专利名称：抗骨桥蛋白单克隆抗体对骨质疏松的保护作用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种抗骨桥蛋白单克隆抗体的用途。
背景技术：
骨质破坏(bone destruction)指局部骨质为病理组织所取代而造成的骨组织缺失。它是由病理组织本身直接使骨组织溶解吸收，或者由病理组织引起的破骨细胞 (osteoclast, 0C)生成及活动亢进所致。骨皮质和骨松质均可以发生破坏。多种代谢性骨病都以骨质破坏、吸收为主要病理特征，如炎性骨吸收、骨质疏松症、骨质硬化症和Paget 骨病。在类风湿性关节炎等自身免疫性疾病晚期也表现为骨关节破坏，功能丧失，给病人带来巨大的痛苦，严重影响了病人的生活质量。目前，治疗骨质破坏、吸收疾病所用的治疗剂通常分两组；一组是能够促进骨质重建的活性治疗剂，包括合成代谢的类固醇、氟化物、维生素D和甲状旁腺激素等等；而另一组能够防止骨吸收的常规药剂，包括雌激素、降钙素、二膦酸盐和异丙氧黄酮等等。随着骨生成机理的引入，维生素D衍生物在调节骨质平衡方面的作用也逐渐被人们发现，它已经成为公众关注的对象。骨化三醇，一种以1，25-(0H)2-D3表示的活性维生素D3之一，是一种骨质重建激活剂，并且还是一种能够预防骨质疏松症的激素，它不仅能够增加钙从肠道中的吸收，而且还能够抑制骨质量的下降，但是，骨化三醇通过骨代谢易导致血钙浓度的增加以及非正常的钙浓度调节，易引发血钙过多，而血钙过多的患者经常出现并发症，这增加了治疗疾病例如骨质疏松症的困难。日本专利(专利公开号JP7330613(A)，
公开日
1995-12-19)公开了一种骨质重建激活剂，它含有阿仑特罗(一种二膦酸盐)作为一种活性剂，在二羟基维生素D3的存在下，它可以激活成骨细胞的钙化以及骨基质的形成。但是，上述骨吸收抑制剂还没有成功地足以提高已经患有骨质疏松症患者的骨质量。因此，有关骨质破坏、吸收疾病的治疗还需探讨其它更为有效的方法。骨桥蛋白(Osteopontin，0ΡΝ)，又称为早期T淋巴细胞活化因子I ta_l)或分泌型磷蛋白I，含有Arg-Gly-Asp(RGD，精氨酸一甘氨酸一天门冬氨酸)三肽序列，分子量根据去磷酸化及糖基化形式的不同大约为44-66KD之间，是一种重要的多功能细胞夕卜基质蛋白(Eta_l (osteopontin) :an early component of type-1 (cell-mediated) immunity. Science. 2000. 287 :860-864)。OPN在骨组织细胞、巨噬细胞、活化的T细胞及上皮细胞等多种细胞上表达，在介导细胞的趋化、粘附、增殖和迁移，肿瘤转移，骨组织的矿化与重建，免疫调节，信号转导，以及对感染性疾病的免疫能力等方面有着重要的作用(Osteoprotegerin Ligand Is aCytokine that Regulates Osteoclast Differentiation and Activation. Cell，1998. 93 :65-176. Osteopontin :role in cell signaling and cancer progression. TRENDS in CellBiology 2006. 16:79-87·)。OPN 主要是通过RGD及非RGD两个途径与细胞表面的受体相结合而实现其功能(Inhibition of Arg-Gly-Asp(RGD)-mediated Cell Adhesion to osteopontinby a Monoclonal Antibodyagainst osteopontin. J. Bio. Chem. 1994. 269 :23280-23285)，RGD 途径主要是与细胞表面的整合素受体(αΥβ3、αΥβ1、αΥβ5)结合，而非RGD途径主要是与某些⑶44的变异体(V6、V7)结合，从而介导细胞的多种生理功能(IntracellularOsteopontin Is an Integral Component of the CD44-ERM Complex Involved in CeIlMigration. JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY. 2000 :184 :118-130)。总的说来，细胞所分泌的OPN经过磷酸化、糖基化，然后再经过凝血酶的剪切等一系列表达后修饰作用，以多种形式存在于机体中，每种形式可能有其独特的功能，但目前的研究还不能充分说明，有待进一步的研究与探讨。目前已证实OC的增殖活化在关节炎病灶骨侵蚀的发病机制中起着决定性的作用，各个环节使OC过度增殖或异常活跃，打破了骨代谢的平衡，骨破坏占据优势。骨吸收的关键事件是OC连接到骨表面的矿化基质上，实验证明OPN在OC抛锚的骨表面高度表达，而且OPN特异性受体-整合素也被证明优先表达于OC胞膜的相应区域。这可以证明在骨吸收的过程中，OPN通过连接整合素以及矿化的骨基质实现OC抛锚于骨吸收部位的骨矿化基质° Tani—Ishii 等(Osteopontin antisense deoxyoligonucIeotides inhibit bone resorption by mouseosteoclasts in vitro. J Periodontal Res,1997. 32(6) 480-6.)，在研究OPN对体外共培养体系中OC的分化和骨吸收的影响实验中发现OPN反义寡核苷酸能够减少抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性细胞的数量，同时牙本质切片上的骨吸收面积减少了。研究发现，在钙化组织中，OPN能够诱导破骨细胞的聚集，促进矿化组织的吸收。将大鼠钙化的骨盘植入其肌组织中，野生鼠的骨质吸收速度要比OPN基因敲除的大鼠快的多，而且OPN缺失的大鼠其骨盘机化的程度和破骨细胞粘附的数量也明显 M 少(Osteopontin :an interfacial extracellularmatrix protein in mineralized tissues. Connect Tissue Res. 1996 ；35 (1-4) :197-205)。但有学者的研究却表明，OPN 对正常生理性的骨发生中破骨细胞的生成是没有影响的，而仅仅在在病理条件下，OPN对破骨细胞生成具有有重要的促进作用。比如卵巢切除术后的小鼠(绝经后骨质疏松症模型)， 破骨细胞数量明显增加，然而OPN敲除小鼠的卵巢切除后，破骨细胞数量无明显增加，骨质疏松也明显改善(Osteopontin-deficient mice are resistant toovariectomy-induced bone resorption, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (I999)幻恥-幻⑶)。同样的，在机械压力所致的骨质吸收模型中，OPN缺陷小鼠也没观察到明显的骨质吸收及破骨细胞的数量改变 (Enhancement of osteoclastic bone resorption andsuppression of osteoblastic bone formation in response to reduced mechanical stressdo not occur in the absence of osteopontin, J. Exp. Med. 193 (2001) 399-404)。这些研究结果均表明，OPN 与破骨细胞的分化或者生物学功能是密切相关的。目前，已经有一些相关的抗骨桥蛋白单克隆抗体在研究阶段，本发明的发明人利用本发明的单克隆抗体和已经公开的相关单克隆抗体进行对比实验，令人惊奇地发现，和已经公开的相关单克隆抗体相比，本发明的单克隆抗体具有极好的在骨质破坏和吸收中的保护作用，从而完成了本发明。
发明内容
本发明公开了抗骨桥蛋白的单克隆抗体23C3在制备治疗和/或预防骨质吸收、破坏疾病的药物中的应用。优选地，所述骨质吸收、破坏疾病选自以骨质破坏、吸收为主要病理特征的多种代谢性骨病，如炎性骨吸收、骨质疏松症、骨质硬化症和Paget骨病等。更优选地，所述骨质吸收、破坏疾病选自骨质疏松。本发明还涉及23C3联合其它活性物质在制备治疗和/或预防骨质吸收、破坏疾病的药物中的应用。所述活性物质可选自以下一种或多种物质促进骨质重建的活性治疗剂， 类固醇，氟化物，维生素D，维生素D衍生物，甲状旁腺激素，骨化三醇，阿仑特罗，防止骨吸收的常规药剂，选雌激素，降钙素，二膦酸盐和异丙氧黄酮，PI3K抑制剂，Erk抑制剂。优选地，所述骨质吸收、破坏疾病选自以骨质破坏、吸收为主要病理特征的多种代谢性骨病，如炎性骨吸收、骨质疏松症、骨质硬化症和I^aget骨病等。更优选地，所述骨质吸收、破坏疾病选自骨质疏松。优选地，本发明涉及23C3单抗联合Erk抑制剂和/或PII抑制剂在制备治疗和/ 或预防骨质吸收、破坏疾病的药物中的应用。优选地，所述Erk抑制剂是2-(2-氨基-3甲氧基苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮，更优选地，所述Erk抑制剂是PD98059 ；优选地，所述PII 抑制剂是2- (4-吗啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮盐酸盐，更优选地，所述PII抑制剂是LY^4002 ；优选地，所述骨质吸收、破坏疾病选自以骨质破坏、吸收为主要病理特征多种代谢性骨病，如炎性骨吸收、骨质疏松症、骨质硬化症和Paget骨病等，更优选地，所述骨质吸收、破坏疾病选自骨质疏松。上述药物的施用对象为哺乳动物，优选地，施用对象为人。具体地，本发明的发明人建立了胶原诱导的DBA/1J小鼠关节炎模型、卵巢切除术 (OVX)诱导的小鼠骨质疏松模型，利用23C3单克隆抗体在这两种疾病模型中进行实验，观察23C3单克隆抗体在这两种骨质吸收、破坏疾病模型中保护作用。同时从国外Jackson实验室引进了 OPN基因敲除的C57BL/6小鼠，更深入的阐明OPN分子在骨质破坏和骨质吸收为主要病例特征的多种代谢性骨病中的作用机制。利用胶原诱导的DBA/1J小鼠关节炎模型进行实验，结果显示，23C3单抗可有效抑制破骨细胞功能活性，减少破骨细胞数量，降低骨质破坏，具有良好的保护骨吸收作用。利用OVX诱导的小鼠骨质疏松模型进行实验，结果显示，23C3单抗可显著减少破骨细胞数量，减轻骨质疏松程度，从而达到治疗和/或预防骨质吸收、破坏疾病的目的。利用OPN基因敲除的C57BL/6小鼠进行实验，结果显示，23C3 单抗可通过调控OPN受体的mRNA表达水平，特别是以α 4、β 5为引物的OPN受体的mRNA 表达水平以及破骨细胞标志酶基因表达水平，特别是Ctsk、CTR、TRAP、MMP-14这4种破骨细胞标志酶基因表达水平，显著抑制破骨细胞的功能，包括抑制破骨细胞的骨吸收能力、粘附能力，迁移能力、存活能力；而且23C3单抗可通过调节RNAK的表达来抑制破骨细胞分化和骨吸收功能；另外23C3单抗还可通过抑制破骨细胞MAPK信号通路成员Erk激酶和Akt 激酶的活性来抑制破骨细胞功能。通过上述作用机制，23C3单抗可显著抑制破骨细胞的骨吸收能力、粘附能力，迁移能力、存活能力，有效抑制破骨细胞分化和生成，减少破骨细胞数量，从而实现其在以骨质破坏和骨质吸收为主要病例特征的多种代谢性骨病中的预防和/ 或治疗作用。本发明的发明人还对胞外信号调节激酶(extracellular signal-reg-ulated kinase, Erk)抑制剂和磷脂酰肌醇 _3_ 激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K) 抑制剂对破骨细胞骨吸收功能、粘附功能、迁移功能的影响进行了实验。Erk抑制剂选自 PD98059 (化学名2- (2-氨基-3-甲氧基苯基)-4H—1-苯并吡喃_4_酮)，PD 98，059也写作 PD98059，PD 98059，PD098059 或 PD 098059，是一种常用的 MAPKK 抑制剂，S卩 MAPK kinase 抑制剂或MEK抑制剂，它可以通透细胞，选择性抑制MEKl ( 一种MAPK kinase)，从而抑制 MAP kinase (Erkl/2即p44/42MAPK)的磷酸化和激活。PII抑制剂选自LY294002 (化学名 2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮盐酸盐)，LY294002也写作LY-294,002, LY-294002或LY 294002，是一种常用的PII抑制剂，它可以通透细胞，特异性抑制PII，抑制PII/Akt信号途径，包括常见的抑制Akt磷酸化等。实验结果表明，Erk抑制剂可显著抑制破骨细胞骨吸收功能，PI3K抑制剂可显著抑制破骨细胞迁移功能。当两种或两种以上的药物联合给药时，一般具有优于两种药物分别单独给药的效果，23C3单抗联合对治疗和/或预防骨质吸收、破坏疾病有作用的其它活性物质一起施用，将起到更好的效果。其它活性物质可选自以下一种或多种物质促进骨质重建的活性治疗剂，优选类固醇、氟化物、维生素D、维生素D衍生物、甲状旁腺激素，骨化三醇，阿仑特罗等；防止骨吸收的常规药剂，优选雌激素、降钙素、二膦酸盐和异丙氧黄酮等；PII抑制剂，优选2-(2-氨基-3-甲氧基苯基)-4Η-1-苯并吡喃-4-酮，PD98059 ；Erk抑制剂，优选 2-(2-氨基-3-甲氧基苯基)-4Η-1-苯并吡喃-4-酮，PD98059。骨质吸收、破坏疾病选自以骨质破坏、吸收为主要病理特征的多种代谢性骨病，如炎性骨吸收、骨质疏松症、骨质硬化症和Paget骨病等。本发明中所述的预防和/或治疗，包括但不限于缓解或/和减轻疾病的各种症状。
图1. 23C3单抗治疗对CIA小鼠关节骨吸收的保护作用。图2. 23C3单抗治疗组CIA小鼠尿液中D_pyr水平的变化。图3. 23C3单抗治疗组CIA小鼠血清中TRAP^3水平的变化。图4. 23C3单抗治疗组CIA小鼠破骨细胞数量变化。图5. OVX模型小鼠经23C3单抗治疗后胫骨μ CT骨小梁参数变化。其中，图5_1. OVX模型小鼠经23C3单抗治疗后胫骨μ CT骨小梁的骨矿物质密度(BMD)的变化；图5-2. OVX模型小鼠经23C3单抗治疗后胫骨μ CT骨小梁的骨容积比(BV/TV)的变化；图5_3. OVX 模型小鼠经23C3单抗治疗后胫骨μ CT骨小梁的骨小梁间隙(Tb. Sp)的变化；图5-4. OVX模型小鼠经23C3单抗治疗后胫骨μ CT骨小梁的骨表面积/骨体积(BS/BV)的变化；图5-5. OVX模型小鼠经23C3单抗治疗后胫骨μ CT骨小梁的骨小梁厚度(Tb. Th)的变化；图5-6. OVX模型小鼠经23C3单抗治疗后胫骨μ CT骨小梁的骨小梁数量(Tb. N)的变化。图6. OVX模型小鼠经23C3单抗治疗后胫骨破骨细胞数量的变化。图7. 23C3单抗和OPN分子对破骨细胞分化的影响。其中，图7_1. WT与Opn-/-小鼠破骨细胞分化数量的比较；图7-2. 23C3单抗对破骨细胞分化的影响，图7-3. OPN分子对破骨细胞分化的影响。图8. 23C3单抗和OPN分子对破骨细胞骨吸收功能的影响。图9. 23C3单抗和OPN分子对破骨细胞骨粘附能力的影响。图10. 23C3单抗和OPN分子对破骨细胞迁移能力的影响。图11. 23C3单抗和OPN分子对破骨细胞存活能力的影响。其中，图11-1.WT与 Opn-/-小鼠破骨细胞存活能力不同；图11-2. 23C3单抗对破骨细胞存活能力的影响，图11-3. OPN分子对破骨细胞存活能力的影响。图12. 23C3单抗对破骨细胞OPN受体mRNA表达水平的影响。图13. 23C3单抗对破骨细胞标志酶基因表达水平的影响。图14. 23C3单抗对破骨细胞前体细胞和成熟破骨细胞c-fms、RANK表达水平的影响。其中，图14-1. 23C3单抗对破骨细胞前体细胞和成熟破骨细胞c-fms表达水平的影响； 图14-2. 23C3单抗对破骨细胞前体细胞和成熟破骨细胞RANK表达水平的影响。图15. 23C3单抗对破骨细胞分化和激活的信号通路MAPK (p38、Erk、JNK)和Akt活化水平的影响。其中，图15-1. 23C3单抗对破骨细胞分化和激活的信号通路MAPK(p38、Erk、 JNK)活化水平的影响；图15-2. 23C3单抗对破骨细胞分化和激活的信号通路PII/Akt活化水平的影响。图16. 23C3单抗对破骨细胞分化形成相关蛋白c_Fos、c_Src、NFATcl、TRAF6表达水平的影响。图17. PI3K抑制剂LY^4002和Erk抑制剂PD98059对破骨细胞骨吸收功能的影响。图18. PI3K抑制剂LY^4002和Erk抑制剂PD98059对破骨细胞粘附功能的影响。图19. PI3K抑制剂LY^4002和Erk抑制剂PD98059对破骨细胞迁移功能的影响。图20. 23C3单抗对人破骨细胞分化影响。图21. 23C3单抗对人破骨细胞骨吸收功能影响。
具体实施例方式ant i-OPN mAb 购于 Santa cruz 公司；雌性野生型(WT)和OPN基因敲除(Ορη-/-)小鼠购于美国Jackson实验室；23C3单克隆抗体按中国专利申请号200880013620. 1申请日2008年3月25日发明名称为《骨桥蛋白的功能表位，与其特异性结合的单克隆抗体及用途》中公开的方法制备得到。以下实施例仅仅对本发明进行进一步说明，不应理解为对本发明的限制。同时实施例不包括对传统方法的详细描述。实施例中未标明来源的材料均为市售。实施例1. 23C3单抗治疗对胶原性关节炎(CIA)小鼠关节骨吸收的保护作用IOOug鸡II型胶原(购于Condrex)和等体积的弗氏完全佐剂乳化后，经 DBA/1J(雄性，8-10周)(购于中国科学院药物所)尾部皮下初次免疫；21天后进行再次免疫，即将IOOug鸡II型胶原和等体积的弗氏不完全佐剂乳化后，尾部皮下再次免疫。 将2次免疫后的小鼠分成3组，分别给予小鼠IgG(200ug/body,购于Sigma)、anti-OPN mAb (200ug/body)、23C3单抗QOOug/body) ；3组均腹腔给药，从第二次免疫当天开始给药， 隔天给药，连续六次。取23C3单抗和对照治疗组小鼠，于二次免疫后30天行X-ray检测， 观察各发病关节的骨质破坏情况。结果如图1，与对照抗体治疗组相比，23C3单抗治疗组骨矿物质密度明显增加。提示23C3单抗对骨吸收具有良好的保护作用。实施例2. 23C3单抗治疗组CIA小鼠尿液中D_pyr水平的变化收集不同治疗组DBA/1J小鼠二次免疫后(相关步骤同实施例1)第30天的尿液， 小鼠D-pyrELISA试剂盒(购于R&D公司)检测D_pyr的水平。D_pyr是成熟的胶原分子构成胶原纤维时分子间的交联物，在胶原纤维中起稳定胶原链的作用。在骨I型胶原(BIC) 降解后，检测尿液中D-pyr水平可以有效反映骨吸收情况。结果如图2所示，23C3单抗治疗组尿液中D-pyr明显低于对照抗体组。提示23C3单抗对骨吸收具有良好的保护作用。实施例3. 23C3单抗治疗组CIA小鼠血清中TRAP^3水平的变化收集不同治疗组DBA/1J小鼠二次免疫后(相关步骤同实施例1)第30天的血液， 小鼠 TRAP5bELISA 试剂盒(购于 Immunodiagnostic systems 公司)检测 TRAP5b 的水平。 TRAP5b是破骨细胞合成与分泌的产物，是反映破骨细胞活性的特异性酶。结果如图3所示， 23C3单抗治疗组血清中TRAP^3明显低于对照抗体组。提示23C3单抗抑制破骨细胞功能活性从而对骨吸收起到良好的保护作用。实施例4. 23C3单抗治疗组CIA小鼠破骨细胞数量变化于不同治疗组DBA/1J小鼠二次免疫后(相关步骤同实施例1)第30天取下肢组织进行石蜡包埋切片，各实验组组织切片脱蜡至水后，加入TRAP染色液，37°C水浴，避光孵育1小时，苏木精染色2分钟，风干，封片。结果如图4所示，与对照抗体治疗组相比，23C3 单抗治疗组破骨细胞数量减少。实施例5. OVX模型小鼠经23C3单抗治疗后胫骨μ CT骨小梁参数变化取6周雌性野生型(WT)和OPN基因敲除(Ορη-/-)小鼠(购于美国Jackson实验室，以下均同)，1 %戊巴比妥那麻醉，背部备皮，沿背部后正中线作一长约0. 5 1. Ocm 的皮肤切口，沿皮下组织分别向左右游离手术切口皮肤，先将皮肤切口向左侧水平牵开约 0. 5cm.，透过菲薄的肌层，在切口视野中可见一乳白色发亮的脂肪团，紧靠肾脏下极。用镊子提起脂肪团表面的肌层，沿腰大肌外侧缘用眼科剪纵形剪开肌层，长约0. 5cm，在该脂肪团中即可找到小鼠左侧卵巢。行卵巢切除后，用5/0丝线单纯缝合一针修复剪开的肌层，同法可切除小鼠右侧卵巢。修复剪开的肌层，最后用5/0丝线一针缝合皮肤切口。同上法假手术作为对照组。卵巢切除(OVX)后将WT小鼠分成4组，一组不处理，另外三组组分别给予小鼠 IgGQOOug/body)、anti-0PN mAM200ug/body)、23C3 单抗(200ug/body)；所有治疗组均腹腔给药，从OVX后8天开始给药，隔4天给药，连续七次。于OVX后36天取小鼠胫骨行μ CT检测，观测各个实验组胫骨骨质疏松程度。结果如图5，其为小鼠胫骨干骺端μ CT 三维重建后相应骨小梁结构参数统计分析图，骨小梁参数骨容积比(BV/TV)，骨小梁数量 (Tb. N)，骨表面积/骨体积(BS/BV)，骨小梁间隙(Tb. Sp)，骨小梁厚度(Tb. Th)，骨矿物质密度(BMD)。骨小梁参数可以间接反映骨质疏松程度。OVX后的WT小鼠骨体积明显减少； 与WT小鼠相比，Opn-/-小鼠和23C3单抗治疗组骨质疏松程度不明显；与对照抗体治疗组相比，23C3单抗治疗组骨质疏松程度明显减轻。提示23C3单抗对骨质破坏具有保护作用。实施例6. OVX模型小鼠经23C3单抗治疗后胫骨破骨细胞数量的变化 于OVX后(相关步骤同实施例5) 36天取各实验组组织切片脱蜡至水后，加入TRAP 染色液，37°C水浴，避光孵育1小时，苏木精染色2分钟，风干，封片；各实验组组织切片脱蜡至水后，加入苏木精染色2分钟，伊红复染5分钟，烘干，封片。结果见图6，与WT小鼠相比，Opn-/-小鼠和23C3单抗治疗组破骨细胞数量减少；与对照抗体组相比，23C3单抗治疗组破骨细胞数量明显减少。提示23C3单抗对骨质破坏具有保护作用。实施例7. 23C3单抗和OPN分子对破骨细胞分化的影响6-10周龄雄性WT和Opn-/-小鼠断颈处死，无菌条件下分离股骨及肱骨；剪断两侧骨骺端，用Iml注射针头将α -MEM (含1000U/ml青霉素、1000U/ml链霉素，2mM/L的 L-谷胺酰氨，10%胎牛血清，30ng/ml的M-CSF)轻轻冲洗骨髓腔；收集骨髓细胞混合液，于 40 μ m滤网过滤并接种至直径IOcm的培养皿中，37°C，5% CO2培养Mh;收集未贴壁的细胞， IOOOrpm 离心 5min，沉淀用 α -MEM(含 1000U/ml 青霉素，1000U/ml 链霉素，2mM/L 的 L-谷胺酰氨，10%胎牛血清，30ng/ml的M-CSF，50ng/ml的RANKL)培养液重悬，计数并调整细胞浓度为lX107ml后接种于6孔培养扳中，每孔接种2ml ；培养4 后，PBS漂洗，以去除未黏附的细胞，以贴壁的骨髓单核细胞作为诱导破骨细胞的前体细胞；细胞每2天换液1次， 每次换液50%。培养8天后用TRAP染色，TRAP+多核细胞(3个或3个以上)为破骨细胞。 实验结果见图7-1，相对于WT小鼠破骨细胞，Opn-/-小鼠破骨细胞数量和大小都有所减少， 提示OPN与破骨细胞分化关系密切。在WT小鼠破骨细胞分化过程中，加入不同浓度(5μ g/ml,10y g/ml,20y g/ml, 30 μ g/ml) 23C3 单抗，30 μ g/ml 小鼠 IgG 和 30 μ g/ml anti-OPN mAb 作为对照，TRAP 染色后，随机取10个视野分别对不同浓度破骨细胞进行计数，结果如图7-2，与对照抗体组相比，20 μ g/ml和30 μ g/ml 23C3单抗组破骨细胞数量显著减少，提示23C3单抗可以抑制破骨细胞分化，同时，与对照抗体相比，23C3单抗具有更明显的抑制破骨细胞分化作用。在WT小鼠破骨细胞分化过程中，加入不同浓度(0 μ g/ml, 2. 5 μ g/ml, 5 μ g/ml, 10 μ g/ml, 15 μ g/ml, 30 μ g/ml) OPN蛋白，TRAP染色后，随机取10个视野分别对不同浓度破骨细胞进行计数，结果如图7-3，与Ομ g/ml组相比，10 μ g/ml、15 μ g/ml和30 μ g/ml OPN 蛋白组破骨细胞数量显著增加，提示OPN蛋白可以促进破骨细胞分化。实施例8. 23C3单抗和OPN分子对破骨细胞骨吸收功能的影响分离WT小鼠和Opn-/-小鼠骨髓单核细胞，调整细胞浓度为5X 105/ml后接种于预先置放骨片的96孔培养扳中，每孔接种200μ 1，另设2组，分别为WT小鼠破骨细胞加入 20 μ g/ml 小鼠 IgG,20 μ g/ml anti-OPN mAb,20 μ g/ml 23C3 单抗和 Opn-/-小鼠破骨细胞加入10 μ g/ml OPN蛋白，细胞每2天换液1次，每次换液50% ；诱导8天后，把贴有细胞的骨片取出，IM的氢氧化氨浸泡过夜；甲苯胺蓝染液室温下染色3min，蒸馏水清洗后自然凉干；光镜下对破骨细胞吸收陷窝(圆形、椭圆形和腊肠等典型形态，边界清楚的蓝色异染区)观察采像；利用IPP软件(版本5. 0)对陷窝面积进行处理，每个实验组取5个骨片进行统计分析。实验结果见图8，相比于WT小鼠的破骨细胞，Opn-/-小鼠破骨细胞的骨吸收能力下降。同时，与对照抗体相比，23C3单抗对WT小鼠的破骨细胞骨吸收能力有更明显的抑制作用；相反，OPN蛋白可以改善Opn-/-小鼠破骨细胞的骨吸收能力。实施例9. 23C3单抗和OPN分子对破骨细胞骨粘附能力的影响96孔酶标板包被纤维结合蛋白，10 μ g/ml，4°C过夜；1 % BSA/PBS封闭，37°C，Ihr ； 分化成熟的野生型小鼠、Opn-/-小鼠破骨细胞，用无血清α -MEM(含30ng/mlM-CSF，0. 25% BSA)重悬细胞，调整细胞浓度为1 X IO5细胞/ml ；每孔加入200 μ 1细胞悬液，每组设6复孔，处理组同时加入小鼠IgG、anti-OPN mAb、23C3单抗和OPN蛋白；在37°C细胞培养箱中敷育60min ；轻轻吸去上清，以PBS洗涤2次；每孔加入100 μ 1 1 %甲醛溶液进行固定，4°C， IOmin ；轻轻吸去固定液，PBS洗涤1次；每孔加入100 μ 1 0. 5%结晶紫溶液，室温，20min ； 轻轻吸去染色液，PBS洗涤；每孔加入100 μ 1 33%醋酸溶液裂解细胞；在酶标仪OD 570nm处读数。实验结果见图9，相比于WT小鼠的破骨细胞，Opn-/-小鼠破骨细胞的粘附能力下降。同时，与对照抗体相比，23C3单抗对WT小鼠的破骨细胞粘附能力有抑制作用，相反，OPN 蛋白可以促进Opn-/-小鼠破骨细胞的粘附能力。实施例10. 23C3单抗和OPN分子对破骨细胞迁移能力的影响在对孔1^1111611小室系统(聚碳酸酯膜孔径为8 μ m)的上层加入无血清α -MEM 进行水化，37°C，lhr ；在小室的下层加入600 μ 1无血清α -MEM(含30ng/ml M_CSF，0. 1% BSA/)；分化成熟的野生型小鼠和Opn-/-小鼠的破骨细胞用0. 1 % BSA/ α -MEM重悬细胞， 调整细胞浓度为5X IO5细胞/ml。在小室的上层加入100 μ 1细胞悬液，处理组同时加入小鼠IgG, anti-OPN mAb、23C3单抗和OPN蛋白。将Transwell小室系统在37°C细胞培养箱内敷育8hr ；用棉拭子将上层的细胞擦去；以1 %甲醛溶液固定下层细胞；PBS洗涤2次，下层加入600 μ 1 0. 5%结晶紫溶液，室温，20min ；PBS洗涤2次；室温，风干；倒置显微镜下拍照。实验结果见图10，相比于WT小鼠的破骨细胞，Opn-/-小鼠破骨细胞的迁移能力下降。同时，与对照抗体相比，23C3单抗对WT小鼠的破骨细胞迁移能力有明显的抑制作用； 相反，OPN蛋白可以促进Opn-/-小鼠破骨细胞的迁移能力。实施例11. 23C3单抗和OPN分子对破骨细胞存活能力的影响调整分化成熟的WT小鼠和Opn-/-小鼠破骨细胞的细胞浓度为2X IO5细胞/ml ； 加入M孔培养板中，每孔500 μ 1，两种细胞类型分别设置3组，即无血清α -MEM作用时间 (Ohr，12hr, 24h)，对照组用ImgAilNaN3处理12hr ；另外在野生型小鼠破骨细胞加入20 μ g/ ml 小鼠 IgG、20y g/ml anti-OPN mAb、23C3 单抗(5 μ g/ml, 10 μ g/ml, 20 μ g/ml)禾口 OPN 蛋白(0μ g/ml，2. 5μ g/ml，5y g/ml，10y g/ml)，无血清 α-MEM 作用 24hr ；收集细胞到流式管中。4°C，1500rpm 离心 IOminJml PBS 重悬细胞，4°C，1500rpm 离心 lOmin，^nl PBS 重悬细胞,40C，1500rpm 离心 IOmin, 100 μ 1 结合 Buffer 重悬细胞，加入 5 μ 1 Annexin V-FITC, 10 μ 1 PI，避光孵育15min，加入200 μ 1结合Buffer重悬细胞，混勻。上流式机检测。实验结果见图11，其中，图11-1表明，相比于WT小鼠的破骨细胞，Opn-/-小鼠破骨细胞不同时间点凋亡细胞数量都有所增加，说明Opn-/-小鼠破骨细胞的存活能力下降。 图11-2表明，与对照抗体相比，在无血清刺激24h后，23C3单抗处理破骨细胞凋亡细胞数量明显增加，提示23C3单抗对破骨细胞存活能力有显著的抑制作用，图11-3表明，OPN蛋白可以促进Opn-/-小鼠破骨细胞的存活能力。实施例12. 23C3单抗对破骨细胞OPN受体mRNA表达水平的影响取分化成熟的WT小鼠破骨细胞，在分化过程中加入小鼠IgG、anti_OPN mAb、23C3 单抗处理。RNeasy Mini Kit (购自 QIAGEN)抽取细胞总 RNA，用 Sensiscript RT Kit (购自QIAGEN)反转录RNA为cDNA。根据实时PCR(RT-PCR)要求，设计OPN受体引物，见表1。 反应步骤为-MV，2分钟；940C，1分钟，55°C，1分钟和72°C，2分钟，30个循环；72°C，5分钟。β-actin基因作为内参。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。实验结果见图12，αν、α8、α9、β1、β 3、⑶44在对照抗体组和23C3处理组破骨细胞比较无明显变化，其中α 8、α 9表达量很低；而α 4、β 5在23C3处理组中明显降低。 提示α 4、β 5这两种OPN受体可能与23C3单抗抑制破骨细胞的功能相关。
表IOPN各受体的引物RT-PCR实验所检测分子的特异性引物
权利要求
1.抗骨桥蛋白单克隆抗体23C3在制备治疗和/或预防骨质吸收、破坏疾病的药物中的应用。
2.权利要求1的应用，其中所述骨质吸收、破坏疾病是以骨质破坏、吸收为主要病理特征的代谢性骨病。
3.权利要求2的应用，其中所述的代谢性骨病为炎性骨吸收、骨质疏松症、骨质硬化症或I^aget骨病。
4.权利要求3的应用，其中所述的代谢性骨病为骨质疏松。
5.权利要求1-4的应用，其中所述药物联合其它活性物质一起施用，其它活性物质选自以下一种或多种促进骨质重建的活性治疗剂，类固醇，氟化物，维生素D，维生素D衍生物，甲状旁腺激素，骨化三醇，阿仑特罗，防止骨吸收的药剂，雌激素，降钙素，二膦酸盐，异丙氧黄酮，PI3K抑制剂，Erk抑制剂。
6.权利要求5的应用，其中所述药物联合Erk抑制剂和/或PUK抑制剂一起施用。
7.权利要求6的应用，其中所述Erk抑制剂是2-(2-氨基3甲氧基苯基)-4Η-1-苯并吡喃-4-酮。
8.权利要求6的应用，其中所述Erk抑制剂是PD98059。
9.权利要求6的应用，其中所述PII抑制剂是2-(4-吗啉基)8苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮盐酸盐。
10.权利要求6的应用，其中所述PII抑制剂是LY^4002。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体地，本发明公开了一种抗骨桥蛋白单克隆抗体对骨质疏松的保护作用。本发明的发明人利用抗骨桥蛋白单克隆抗体23C3在胶原诱导的DBA/1J小鼠关节炎模型、卵巢切除术(OVX)诱导的小鼠骨质疏松模型中进行实验，结果表明23C3单克隆抗体具有极好的在骨质破坏和吸收中的保护作用，可用于治疗和/或预防骨质疏松等骨质吸收、破坏疾病。另外，本发明还涉及23C3单克隆抗体与其它活性物质(优选PI3K抑制剂和/或Erk抑制剂)一起施用治疗骨质疏松等骨质吸收、破坏疾病。
文档编号A61P19/08GK102266558SQ20101019131
公开日2011年12月7日 申请日期2010年6月3日 优先权日2010年6月3日
发明者侯盛, 戴建新, 樊克兴, 王皓, 赵健, 郭亚军 申请人:上海抗体药物国家工程研究中心有限公司