗体，针对ASC的地高辛化的多克隆抗体被用作这个夹心分析中的第二特异性结合配偶体。形成的夹心复合物最终通过抗毛地黄毒苷辣根过氧化酶辄合物和合适的过氧物酶底物来显现。MASP:蛋白质MASP(maspin前体；Swiss-PROT:P36952)是42kDa蛋白质，其与蛋白酶抑制物的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpin)超家族具有同源性。免疫染色研究展现了，maspin在细胞外基质中和在质膜上存在(Zou,Z.,等人，Science263(1994)526-529)。人类MASP基因(PI5的SERPINB5)最初通过减法杂交在它的mRNA水平表达的基础上分离自正常乳腺的上皮细胞(Zou等人，上文)。Maspin在正常的乳腺上皮细胞中表达，但在大多数乳腺癌细胞系中不表达。Zou等人(上文)显示了它的表达降低了转化的细胞诱导肺瘤形成和转移的能力，表明maspin基因编码胂瘤抑制物。Bass,R.等人(J.Biol.Chem.277(2002)46845-46848)表征了真核的maspin并发现它对于所测试的任何蛋白水解系统没有蛋白酶抑制效果。然而，它确实抑制肺瘤和血管平滑肌细胞的迁移。Song,S.Y.等人(DigestiveDiseasesandSciences47(2002)1831-1835)通过来自腺瘤、腺癌和转移性腺癌的组织切片的免疫组织化学染色研究了maspin在结肠癌中的表达。Song等人(上文)发现的maspin的免疫反应性是细胞质的，具有某些核染色。超过90%的腺瘤、75%的腺癌和47%的转移癌组织切片对于maspin是染色阳性。这项研究具有的局限性是没有使用定量分析系统，例如Western印迹分析。没有评估与邻近的正常结肠组织相比的表达水平。FERR:铁蛋白(FERR)是含有约20%的铁的蛋白质，在肠、肝脏和脾中发现。它是铁在体内保存的主要形式之一。身体铁保存已经被报道提高结肠直肠赘生物的风险。在Scholefield,J.H.等人(Dis.ColonRectum41(1998)1029-1032)使用来自148位患者(50位患者具有证明的结肠直肠癌，49位患者没有结肠疾病，患者具有结肠的腺瘤)的研究中，分析的血清铁蛋白。在三个组的任何之中在血清铁蛋白水平方面没有显著差异。CYFRA21-1:"CYFRA21-1"的分析特异性地测量在循环中存在的cytokeratin19的可溶性片段。CYFRA21-1的测量一般基于两种单克隆抗体(Bodenmueller,H.,等人，Int.J.Biol.Markers9(1994)75-81)。在来自RocheDiagnostics,Germany的CYFRA21-1分析中，使用了两种特异性单克隆抗体(KS19.1和BM19.21),测量具有约30,000道尔顿分子量的cytokeratin19的可溶性片段。Cytokeratins是形成上皮中间细丝的亚单位的结构蛋白质。迄今为止鉴定了二十种不同的cytokeratin多肽。由于它们的特定分布才莫式，它们特别适用于作为肺瘤病理中的区分标记物。完整的cytokeratin多肽是难溶的，但是可以在血清中检出可溶的片段(Bodenmueller,H.,等人，上文)。CYFRA21-1是非小细胞肺癌(NSCLC)的公认的标记物。CYFRA21-1的主要适应症是监碎见非小细胞肺癌(NSCLC)的进程(Sturgeon,C.,ClinicalChemistry48(2002)1151-1159)。在初步诊断中，在患有非小细胞肺癌的患者中，高CYFRA21-1血清水平表明高级的肿瘤阶段和不良预后(vanderGaast,A..,等人，Br.J.Cancer69(1994)525-528),等人正常的或仅仅轻微提高的值不能排除肺瘤的存在。CYFRA21-1血清水平向正常范围的快速下降记录了成功的治疗。稳定的CYFRA21-1值或在CYFRA21-1值方面轻微的或仅緩慢的降低表明肿瘤的不完全消除，或具有相应的治疗和预后结论的多个肿瘤的存在。疾病的进展通常由提高的CYFRA21-1值相比临床症状和成傳4喿作更早地显示。公认的是，肺癌的初步诊断结论应当在临床症状、成像或内窥镜操作和手术中发现的基础上进行。肺部内不清晰的圓形病灶与CYFRA21-1值〉30ng/mL—起表明存在原发支气管肺癌的高可能性。CYFRA21-1也适合于膀胱的肌浸性癌症的进程监视。对于良性的肺部疾病(肺炎、结节病、肺结核、慢性支气管炎、支气管哮喘、肺气肿)CYFRA21-1显示了良好的特异性。轻微提高的值(直至10ng/mL)很少在显著的良性肝脏疾病和肾衰竭中发现。与性别、年龄或吸烟没有相关性。CYFRA21-1的值还不受妊娠的影响。近来，已经发现CYFRA还在乳腺癌领域中检测疾病复发和评估治疗效力方面有用。(Nakata,B.,等人，BritishJ.ofCancer(2004)1-6)。优选的，已经根据厂家的说明书使用Roche产品号码11820966在Elecsys⑧分析仪上测量的CYFRA21-1。本领域技术人员将理解，存在着许多方法来使用两种或多种标记物的测量值以改善在研究中的诊断问题。在十分简单的、但尽管如此常常有效的方法中，如果样品对于研究的至少一种标记物是阳性的，假定阳性结果。例如，当诊断传染性疾病如AIDS时，这是一种情况。然而，经常地，评估标记物的组合。优选的，对标记物组的标记物测量的单独的值被组合，组合值与基础的诊断问题相关联。在本发明中，标记物OPN和CEA的组合净皮用于CRC的评估。可以通过任何适合的本领域的数学方法组合标记物值。将标记物组合与疾病相关联的公知的数学方法采用了一些方法，如，辨别分析(DA)(即，线性的、二次的、调整的DA)、Kernel方法(即，SVM)、非参数方法(即，k-最近邻分类者)、PLS(部分最小二乘方)、基于树的方法(即，逻辑回归，CART,随才几森林法，Boosting/Bagging方法)、一般化的线性模型(即，逻辑回归)、基于主分量的方法(即，SIMCA)、一般化的加法模型、基于模糊逻辑的方法、神经网络和基于遗传算法合方面将没有困难。优选的，在将本发明的标记物组合与例如CRC的不存在或存在相关联中使用的方法选自DA(即，线性的、二次的、调整的DA)、Kernel方法(即，SVM)、非参数方法(即，k-最近邻分类者)、PLS(部分最小二乘方)、基于树的方法(即，逻辑回归，CART，随机森林法，Boosting/Bagging方法)或一般化的线性模型(即，逻辑回归)。关于这些统计方法的细节在以下参考文献中找到Ruczinski，I.,etal,J.ofComputationalandGraphicalStatistics,12(2003)475-511;Friedman,J.H.，J.oftheAmericanStatisticalAssociation84(1989)165-175;Hastie,T.,等人，TheElementsofStatisticalLearning,SpringerSeriesinStatistics(2001);Breiman,L.,等人,Classificationandregressiontrees,California,Wadsworth(1984);Breiman，L.,RandomForests,MachineLearning45(2001)5-32;Pepe,M.S.，TheStatisticalEvaluationofMedicalTestsforClassificationandPrediction,OxfordStatisticalScienceSeries,28(2003);和Duda,R.O.,等人,PatternClassification,WileyInterscience,2ndedition(2001)。本发明的优选的实施方式是使用关于生物标志物的基础组合的优化的多元筛截，和辨别状态A与状态B,例如患病与健康。在这种类型的分析中，标记物不再是独立的，而是形成标记物组。可以确立的是，OPN的测量与CEA的测量显著地改善了与任一单独标记物相比的CRC的诊断精确性。显著地，在约90%的稳定和预设的特异性下，标记物组合OPN和CEA用于诊断CRC的敏感性已经被发现与每个单独的标记物相比显著地提南。通过诊断方法的接受者操作特征(ROC)最好地描述了诊断方法的精确性(特别参见Zweig,M.H.,andCampbell,G.,Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC图表是在所观察数据的整个范围上连续改变判定阈值产生的所有的敏感性/特异性配对的标绘图。实验室测试的临床性能取决于它的诊断精确性，或正确地将受试者分类到临床上相关的亚群中的能力。诊断精确性衡量了所述测试正确地区分被研究受试者的两种不同状况的能力。这些状况例如健康和患病，或者良性和恶性疾病。在每种情况下，通过在判定阈值的完整范围上标绘出敏感性对比l-特异性，ROC标绘图描绘了两种分布之间的重叠。在Y轴上是敏感性，或者真阳性部分[定义为(真阳性测试结果的数量)/(真阳性的数量+假阴性测试结果的数量)]这也被称作存在疾病或状况的确实性。它单独地从受影响的亚群中计算。在X轴上是假阳性部分，或1-特异性[定义为(假阳性结果的数量)/(真阴性的数量+假阳性结果的数量)]。它是特异性的指数，完全从未受影响的亚群中计算。因为使用来自两个不同亚群的测试结果完全独立地计算真阳性和假阳性部分，ROC标绘独立于样品中的疾病发病率。在ROC标绘图上的每个点代表了相应于特定的判断阈值的敏感性/l-特异性配对。具有理想辨别力(在结果的两个分布中没有重叠)的测试具有穿过左上角的ROC标绘线，其中真阳性部分是l.O，或100%(理想的敏感性)、假阳性部分是0(理想的特异性)。没有辨别力的测试的理论标绘图(两个组的结果相同的分布)是从左下角到右上角的45°对角线。大多数标绘图落入这两个极端之间。(如果ROC标绘图完整落在45°对角线之下，通过将"阳性"的指标从"大于"转变成"低于"来容易地补救，反之亦然。)定性地，标绘图约靠近左上角，试验的总体精确度越高。测定实验室测试的诊断精确性的一个方便的目标是通过单个数字表示它的性能。例如，这种总体参数是所谓的“总误差”，或作为选择"曲线下面积=AUC"。最常见的全局度量是ROC标绘图下的面积。按照惯例，这个面积永远＞0.5(如果不是，人们可以反转判断规则使它这样)。值在1.0(两个组的测试值的理想分离)和0.5(在测试值的两个组之间没有明显的分布差异)之间。该面积不仅取决于标绘图的特定部分，例如靠近对角线的点或在90%特异性下的敏感性，还取决于整个标绘图。这是ROC标绘图多么接近理想标绘图(面积=1.0)的定量的、描述性的表述。两种标记物OPN和CEA的组合显著地改善了CRC的诊断准确性，如提高的曲线下面积所展现的。OPN和CEA与近来发现的CRC标记物如ASC或NNMT、或与已知的肺瘤标记物如CYFRA21-1和NSE、或与其他尚待发现的CRC标记物的组合测量，分别地引起或将引起CRC评估中的进一步改进。在优选的实施方式中，本发明涉及改善相对于健康对照和患有非恶性结肠疾病的患者的CRC诊断精确度的方法，通过分别测量样品中至少OPN和CEA的浓度，并且将所测定的值算术地组合并将所测定的浓度与CRC的存在或不存在相关联，与基于任一单独的标记物的分类法相比，所述改善使得更多的患者被正确地分类为患有CRC或者健康对照和患有非恶性结肠疾病的患者。在根据本发明的进一步优选的方法中，分别测定至少生物标记物OPN、CEA和NSE的浓度，标记物组合用于CRC的评估。在根据本发明的进一步优选的方法中，分别测定至少生物标记物OPN、CEA和NNMT的浓度，标记物组合用于CRC的评估。提供以下的实施例和附图来帮助理解本发明，它们的真实范围在附随的权利要求中阐述。要理解的是，可以在所列的步骤中进行修改而不背离本发明的精神。实施例1:研究群体研究群体在表1中给出。表l:研究群体CRC样品和相应的UICC分类<table><row><column>根据UICC的阶段</column><column>样品数</column></row><row><column>UICC0</column><column>8</column></row><row><column>UICCI</column><column>41</column></row><row><column>UICCII</column><column>53</column></row><row><column>UICCIII</column><column>67</column></row><row><column>UICCI-III(未分类的，非IV阶段)</column><column>13</column></row><row><column>UICCIV</column><column>61</column></row><row><column>没有分阶段</column><column>11</column></row><row><column>CRC样品的总数</column><column>254</column></row><table>研究群体包括来自用CRC诊断的254位患者(参见表l)的血清样品和391份对照样本。这两个组都被分为训练集和测试集。分析基于128份CRC样品和195份对照样本的训练集。对于对照，16份来自没有任何胃肠疾病的个体，50份来自患有痔的个体，5份来自患有其他肠疾病的患者；63份对照来自患有肠憩室的个体，61份来自健康献血者。测试集由126份CRC样品和196份对照组成。对于对照，20份来自没有任何胃肠疾病的个体，43份来自患有誇的个体，8份来自患有其他肠疾病的患者；65份对照来自患有肠憩室的个体，60份来自健康献血者。实施例2:使用的分析过程使用商业上可获得的试剂盒(分别为RocheDiagnostics产品号码11731629、11820966和12133113)分析标记物CEA、CYFRA21國1和NSE。在WO2004/057336中描述的免疫分析已经用于测量当前研究的样品中的NNMT。简言之，多余人类血清或血浆中的NNMT检测，开发了夹心ELISA。为了抗原的检测和捕获，等分量的抗NNMT多克隆抗体与生物素和毛地黄毒苦分别结合。在10mM磷酸盐、pH7.4、1%BSA、0.9%NaCl和0.1%吐温20中，链霉抗生物素蛋白包被的96孔微量滴定板与100iul生物素化的10jug/ml抗NNMT多克隆抗体孵育60分钟。在孵育之后，用0.9%NaCl、0.1%吐温20洗涤平板三次。然后用重组蛋白质的连续稀释物作为标准抗原或用来自患者的稀释的血浆样品孵育反应孔2h。在NNMT的结合之后，用0.9%NaCl、0.1%吐温20洗涤平板三次。对于结合的NNMT的特异性检测，用100jul地高辛化的抗NNMT多克隆抗体以10jug/ml在10mM磷酸盐、pH7.4、1%BSA、0.9%NaCl和0.1%吐温20中孵育60分钟。此后，洗涤平板三次来除去未结合的抗体。在接下来的步骤中，反应孔在10mM石岸酸盐、pH7.4、1%BSA、0.9%NaCl和0.1%吐温20中与20mU/ml抗毛地黄毒苦POD扼合物(RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,Germany,目录号1633716)孵育60分钟。随后用相同的緩冲液洗涤平板三次。对于抗原抗体复合物的检测，反应孔与100ju1ABT溶液(RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,Germany,目录号11685767)孵育，在30-60分钟后用ELISA读取器在405nm测量OD。在自有的夹心ELISA中测量OPN。对于抗原的捕获和检测，使用两种不同的抗体。选择这些抗体以具有非重叠的表位。使用的两个抗体的表位在骨桥蛋白序列的氨基酸167和羧基末端之间(KieferM.C.,等人，Nucl.AcidsRes.17(1989)3306)。一种抗体被生物素化，用作捕获抗体。第二抗体被地高辛化。然后通过使用合适的抗DIG二级抗体检测地高辛化的抗体。分析过程基本上如同以上对于NNMT的检测而不是对于OPN特异性抗体所描述的。实施例3:产生的数据的数学评估分类算法用调整的辨别分析(RDA)产生，其是常见的辨别分析的全面化,即，二次-和线性辨别分才斤(McLachlan,G.J.,DiscriminantAnalysisandStatisticalPatternRecognition,WileySeriesinprobabilityandmathematicalstatistics,1992)。在RDA中，-使用了对于协方差矩阵的普通的最大似然率(插入)估计的替代。这些替代的特征在于两个参数(人，Y),它们的值通过共同地最小化将来的错分类风险的基于样品的估计来定制到单独的位置(Friedman,J.H.,RegularizedDiscriminantAnalysis,J.oftheAmericanStatisticalAssociation84(1989)165-175)。作为替代性方法，支撑矢量机算法(Hastie,T.,等人，TheElementsofStatisticalLearning,SpringerSeriesinStatistics,2001)可以提供可比较的分类结果。从对于分类问题最好的单一标记物开始逐步地构建标记物组，当在约90%的特异性水平下敏感性的提高不再显著地改变时结束。为了获得集中的分布，用天然的对数函数转化每个单独的标记物。使用5倍交叉验证。表2呈现了诊断患有CRC的患者对比包括非恶性结肠疾病的对照的分类结果。表2:患有CRC的患者对比健康对照和疾病对照的分类结果<table>complextableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>如通过RDA测定的，在以上研究群体中OPN的敏感性是大约34%,而对于CEA发现了约38%的敏感性。具有单独的OPN和CEA的标记物组发现展现了敏感性到约46%的显著提高。从表2可以看出，用训练集确定的数据在样品的测试集中基本上被确认了。权利要求1.一种体外评估结肠直肠癌的方法，其中所述方法包括步骤a)测量样品中骨桥蛋白的浓度，b)测量样品中癌胚抗原的浓度，和c)任选的一种或多种其他结肠直肠癌标记物的浓度，以及d)组合在步骤(a)、(b)中测定的浓度和任选的在步骤(c)中测定的浓度，用于评估结肠直肠癌。2.根据权利要求1的方法，其中所述一种或多种其他标记物选自NSE、ASC、丽MT、CA19画9、CA72誦4、MASP、CYFRA21-1和FERR。3.根据权利要求2的方法，其中所述一种或多种其他标记物是NSE。4.根据权利要求2的方法，其中所述一种或多种其他标记物是丽MT。5.标记物组合骨桥蛋白和癌胚抗原在结肠直肠癌的评估中的用途。6.包含骨桥蛋白和癌胚抗原以及一种或多种其他结肠直肠癌标记物的标记物組在结肠直肠癌的评估中的用途。7.根据权利要求6的标记物组的用途，其中所述一种或多种其他标记物选自NSE、ASC、NNMT、CA19-9、CA72-4、MASP、CYFRA21-1和FERR。8.根据权利要求7的至少包含骨桥蛋白、癌胚抗原和NSE的标记物组的用途。9.根据权利要求7的至少包含骨桥蛋白、癌胚抗原和NNMT的标记物组的用途。10.—种用于进行根据权利要求1的方法的试剂盒，其包含特异性地测量骨桥蛋白和癌胚抗原所需的试剂。全文摘要本发明涉及帮助评估结肠直肠癌(＝CRC)的方法。公开了包含骨桥蛋白和癌胚抗原的标记物组合在结肠直肠癌的评估中的用途。此外，它特别涉及通过测量样品中至少标记物骨桥蛋白和癌胚抗原来从来自个体的液体样品评估结肠直肠癌的方法。包含骨桥蛋白和癌胚抗原的标记物组合可以，例如，用于结肠直肠癌的早期检测或用于监督经历了治疗例如手术的患者。文档编号G01N33/574GK101346628SQ200680048492公开日2009年1月14日申请日期2006年12月19日优先权日2005年12月22日发明者J·P·特坎,J·卡尔,M·塔克,N·威尔德,P·斯特格米勒,V·格鲁纳特申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司