一种用于预测nsclc病人预后的试剂盒及骨桥蛋白作为特异标记物的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于构建预测NSCLC病人预后及指导唑来膦酸临床应用的试剂盒和将骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)作为M2型巨噬细胞的特异性标记物的应用；应用本发明试剂盒是采用免疫荧光双标技术检测组织芯片中OPN在TAMs和肿瘤细胞中的表达，对NSCLC病人预后进行评估，并针对试剂盒的检测结果及时采取综合手段干预，提高病人远期生存率，改善预后，方法简单、方便、可广泛应用于临床。
【专利说明】—种用于预测NSCLC病人预后的试剂盒及骨桥蛋白作为特异标记物的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及【技术领域】，特别是涉及一种用于预测NSCLC病人预后的试剂盒及骨桥蛋白作为特异标记物的应用。
【背景技术】
[0002]肺癌是目前发病率和死亡率均居第一位的恶性肿瘤。尽管近几年来肺癌的综合治疗取得很大进展，然而其5年生存率仍然徘徊在15%左右。肺癌的70%?80%为非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC), NSCLC很容易发生远处转移(脑、骨、肾上腺和肝脏转移)。即使I期肺癌患者，在术后也有27% -55%的患者将出现复发转移的情况。如何早期鉴别这部分高危人群并及时给予辅助治疗是目前研究的焦点。
[0003]目前，包括微小RNA、基因、染色体、和蛋白等用于预测预后或干预治疗的因素已被广泛研究，其主要研究对象局限于肿瘤细胞本身，忽略了肿瘤生存的“土壤” 一微环境。肿瘤的微环境指肿瘤细胞周围的纤维原细胞、免疫细胞和细胞外基质等；微环境是肿瘤与宿主之间的相互作用的直接接触面，它在肿瘤细胞的发生演进过程中起重要作用。在肿瘤微环境免疫细胞中最重要的是巨噬细胞。浸润肿瘤间质中的巨噬细胞称之为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages, TAMs)。既往认为TAMs只是肿瘤免疫调节过程中的一种重要细胞群，可以直接杀伤肿瘤细胞，或者通过呈递肿瘤相关抗原诱导机体免疫应答从而清除肿瘤。
[0004]近年来，Mantovani等提出了著名的“巨噬细胞平衡假说”，认为TAMs具有杀伤肿瘤和促进肿瘤生长的双重作用。一部分TAMs表现出促进肿瘤进展的M2表型；相反另外一种表型为M1，具有抑制肿瘤的功能。NSCLC间质中的TAMs功能尚存争论，不同学者的研究结果甚至相互矛盾，目前并无确切的解释，其关键因素在于目前关于M2和Ml巨噬细胞缺乏特异性的标记物。
[0005] 申请人:在研究肺癌标本癌巢骨桥蛋白(Osteopontin，0ΡΝ)的表达时发现，不仅肿瘤细胞表达0ΡΝ，而且部分病例的肿瘤间质中浸润的TAMs也表达0ΡΝ。进一步分析显示伴有OPN阳性TAMs浸润的患者较OPN阴性TAMs浸润患者更容易出现远处转移，预后更差。这在既往有关NSCLC的研究中从未报道过。
[0006]目前市场上销售的唑来膦酸等治疗恶性肿瘤骨转移的药物其机理都是通过抑制骨组织的破骨细胞(巨噬细胞分化而成)达到治疗作用。大量的体内和体外实验证实唑来膦酸可抑制肿瘤细胞的增殖和转移，然而这种抑制并非“靶向”，同时包括了 Ml型和M2型的巨噬细胞，如果指导唑来膦酸的“靶向”抑制Ml型将大大促进促进肿瘤治疗的发展。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种鉴别M2型TAMs的标记物，并用于构建预测NSCLC病人预后及指导唑来膦酸临床应用的试剂盒。[0008]本发明的另外一个目的在于提供一种将骨桥蛋白(Osteopontin, 0ΡΝ)作为M2型巨噬细胞的特异性标记物的应用。
[0009]为实现本发明的目的所采用的技术方案是:一种用于预测NSCLC病人预后的试剂盒，其特征在于包括CD68单克隆抗体、OPN单克隆抗体、荧光二抗和免疫荧光试剂。
[0010]所述荧光二抗为⑶163标记M2鼠抗人单克隆抗体和MHCII标记Ml鼠抗人单克隆抗体。
[0011]免疫荧光试剂包括pH为7.2-7.4的磷酸盐缓冲液(PBS，全称Phosphate BufferedSaline)、0.0lmol/L柠檬酸钠缓冲液、3%的牛血清白蛋白和荧光淬灭抑制剂。
[0012]所述磷酸盐缓冲液是将8.0Og 的 NaCl、0.20g 的 KC1、2.083g 的 Na2HP04.12H20、0.261g的KH2P04.12Η20放入950ml的蒸馏水中，用盐酸调节pH至7.2-7.4，然后蒸馏水定容至1000ml制备而成。
[0013]所述柠檬酸钠缓冲液是将3g的柠檬酸三钠、0.4g的柠檬酸加入1000ml的蒸馏水制备而成。
[0014]上述骨桥蛋白(Osteopontin, 0ΡΝ)可作为M2型巨噬细胞的特异性标记物的应用。
[0015]本发明的原理及有益效果是:本发明能够体现OPN阳性表达的TAMs是一预后预测标记物，可作为非小细胞肺癌移复发、预后预测提供新的试剂盒，通过本发明发现OPN阳性TAMs可作为唑来膦酸抗肿瘤治疗疗效的标记物；应用本发明试剂盒是采用免疫荧光双标技术检测组织芯片中OPN在TAMs和肿瘤细胞中的表达，对NSCLC病人预后进行评估，并针对试剂盒的检测结果及时采取综合手段干预，提高病人远期生存率，改善预后，方法简单、方便、可广泛应用于临床。
【具体实施方式】
[0016]以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0017]首先，对本发明涉及到的用于预测NSCLC病人预后的试剂盒的实验基础说明如下:
[0018]1.实验材料
[0019](I)组织芯片
[0020]159例原发性非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC)标本选自 2003年I月至2006年12月期间在天津肿瘤医院接受手术患者并且经病理明确的存档蜡块，所有标本经常规取材，10%甲醛液固定，石蜡包埋，4 μ m厚连续切片，选取需要部位，将其制成含159个点阵的组织芯片。
[0021]159例组织芯片的患者均接受以手术为主的综合治疗。术后病理确诊为II期、III a期的患者均接受术后辅助化疗。化疗方案采用NSCLC的常规方案，包括长春瑞滨、紫杉醇、及吉西他滨联合顺钼或卡钼等。
[0022](2)本发明试剂盒及免疫组化、荧光所需的其他试剂
[0023]一种用于预测NSCLC病人预后的试剂盒，包括⑶68单克隆抗体、OPN单克隆抗体、荧光二抗和免疫荧光试剂。
[0024]所述荧光二抗为⑶163标记M2鼠抗人单克隆抗体和MHCII标记Ml鼠抗人单克隆抗体。
[0025]具体的分类如下:
[0026]I)抗体:
[0027]
OPN (兔抗人单克隆抗体，克隆号:EPR3688)Abcom公司
CD68 (鼠抗人单克隆抗体，克隆号:KPl)Santa Cruz公司
MHCII标记Ml (鼠抗人单克隆抗体，克隆号:LN3)Santa Cruz公司
CD 163标记M2 (鼠抗人单克隆抗体，克隆号:10D6) Santa Cruz公司
[0028]2) lXPBS(pH7.2-7.4):
[0029]
NaCl8.0Og
KCl0.^Ol
Na1JlPO1.1211,02.08?
[0030]
ΚΠ,ΡΟ,.12Η200.26Ig
[0031]加蒸懼水至950ml, HCL调节pH至7.2-7.4,蒸懼水定容至1000ml。
[0032]3) 0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液
[0033]柠檬酸三钠3g
[0034]柠檬酸0.4g
[0035]加蒸馏水至1000ml。
[0036]4)正常羊血清封闭液
[0037]5) DAB 北京中杉金桥公司
[0038]6)树胶封片剂
[0039]7) 3%的牛血清白蛋白
[0040]8)荧光淬灭抑制剂
[0041]2.具体实验步骤
[0042](I)免疫组化步骤(SP法)
[0043] I)脱蜡、水化:脱蜡前应将组织芯片放于铁架上，于65°C烤箱中烘干过夜。次日组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后在浸泡10分钟；无水乙醇中浸泡五分钟；95%乙醇中浸泡五分钟；75%乙醇中浸泡五分钟；至清水中浸泡水化完毕。
[0044]2)取出切片，用PBS冲洗切片3次，每次5分钟。
[0045]3)高温高压热修复抗原:高压锅中加入适当0.01m枸橼酸钠缓冲溶液(ph6.0)，240°C加热至沸腾，将组织芯片置入其中，加盖锅盖，至工作压力持续加热150s，停止加热。
[0046]4)自然冷却至室温。
[0047]5)将组织芯片置于10%过氧化氢溶液避光浸泡20分钟，去除组织中的过氧化氢酶。
[0048]6) PBS洗脱3次各5分钟。
[0049]7)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体。
[0050]8) PBS洗脱3次各5分钟，甩去多余液体。
[0051]9)滴加一抗:分别滴加1:1000PN兔抗人单克隆抗体/1:100⑶68鼠抗人单克隆抗体/1:100M1鼠抗人单克隆抗体/1:100M2鼠抗人单克隆抗体100 μ I于组织芯片，并用PBS缓冲液作为一抗抗体阴性对照，覆盖组织表面，液面一定要超过组织周围少许，4°C湿盒内孵育过夜。
[0052]10)4°C过夜后需在37°C复温45分钟。
[0053]11) PBS洗脱3次每次5分钟，甩去多余液体。
[0054]12)滴加二抗100 μ I覆盖组织，室温湿盒内孵育30min。
[0055]13) PBS洗3次各5分钟。
[0056]14)滴DAB显色剂覆盖组织室温避光显色I?2分钟，在显微镜下掌握染色程度。
[0057]15)置入蒸懼水中停止显色反应。
[0058]16)苏木复染2?4分钟，蒸馏水洗脱；盐酸酒精复红2分钟左右，蒸馏水洗脱；氨水返蓝2分钟，蒸馏水洗脱。
[0059]17)脱水、透明:80 %乙醇IOmin, 90 %乙醇IOmin,无水乙醇IOmin两次，二甲苯20min两次。
[0060]18)树胶封片，镜下观察统计结果。
[0061](2)免疫荧光步骤
[0062]I)脱蜡、水化:脱蜡前应将组织芯片放于铁架上，于65°C烤箱中烘干过夜。次日组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后在浸泡10分钟；无水乙醇中浸泡五分钟；95%乙醇中浸泡五分钟；75%乙醇中浸泡五分钟；至清水中浸泡水化完毕。
[0063]2)取出切片，用PBS冲洗切片3次，每次5分钟。
[0064]3)高温高压热修复抗原:高压锅中加入适当0.0lm枸橼酸钠缓冲溶液(ph6.0)，240°C加热至沸腾，将组织芯片置入其中，加盖锅盖，至工作压力持续加热150s，停止加热。
[0065]4)自然冷却至室温。
[0066]5)将组织芯片置于10%过氧化氢溶液避光浸泡20分钟，去除组织中的过氧化氢酶。
[0067]6) PBS洗脱3次各5分钟。
[0068]7)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体。
[0069]8) PBS洗脱3次各5分钟，甩去多余液体。
[0070]9)滴加一抗:分别滴加1:1000PN兔抗人单克隆抗体/1:100⑶68鼠抗人单克隆抗体/1:100M1鼠抗人单克隆抗体/1:100M2鼠抗人单克隆抗体100 μ I于组织芯片，并用PBS缓冲液作为一抗抗体阴性对照，覆盖组织表面，液面一定要超过组织周围少许，4°C湿盒内孵育过夜。
[0071]10)4°C过夜后需在37°C复温45分钟。
[0072]11) PBS洗脱3次每次5分钟，甩去多余液体。
[0073]12)滴加二抗100 μ I覆盖组织，室温湿盒内孵育30min。[0074]13) PBS洗3次各5分钟。
[0075]14)滴DAB显色剂覆盖组织室温避光显色I~2分钟，在显微镜下掌握染色程度。
[0076]15)置入蒸馏水中停止显色反应。
[0077]16)苏木复染2~4分钟，蒸馏水洗脱；盐酸酒精复红2分钟左右，蒸馏水洗脱；氨水返蓝2分钟，蒸馏水洗脱。
[0078]17)脱水、透明:80 %乙醇IOmin, 90 %乙醇IOmin,无水乙醇IOmin两次，二甲苯20min两次。 [0079] 18）树胶封片，镜下观察统计结果。[0080](3)免疫组化实验结果判定
[0081]对照组用PBS代替一抗作为阴性对照，用已知的扁桃腺组织作为TAMs及M1、M2亚组的阳性对照，巨噬细胞胞浆内出现清晰的黄褐色至棕黄色颗粒者为CD68阳性的TAMsj!察癌巢周围邻近间质中TAMs表达最密集的区域(hot spot)，在400倍光学显微镜下计数5个视野中的TAMs，取平均值记为该样本中TAMs的表达。
[0082](4)免疫荧光实验结果判定
[0083]对照组用PBS代替一抗作为阴性对照，用已知的扁桃腺组织作为TAMs荧光的阳性对照，阳性为红色荧光，OPN阳性为绿色荧光，TAMs表达OPN阳性者为黄色。
[0084]3.结论
[0085]综上，根据观察结果得知，TAMs主要浸润在肿瘤间质，特别是靠近血管的地方；骨桥蛋白的表达在肿瘤细胞和肿瘤间质巨噬细胞都有表达；免疫荧光双染进一步确定了 OPN阳性表达TAMs的存在。
[0086]实施例1:
[0087]一种用于预测NSCLC病人预后的试剂盒，其特征在于包括⑶68单克隆抗体、OPN单克隆抗体、荧光二抗和免疫荧光试剂。
[0088]应用上述试剂盒预测NSCLC癌病人预后及指导唑来膦酸的方法如下:
[0089]1、选取需要预测的NSCLC病人，从标本库找到其已行石蜡包埋组织块，并行组织切片
[0090]2、免疫荧光步骤
[0091]I)组织切片常规脱蜡、水化。
[0092]2)取出切片，用PBS冲洗切片3次，每次5分钟。
[0093]3)高温高压热修复抗原:0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)，高温高压热修复抗原。
[0094]4)自然冷却至室温。
[0095]5)将组织芯片置于10%过氧化氢溶液避光浸泡20分钟，去除组织中的过氧化氢酶。
[0096]6) PBS洗脱3次各5分钟。
[0097]7)滴加3%的牛血清白蛋白封闭液，室温20分钟，甩去多余液体。
[0098]8) PBS洗脱3次各5分钟。
[0099]9)⑶68鼠抗人单克隆抗体(1: 100)室温孵育过夜。
[0100]10) PBS洗脱3次各5分钟。[0101]ll)AlexaFluor555抗鼠免疫荧光二抗(1:100)室温孵育I小时。
[0102]12) PBS洗脱3次各5分钟。
[0103]13) OPN兔抗人单克隆抗体(1:100)室温孵育过夜。
[0104]14)AlexaFluor488抗兔荧光二抗(1:100)室温孵育I小时。
[0105]15)滴加荧光催眠抑制剂。
[0106]16)细胞核副染。
[0107]17)共聚焦激光扫描显微镜下进行结果判定。
[0108]结果分析=NSCLC间质可见大量OPN阳性表达的巨噬细胞，则这部分患者容易出现复发转移，预后差，即使早期的NSCLC患者也应该给予辅助治疗，不管目前是否存在骨转移，都应该给予唑来膦酸治疗。
[0109]实施例2
[0110]选取需要预测的NSCLC病人，按实施例1步骤,如果结果显示肿瘤间质中很少OPN阳性表达的巨噬细胞，提示这部分病人预后较好，出现复发转移的可能性较小，辅助治疗应该适度。
[0111]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种用于预测NSCLC病人预后的试剂盒，其特征在于:包括CD68单克隆抗体、OPN单克隆抗体、荧光二抗和免疫荧光试剂。
2.根据权利要求1所述的一种用于预测NSCLC病人预后的试剂盒，其特征在于所述荧光二抗为CD163标记M2鼠抗人单克隆抗体和MHCII标记Ml鼠抗人单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的一种用于预测NSCLC病人预后的试剂盒，其特征在于所述免疫荧光试剂包括pH为7.2-7.4的磷酸盐缓冲液(PBS，全称Phosphate Buffered Saline)、0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液、3%的牛血清白蛋白和荧光淬灭抑制剂。
4.根据权利要求3所述的一种用于预测NSCLC病人预后的试剂盒，其特征在于所述磷酸盐缓冲液是将 8.0Og 的 NaCU0.20g 的 KCl,2.083g 的 Na2HPCM.12H20、0.261g 的ΚΗ2Ρ04.12Η20放入950ml的蒸馏水中，用盐酸调节pH至7.2-7.4，然后蒸馏水定容至IOOOml制备而成。
5.根据权利要求3所述的一种用于预测NSCLC病人预后的试剂盒，其特征在于所述柠檬酸钠缓冲液是将3g的柠檬酸三钠、0.4g的柠檬酸加入IOOOml的蒸馏水制备而成。
6.根据权利要求1-6所述的一种用于预测NSCLC病人预后的试剂盒中所述的0ΡΝ，其特征在于应用于M2型巨噬细胞的特异性标记物。
【文档编号】G01N33/577GK103926408SQ201410182829
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】孙冰生 申请人:天津医科大学肿瘤医院