人源化抗人骨桥蛋白抗体的制作方法

专利名称：：人源化抗人骨桥蛋白抗体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及具有优异的活性和稳定性的人源化抗人骨桥蛋白抗体、以及使用该抗体的疾病的治疗和诊断方法。
背景技术：
：骨桥蛋白(以下称为"OPN")是在骨中较多含有的酸性钓结合性糖蛋白，已知在人体中，由于mRNA剪切的不同，可以产生骨桥蛋白-a(以下称为"OPN-a，，)、骨桥蛋白-b(以下称为"OPN-b，，)、骨桥蛋白-c(以下称为"OPN-c")的至少三种同工型(非专利文献1)。其中，OPN-a的前体具有后述序列表的SEQIDN0.23所示的氨基酸序列，通过分泌，信号肽被切割，形成I17-N314成熟体OPN-a。另外，成熟体OPN是通过生物体内的凝血酶，在第168号(为OPN-a时)的精氨酸残基的C末端一側被切割，形成N末端片段和C末端片段两段。上述OPN在多种生理学和病理学方面担负着重要的功能，例如具有细胞粘附、细胞游走、肿瘤形成、免疫应答和抑制以补体为介质的细胞溶解等功能。该多种功能是以多种细胞表面受体为介质。OPN在内部具有RGD序歹'j(例如OPN-a中的第159~161号残基)，识别该RGD序列的aV|33、aVpl和aV|35等整联蛋白是OPN的主要受体，其中，aV|33、aVpi和aV(35整联蛋白在血管的平滑肌细胞中经由细胞粘附、特别是aV(33参与巨噬细胞、淋巴细胞、内皮细胞和平滑肌细胞等的游走。目前的研究也表明OPN经由SVVYGLR序列(SEQIDNO.10)与a邓l、a邻l和a4p7整联蛋白结合，但发现了其中a邻l与未被凝血酶切割的OPN(非切割型OPN)和被凝血酶切割的N末端片段(切割型OPN)两者结合，而a邓l只与凝血酶切割型OPN结合这样的差异(非专利文献2~4)。该a9和a4、以及|31和卩7的整联亚单元相互之间的氨基酸序列间的类似性高。a4(31和a邻7整联蛋白主要在淋巴细胞和单核细胞中发现，而在嗜中性粒细胞中只有极少表达。另一方面，a9(31在嗜中性粒细胞中选择性高表达，经由VCAM-1或腱生蛋白-C(Tenascin-C)等在嗜中性粒细胞游走中担负着必须的功能。另外，a邓l在肌细胞或上皮细胞、肝细胞等中也广泛表达。这样，整联蛋白亚单元a4和a9的细胞质结构域分别经由有微妙不同的细胞内信号转导途径，互相协同地促进白细胞向炎症部位的游走和凝集，增强其浸润活性，由此参与各种炎症反应。这样，各种种类的整联蛋白均促进白细胞的游走，参与炎症反应，因此抑制这些整联蛋白活性的药物被认为潜在性地具有作为抗炎症药物的可能性。例如，整联蛋白aVp3在破骨细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞等中表达，通过抑制aVp3整联蛋白与其各种结合配体的结合，例如在关节中期待发挥抑制关节破坏的作用，因此可以实际进行抗aV(33抗体的开发。但是，属于整联蛋白家族的受体在广泛的組织内普遍表达，在维持生命活动中担负着必须的功能，因此，在类风湿性关节炎或变形性关节炎的治疗中使用整联蛋白的抗体，则在其它部位也有发生同样的抑制的可能性，可能产生副作用。由上述观点考虑，目前为止，已经明确了类风湿性关节炎、变形性关节病等的病因，尝试提供更优异的治疗方法。例如WO02/081522(专利文献l)中发现，风湿病患者和变形性关节病患者，关节腔液的OPN浓度显示高值，并且在风湿病患者中，凝血酶切割型N末端片段占全部OPN的比例增加，确认了OPN与这些疾病的发病有很深相关性。专利文献l中，对于用凝血酶切割OPN得到的N末端片段和C末端片段，制备将各片段分别区别识别的抗体，使用它们进行试验，发现在类风湿性关节炎患者中，特别是由凝血酶切割的N末端片段在关节腔内显示高浓度。该N末端片段中均存在人型整联蛋白可识别的RGD序列和SVVYGLR序列(SEQIDNO.IO)，确认同时阻断这两者序列的抗体可广泛抑制OPN与整联蛋白的结合，对于类风湿性关节炎或变形性关节炎等治疗有效。具体来说，专利文献l中制备了抑制人OPN的RGD序列与整联蛋白结合、以及人OPN的SVVYGLR序列(SEQIDNO.10)与整联蛋白结合的抗体，通过细胞粘附和细胞游走等的试验确认了其效果。并获得了小鼠OPN的该内部序列所对应的合成肽的抗体，使用小鼠的关节炎病态模型，确认了上述抗体作为治疗药的效果。即，小鼠OPN与人OPN在氨基酸序列上、在相同位置上具有可被小鼠的整联蛋白识别的RGD序列和SLAYGLR序列(SEQIDN0.12),因此，取得了M5抗体作为同时阻断这些序列的抗体。确认了该M5抗体与小鼠OPN及其凝血酶消化产物的结合被含有RGD序列的GRGDSP肽抑制，该M5抗体抑制由TNF-a活化的、来自小鼠脾脏的单核细胞的游走。在小鼠的颅骨器官培养系统中研究该M5抗体，观察到抑制骨破坏的作用。并且，在小鼠胶原关节炎模型中尝试给予上述抗体，确认显示明显的治疗效果(专利文献1和非专利文献5)。这些结果强烈显示同时阻断RGD序列与人型整联蛋白的结合、SVVYGLR序歹,j(SEQIDNO.10)与人型整联蛋白的结合的抗体可抑制OPN与整联蛋白的结合，对于类风湿性关节炎等的治疗有效，并且，不仅对于幼年型类风湿性关节炎或慢性风湿病等风湿病，也期待对于银屑病性关节炎或银屑病的治疗有效。器官移植后的慢性排斥的特征在于发生血管或支气管的阻塞性病变，从其组织学的研究来看，T细胞和巨噬细胞的活化引发细胞因子和生长因子的生成、血管内皮细胞障碍，并且血管平滑肌增殖引发纤维化等，因此使血管阻塞进展(非专利文献6~8)。已有报道称，这些巨噬细胞的活化或血管平滑肌的纤维化中，OPN作为必须的蛋白而发挥功能(非专利文献9)，OPN抑制抗体通过抑制单核细胞或嗜中性粒细胞的游走，可以抑制向上述纤维化发展的过程。因此，期待抑制器官移植后的慢性排斥反应，有助于器官的存活，也期待对于全身性自身免疫疾病、红斑狼疮、葡萄膜炎、白塞氏病、多发性肌炎、系膜增殖性肾小球肾炎、结节病等自身免疫疾病的治疗的效果。还确认了在各种癌症中OPN的表达量增加，OPN促进了癌症的进展和转移(非专利文献10~12)，通过抗OPN抗体癌细胞的增殖和转移得到抑制(专利文献3、非专利文献13)。因此，还期待抗OPN抗体对于各种癌症的治疗发挥作用。WO03/027151(专利文献2)中公开了具有专利文献1所述的小鼠抗人骨桥蛋白抗体2K1可变区和人抗体恒定区的嵌合抗人骨桥^"白抗体，以及具有2K1抗体的互补决定区和人抗体构架区以及恒定区的人源化抗人骨桥蛋白抗体。时至今日，作为癌症治疗用抗体(例如利妥昔单抗、曲妥单抗、贝伐单抗)、风湿病治疗用抗体(例如英夫利昔单抗、阿达木单抗)、用于抑制移植片排斥的治疗用抗体(例如莫罗单抗、巴利昔单抗)等^f艮多治疗用单克隆抗体已经上市。今后，单克隆抗体制剂由于其特异性和安全性高等的根本性特征，特别是以低分子治疗药的开发较为困难的各种疾病作为目标的研究开发将会得到加速。另一方面，上述抗体药物的开发中，最大的问题是抗体的生产性。目前市售的单克隆抗体的临床给药量大约为数mg/kg水平，因此需要相当大的制备成本。为此，在显示优异的活性的抗体、显示相同活性的抗体中选择表达量高、作为蛋白质的稳定性高的抗体，这在抗体药物应用化中是极重要的因素。专利文献1:国际公开第WO02/081522小册子专利文献2:国际公开第WO03/027151小册子7专利文献3:国际公开第WO06/043954小册子非专利文献1:Y.Saitoh等人.，(1995):LaboratoryInvestigation,72,55~63非专利文献2:Y.Yokosaki等人"(1999):TheJournalofBiologicalChemistry274,36328~36334非专利文献3:P.M.Green等人.，(2001):FEBSLetters503，75~79非专利文献4:S.T.Barry等人.，(2000):ExperimentalCellResearch258，342~351非专利文献5:Yamamoto等人.，(2003):TheJournalofClinicalInvestigation,112,181-188非专利文献6:P.Freese等人"(2001):Nephrology,dialysis,transplantation,16，2401~2406非专利文献7:j.r.Waller等人.，(2001):BritishJournalofSurgery,88,1429~1441非专利文献8:S.R.Lehtonen等人.，(2001):Transplantation,72，1138-1144非专利文献9:A.O，Regan等人.，(2000):InternationalJournalofExperimentalPathology,81,373~390非专利文献io:G.F.Weber,(2001):BiochimicaetBiophysicaActa,1552,61~85非专利文献ii:h.Rangaswami等人.，(2006):TRENDSinCellBiology16，79~87非专利文献12:S.S.Forootan等人"(2006):Int.J.Cancer:118，2255~2261非专利文献13:Z.Hu等人.，(2005):Clin.CancerRes.114646~4652
发明内容发明所要解决的课题本发明针对上述状况而设，要解决的课题在于提供比以往的抗人骨桥蛋白抗体的活性(抗原结合活性、白细胞游走抑制活性等)和/或稳定性(对热、低pH条件和改性剂的耐性等)优异的人源化抗人骨桥蛋白抗体。本发明人等为解决上述课题进行了深入的研究，结果，成功地制备了具有上述特性的人源化抗骨桥蛋白抗体。解决课题的方法即，本发明具有以下特征。(1)人源化抗人骨桥蛋白抗体，该抗体含有由SEQIDNO.l所示氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQIDN0.3所示氨基酸序列组成的轻链可变区。(2)上述(l)所述的人源化抗人骨桥蛋白抗体，其中，上述抗体的重链恒定区是人Igyl。(3)上述(l)所述的人源化抗人骨桥蛋白抗体，其中，上述抗体的轻链恒定区是人IgK。(4)上述(l)所述的人源化抗人骨桥蛋白抗体，其中，上述抗体的重链恒定区为人Igyl，上述抗体的轻链恒定区为人Ig/c。(5)人源化抗人骨桥蛋白抗体，该抗体含有由SEQIDNO.25所示氨基酸序列组成的重《连、和由SEQIDNO.27所示氨基酸序列组成的轻链。(6)多核苷酸，该多核苷酸含有编码上述(l)所述人源化抗人骨桥蛋白抗体的重链可变区的序列。(7)多核苷酸，该多核苷酸含有编码上述(l)所述人源化抗人骨桥蛋白抗体的轻链可变区的序列。(8)表达载体，该表达载体含有上述(6)和/或(7)所述多核苷酸。(9)宿主细胞，该宿主细胞中导入了上述(8)所述的表达载体。(10)生产人源化抗人骨桥蛋白抗体的方法，该方法包含培养上述(9)所述的宿主细胞，使该细胞表达人源化抗人骨桥蛋白抗体的步骤。(11)自身免疫疾病、风湿病、类风湿性关节炎或变形性关节病的治疗药，该药物含有上述(l)~(5)中任一项所述的人源化抗人骨桥蛋白抗体。(12)预防或治疗自身免疫疾病、风湿病、类风湿性关节炎或变形性关节病的方法，该方法包含给予治疗有效量的上述(1)(5)中任一项所述的人源化抗人骨桥蛋白抗体的步骤。(13)上述(1)(5)中任一项所述的人源化抗人骨桥蛋白抗体在制备用于预防或治疗自身免疫疾病、风湿病、类风湿性关节炎或变形性关节病的药物中的应用。发明效果本发明可提供比以往的抗人骨桥蛋白抗体的活性(抗原结合活性、白细胞游走抑制活性等)和/或稳定性(对热、低pH条件和改性剂的耐性等)优异的人源化抗人骨桥蛋白抗体。具有上述特征的本发明的抗体可用于以自身免疫疾病、风湿病、类风湿性关节炎、变形性关节病为代表的各种炎症性疾病的预防或治疗。附图简述图1表示含有插入到载体中的R2K1-VH1.7编码区的DNA石咸基序列(上一行SEQIDN0.15)和氨基酸序列(下一行SEQIDNO.16)(下划线部分是用于分泌表达的前导序列)。图2表示含有插入到载体中的R2K1-VH1.8编码区的DNA的碱基序列(上一行SEQIDN0.17)和氨基酸序列(下一行SEQIDNO.18)(下划线部分是用于分泌表达的前导序列)。图3表示含有插入到载体中的R2K1-VL1.7编码区的DNA的碱基序列(上一行SEQIDNO,19)和氨基酸序列(下一行SEQIDNO.20)(下划线部分是用于分泌表达的前导序列)。图4表示含有插入到载体中的R2K1-VL1.8编码区的DNA的碱基序列(上一行SEQIDN0.21)和氨基酸序列(下一行SEQIDNO.22)(下划线部分是用于分泌表达的前导序列)。图5表示通过ELISA法研究嵌合2K1抗体和人源化2K1抗体与10hOPN5肽的结合性的结果。图6表示通过ELISA法研究在70。C下加热处理的嵌合2K1抗体和人源化2K1抗体与hOPN5肽的结合性的结果。以未加热处理时的结合性为100%,表示其比例。图7表示通过ELISA法研究用pH5緩冲液处理的嵌合2K1抗体和人源化2K1抗体与hOPN5肽的结合性的结果。以未经pH5緩冲液处理时的结合性为100，表示其比例。图8表示对用含各种浓度的盐酸胍緩冲液处理的嵌合2K1抗体和人源化2K1抗体的焚光光谱中峰波长制图的结果。图9表示通过CD测定用各pH緩冲液处理的嵌合2K1抗体和人源化2K1抗体中随机结构的含量的结果。图10是表示使用超高灵敏度差示扫描量热仪研究嵌合2K1抗体和人源化2K1抗体的热稳定性的结果图。虚线箭头和实线箭头分别表示嵌合2K1抗体和R2Klvl.7抗体的Tm。图11表示R2Klvl.7和R2KlvO对人OPN的细胞粘附抑制效果。图12表示R2K1vl.7对于猴胶原诱导关节炎的关节肿胀的效果。数据分为对照组、25mg/kg组和50mg/kg组，分别表示8个动物、7个动物和5个动物的平均士SE。*p<0.05,**p<0.01:通过Dunnet多重比较;j全验确认与对照组明显不同。图13表示通过HPLC分析纯化R2Klvl.7-scFv的结果。图14表示通过ELISA法研究纯化R2Klvl.7-scFv与hOPN5肽的结合性的结果。图15表示完全分子型R2Klvl.7抗体、R2Klvl.7抗体的F(ab')2和纯化F(ab')2-PEG的SDS-PAGE结果。图16表示通过BIAcore研究R2Klvl.7的F(ab')-PEG与hOPN5肽的结合性的结果。实施发明的最佳方式ii以下详述本发明。本发明人等为了克服与上述以往的抗人骨桥蛋白抗体相关的课题而进行了深入的研究，结果成功的获得了与WO03/027151(专利文献2)所述的嵌合2K1抗体和人源化2K1抗体相比、具有优异的活性和/或稳定性的人源化抗人骨桥蛋白抗体。抗体分子的基本结构为所有类别(classes)所共有，由具有分子量5万~7万的重链和具有2-3万的轻链构成。重链通常由含有约440个氨基酸的多肽链组成，每类重链具有特征性结构，对应于IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，称为y、〃、a、5和e链。并且，IgG存在IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，分别称为yl、y2、y3和y4。轻链通常由含有约220个氨基酸的多肽链组成，已知有L型和K型两种，分别称为x和k链。抗体分子的基本结构中的肽构成是两条相同的重链和两条相同的轻链通过二硫键(S-S键)和非共价键结合，且分子量为15万-19万。两种轻链可以与任何重链形成对。各抗体总是由相同的两条轻链和相同的两条重链形成。链内S-S键是在重链中有4个—s链中有5个)，轻链中有2个，每100~IIO个氨基酸残基形成一个环，该立体结构在各环之间类似，称为结构单元或结构域。对于重链和轻链两者，其位于N末端的结构域尽管是同种动物的相同类(亚类)的指标，但其氨基酸序列不恒定，该结构域被称为可变区(V区，可变区)(各结构域分别表示为Vh和Vl)。由此向C末端一侧的氨基酸序列是在每类或亚类中大致恒定的、被称为恒定区(C区，恒定区)(各结构域分别表示为CH1、Ch2、Ch3和CL)。抗体的抗原决定部位由Vh和Vt构成，结合特异性由该部位的氨基酸序列确定。另一方面，与补体或各种细胞结合的生物学活性反映了各类Ig之间C区的结构差异。轻链和重链可变区的可变性大致限于在两种链中均存在的三个小的超可变区，将这些区称为CDR(互补决定区)。可变区的其余部分被称为构架区，该区是比较恒定的。通常，只有各可变区的互补决定区的5~IO个氨基酸形成抗原结合部位。本说明书中，将与抗原反应的可变区具有来自小鼠抗体(也称为供体异源抗体)的可变区、恒定区具有来自人抗体的恒定区的抗体称为嵌合抗体，将识别骨桥蛋白及其片段的嵌合抗体称为嵌合抗骨桥蛋白抗体。将除抗原特异性的非人哺乳动物(例如小鼠)抗体分子的互补决定区(抗原结合部位)以外全部置换为人抗体的氨基酸，所得重组抗体称为人源化抗体。人源化抗体也包含如本发明抗体的、在构架区附加有氨基酸修饰(置换、插入、缺失、附力O)而得到的抗体。通常认为在人源化抗体的制备中，当只是将互补决定区的氨基酸序列嫁接到作为模板的人抗体构架区时，很多情况下抗原结合活性比原始小鼠抗体降低。已经确认上述人源化2K1抗体虽然具有与OPN肽的结合性，但是与OPN的细胞粘附抑制活性极低，因此不适合作为抗体药物使用(后述实施例9)。本发明人等为了改善上述人源化抗体的活性降低、且为了获得适合作为抗体药物使用的具有更优异的稳定性的人源化抗体，进行了深入的研究，结果发现，含有由SEQIDNO.l所示氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQIDNO.3所示氨基酸序列组成的轻链可变区的人源化抗人骨桥蛋白抗体与以往的嵌合和人源化抗人骨桥蛋白抗体比较，具有显著改善的活性和/或各种稳定性指标方面具有优异的稳定性。上述本发明的人源化抗人骨桥蛋白抗体是在作为模板的人抗体的重链和轻链的构架区对几种氨基酸进行修饰而制备的。与只嫁接互补决定区而制备的以往的人源化抗人骨桥蛋白抗体相比，构架区的序列不同(专利文献2)。本发明的人源化抗人骨桥蛋白抗体可根据本说明书中所公开的其重链可变区和轻链可变区的序列信息，使用该领域所公知的方法，由本领域技术人员容易地制备。具体来说，可制备具有编码本发明的抗体的重链可变区氨基酸(SEQIDNO.l)的碱基序列的重链可变区基因片段、以及具有编码本发明的抗体的轻链可变区氨基酸(SEQIDN0.3)的碱基序列的轻链可变区基因片段。然后，将该可变区基因与人抗体的适当类别(class)的恒定区基因连接，来制备人源化抗体基因。接着，将该人源化抗体基因与适当的表达载体连接，导入到培养细胞中。最后，培养该培养细胞，由此可从培养上清中获得人源化抗体。编码上述本发明的抗体的重链或轻链可变区氨基酸(SEQIDNO.l和SEQIDN0.3)的各可变区基因片段例如可按照WO03/027151所述方法，如下制备制备分别编码该文献公开的人源化2K1抗体的重链可变区和轻链可变区的基因片段，将突变导入到编码人源化2K1抗体构架区的该基因片段的规定位点。为了将突变导入构架区规定位点可以采用位点定向i秀变法(CurrentProtocolsinMolecularBiologyedit.Ausubel等人.(1987)Publish.JhonWiley&SonsSection8.1~8.5)等本领域所公知的各种方法。或者本发明的抗体的重链和轻链可变区的基因片段也可以基于根据该重链和轻链可变区的氨基酸序列(SEQIDNO.l和SEQIDN0.3)而设计的碱基序列、或SEQIDNO.5和SEQIDN0.7所示的本发明的抗体的重链和轻链可变区的碱基序列，利用本领域所公知的基因合成方法进行合成。上述基因合成方法可以采用WO90/07861所述抗体基因的合成方法等本领域所公知的各种方法。接着，将上述可变区基因片段与人抗体的恒定区基因连接，来制备人源化抗体基因。尽管所使用的人抗体的恒定区可以选择任何亚类的恒定区，但重链恒定区可优选使用人Igyl,轻链恒定区可优选使用人IgK。制备该人源化抗体基因后，对于人源化抗体基因向表达载体的导入、表达载体向培养细胞的导入、培养细胞的培养、抗体的纯化等，可采用本领域所公知的各种方法，或者参照WO02/081522或WO03/027151所述的嵌合抗人骨桥蛋白抗体或人源化抗人骨桥蛋白抗体的制备方法进行。与上述得到的人源化抗体基因连接的表达载体可以使用国际公开公报WO94/20632所述的AG-yl或AG-k等表达载体，但对表达载体没有特别限定，只要可表达人源化抗体基因即可。表达载体如果利用AG-yl或AG-k等已经具有人Ig恒定区基因的载体，则只是将人源化抗体可变区基因插入其中，即可形成具有人源化抗体基因的表达载体，因此优选。上述表达载体例如可通过磷酸4丐法等导入到培养细胞中。要导入表达载体的培养细胞例如可使用CHO-DG44细胞等的培养细胞，可以按照常规方法进行培养。上述培养后，在培养上清中累积的抗体例如可通过使用蛋白A柱的各种色谱来纯化。上述得到的人源化抗人骨桥蛋白抗体的抗原活性例如可通过后述实施例所述的使用骨桥蛋白肽等的ELISA、或BIACore(BIACore公司)等测定。人源化抗人骨桥蛋白抗体的白细胞游走抑制活性例如如后述实施例所述，可以通过在受试抗体和OPN或凝血酶切割型OPN的存在下培养人末梢血单核细胞来测定。本发明的人源化抗人骨桥蛋白抗体具有抑制由细胞因子(例如TNF-a)活化的人末梢血单核细胞向凝血酶切割型OPN游走的生物学活性。接着，针对各种稳定性指标，对上述制备的人源化抗人骨桥蛋白抗体进行试验。本发明的人源化抗人骨桥蛋白抗体显示以下的稳定性指标(A)D)):A)热稳定性表现为与在PBS中、在70。C下加热处理2小时后时的90%以上。嵌合抗体相比，中点转变温度(midpointtransitiontemperature,Tm)至少高5°C。嵌合抗体相比，具有至少可以耐受高0.5M浓度的盐酸胍的耐性。嵌合抗体相比，具有至少可以耐受低0.3的pH的耐性。15这里，上述指标A)和B)均为热稳定性的指标，这些指标越好的抗体，其在长期保存稳定性和剂型方面越具有优势。即，抗体制剂由于是蛋白质，因此在保存稳定性方面有较多问题，而冻干制剂(在使用时必须溶解，因此在医疗现场、在便利性方面存在问题，特别是蛋白制剂溶解大多需要30秒以上，大多成为医疗现场较大的负担)，如果是具有良好的温度稳定性的抗体，则可以在溶液状态下可冷藏保持2年以上的长期稳定性。实际上，作为本发明的人源化抗人骨桥蛋白抗体的后述实施例所述的R2Klvl.7在室温(25。C)下可确保一年左右的稳定性。如果可以形成溶液制剂，则可以制成预灌封注射器等便利性更高的制剂。满足上述指标的、温度稳定性高的抗体其制剂化变化形式广，为实现医疗需求更高的制剂增添了更多的选择可能性。上述指标C)是关于盐耐性的指标，具有所述盐耐性的抗体可以在形成药物制剂时进行更为有利的处方研究。特别是在预灌封注射器中，在设计为100~200^g/mL的高浓度的蛋白制剂方面大多使用高的盐浓度，因此是有用的。上述指标D)是关于pH耐性的指标，具有上述pH耐性的抗体在抗体在抗体的制备纯化过程的病毒灭活步骤中，可以以更低的pH进行处理，因此是有用的。为此，与通常的抗体比较，即使具有低0.3左右的低pH耐性，也会成为很大的优势。指标A)的试验方法如下。首先，将受试人源化抗人骨桥蛋白抗体在PBS中稀释(优选50〃g/mL),并在70。C下加热处理2小时。然后将该稀释液恢复至室温，例如通过Kon等人的ELISA方法(JoumalofCellularBiology,88:420~432(2002))测定该抗体与含有SWYGLR序列(SEQIDNO.10)的肽的结合活性。该热处理的抗体的结合活性与对未热处理的相同抗体测定的结合活性进行比较。本发明的人源化抗人骨桥蛋白抗体，在上述加热处理时，显示与含有SVVYGLR序列(SEQIDNO.10)的肽的结合活性为未进行加热处理时的90%以上的结合活性。优选本指标试验中使用的含有SVVYGLR序列(SEQIDNO.10)的16肽是具有CVDTYDGRGDSVVYGLRS序列(SEQIDN0.13)的骨桥蛋白肽。指标B)的试验方法如下。首先，将受试人源化抗人骨桥蛋白抗体mM柠檬酸緩冲液+120mMNaCl(pH6.0))进行调节，通过差示扫描量热仪(优选MicroCal公司的VPcapillaryDSCplatform)可评价对加热的稳定性。表示本发明的人源化抗人骨桥蛋白抗体变性温度的中点转变温度(Tm)与C2K1比较，至少高5。C。指标C)的试验方法如下。首先，将受试人源化抗人骨桥蛋白抗体和上述嵌合2K1抗体(C2K1)溶解于含有0~5M各浓度盐酸胍的緩冲液(优选20mM磷酸钠+120mMNaCl溶液(pH7.0)),将溶液调整为适当的浓度(优选50,g/mL)。接着，将各溶液样品在l(TC下静置过夜，然后测定各样品的荧光光语。具体来说，在波长320nm370m的范围内对通过280nm的激发光使色氨酸产生的荧光进行扫描。峰波长由于盐酸胍导致的抗体蛋白立体结构的松散而发生位移。对受试抗体和嵌合抗体分别测定使峰波长发生位移的盐酸胍浓度。对于本发明的人源化抗人骨桥蛋白抗体，上述使峰波长发生位移的盐酸胍浓度与C2K1比较，至少约高0.5M浓度。指标D)的试验方法如下。首先，将受试人源化抗人骨桥蛋白抗体和上述嵌合2K1抗体(C2K1)用适当的緩冲液(优选20mM柠檬酸钠緩冲液+120mMNaCl(pH6.0))调节(优选2mg/mL)，向其中加入酸性溶液(优选0.1NHC1)和水，制备规定浓度(lmg/mL)的各低pH的样品。将该样品在室温下处理1小时，然后测定圆二色性(CD)光谱。在波长205nm~260nm的范围内测定CD光谱，根据Yang等人的CD光谱分析法(MethodsinEnzymology，130,208~269(1986)),对各抗体的各pH处理样品测定随机结构的含有率。对于本发明的人源化抗人骨桥蛋白抗体，随机结构的含有率开始升高的pH比C2K1至少低约0.3。本发明人等以WO03/027151所述人源化抗体为基础，将位点定向诱变等产生的构架区基因的修饰、与使用上述A)~D)的稳定性指标的稳定性试验组合，进行了深入的研究，结果，通过使人抗体支架部分(FRl-4)为SEQIDNO.l所示的氨基酸序歹'J(氨基酸编号分别为1~30、36~49、67~98和106~116)以及SEQIDN0.3所示的氨基断列(氨基酸编号分别为1~23、40~54、62-93和103-113),首次成功地获得了比以往的抗人骨桥蛋白抗体具有优异的活性(抗原结合活性、白细胞游走抑制活性等)和/或稳定性(对热、低pH条件、变性剂的耐性等)的人源化抗人骨桥蛋白抗体。对本发明的人源化抗人骨桥蛋白抗体的上述抗原结合活性、白细胞游走抑制活性和各种稳定性指标进行试验，结果发现，具有该活性，且显示该指标A)D)的所有的特性。含有由SEQIDNO.l所示氨基酸序列组成的重链可变区、以及由SEQIDN0.3所示氨基酸序列组成的轻链可变区的本发明的人源化抗人骨桥蛋白抗体可如下容易地获得使用本领域中公知的方法，合成编码SEQIDNO.l所示氨基酸序列的DNA、和编码SEQIDNO.3所示氨基酸序列的DNA，将它们与适当类别的人抗体恒定区基因、优选重链为人Ig丫l恒定区基因、轻链为人IgK恒定区基因连接，构建人源化抗体基因，采用本领域中公知的各种方法或WO02/081522或WO03/027151所述方法等，将该人源化抗体基因导入到表达载体中，将该表达载体导入培养细胞中，培养该培养细胞，由所得培养物中纯化抗体。将SEQIDNO.l所示重链可变区基因和人Igyl重链恒定区基因连接得到的本发明的优选的人源化抗体重链基因例如有含有编码SEQIDN0.25所示氨基断列的碱基序列的基因，更优选含有SEQIDNO.24所示的碱基序列的基因。将SEQIDNO.3所示的轻链可变区基因与人IgK轻链恒定区基因连接得到的本发明的优选的人源化抗体轻链基因例如有含有编码SEQIDNO.27所示氨基酸序列的石咸基序列的基因，更优选含有SEQIDNO.26所示石威基序列的基因。由含有SEQIDNO.24所示碱基序列的重链基因、和含有SEQIDNO.26所示18碱基序列的轻链基因所编码的本发明的人源化抗人骨桥蛋白抗体例如有后述实施例所示的R2Klvl.7。或者，含有由SEQIDNO.l所示氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQIDN0.3所示氨基酸序列组成的轻链可变区的本发明的人源化抗骨桥蛋白抗体还可以以编码上述SEQIDNO.1所示氨基酸序列的DNA和人抗体重链恒定区基因、以及编码SEQIDNO.3所示氨基酸序列的DNA和人抗体轻链恒定区基因为模板，使用无细胞转录/翻译体系进行合成。无细胞转录/翻译体系可以使用市售商品，也可以按照本身已知的方法，具体来说，大肠杆菌提取液可按照PrattJ.M.等人.，"TranscriptionandTranslation",HamesB.D.和HigginsS丄编辑.,IRLPress,Oxford179~209(1984)中所述的方法等制备。作为市售的细胞裂解物，来自大肠杆菌的例如有大肠杆菌S30提取系统(Promega公司制备)或RTS500Rapid翻译系统(Roche公司制备)等，来自兔网织红细胞的例如有兔网织红细胞裂解系统(Promega公司制备)等，来自小麦胚芽的例如有PROTEIOS顶(TOYOBO公司制备)等。其中，优选使用小麦胚芽裂解物。小麦胚芽裂解物的制备方法例如可采用JohnstonF.B.等人"Nature,179，160~161(1957)、或者EricksonA.H.等人.，Meth.Enzymol.,96，38~50(1996)等所述的方法。本发明也包含含有由SEQIDNO.l所示氨基酸序列组成的重链可变区、由SEQIDNO.3所示氨基酸序列组成的轻链可变区的、保有活性的单链可变区片段(scFv)、Fab、Fab'和F(ab')2等人源化抗人骨桥蛋白抗体片段。可在scFv的制备中使用的用于将重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)连接的接头只要可使本发明的抗体片段具有上述特性即可，没有特别限定，例如有含有GGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO,14)所示氨基酸序列的肽。本领域技术人员可以根据本发明制备该人源化抗人骨桥蛋白抗体或抗体片段与其它肽和蛋白质的融合抗体，和制备结合有修饰剂的修饰抗体。融合中使用的其它肽或蛋白质只要不使抗体19结合活性降低即可，没有特别限定，例如有人血清白蛋白，各种tag肽、人工螺旋基序肽、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S转移酶、各种毒素、可促进多聚体化的其它肽或蛋白质等。修饰中使用的修饰剂只要不使抗体结合活性降低即可，没有特别限定，例如有聚乙二醇、糖链、磷脂、脂质体、低分子化合物等。上述得到的本发明的人源化抗人骨桥蛋白抗体或保有起因于该抗体的活性的抗体片段、将该抗体或该抗体片段与肽或其它蛋白质融合而成的融合抗体、或者使该抗体或抗体片段与修饰剂结合而成的修饰抗体还可以根据需要进一步纯化，然后按照常规方法制成药物制剂，可用于类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎和慢性类风湿等风湿病、银屑病关节炎、银屑病等的治疗；抑制癌症和器官移植后的慢性排斥反应；以及变形性关节病、全身性自身免疫疾病、红斑狼疮、葡萄膜炎、白塞氏病、多发性肌炎、系膜增殖性肾小球肾炎和结节病等自身免疫疾病的治疗。本发明的人源化抗人骨桥蛋白抗体优选作为风湿病治疗药、自身免疫疾病治疗药、变形性关节病治疗药或类风湿性关节炎治疗药，更优选作为类风湿性关节炎治疗药使用。这些风湿病治疗药等的剂型的例子可以是注射剂、点滴剂等非肠道给药制剂，优选通过静脉内给药、皮下给药等进行给药(为自身免疫疾病治疗药时也可以按照该方法)。制成药物制剂时，在药学上可接受的范围内可以使用与这些剂型匹配的载体或添加剂。在上述制剂制备中，人源化抗人骨桥蛋白抗体的添加量根据患者的症状程度、年龄或所使用的制剂的剂型或重组OPN抑制抗体的结合效价等而不同，例如可以使用0.1mg/kg~100mg/kg左右。上述得到的本发明的治疗药是作为有效成分的人源化抗人骨桥蛋白抗体与OPN的RGD序列和SVVYGLR序列(SEQIDNO.10)牢固地结合，抑制OPN的该部分与整联蛋白的结合，结果可以抑制风湿20本发明的人源化抗人骨桥蛋白抗体不是与整联蛋白一侧、而是与OPN—侧特异性结合，因此，抑制整联蛋白的其它重要功能的可能性小，期待避免副作用的问题。此外，本发明的人源化抗人骨桥蛋白抗体还可用作类风湿性关节炎的诊断药。如前所述，在类风湿性关节炎患者的关节中，特别发现了高浓度的凝血酶切割的OPN的N末端片段。因此，使用该人源化抗人骨桥蛋白抗体测定检体中的OPN或其N末端片段的量，可对于类风湿性关节炎的诊断发挥作用。该方法可以利用放射性同位素免疫测定法(RIA法)、ELISA法(E.Engvall等人.，(1980):MethodsinEnzymol.,70,419~439)、荧光抗体法、噬菌斑法、点样法、凝集法、Ouchterlonymethod(乌赫特朗尼氏法)等常规免疫化学测定法中使用的各种方法("杂交瘤法和单克隆抗体"，抹式会社R&DPlanning发行，30—53页，1982年3月5曰)。尽管上述方法可根据各种角度适当选择，但从灵敏度、简便性等角度考虑优选ELISA法。更优选方法的例子是例如将本发明的人源化抗人骨桥蛋白抗体固定在载体上，对与本发明的人源化抗人骨桥蛋白抗体识别不同的OPN上的部位的抗体进行标记，由此可以检测OPN或其N末端片段，可以将其用作类风湿性关节炎的诊断药。在标记上述抗体时所使用的标记物可以是用于形成融合蛋白/肽的谷胱甘肽S-转移酶等蛋白质/肽，辣根过氧化物酶(以下称为"HRP")、碱性磷酸酶(以下称为"AP")等酶，异硫氰酸荧光素、罗丹明等荧光物质，32P、1251等放射性物质，和化学发光物质等修饰剂。关于OPN同工型的检测方法，例如可使用夹层法等本领域中公知的方法，更具体来说，可以通过使用与WO02/081522(专利文献2)本发明还提供编码本发明的抗体或其片段的基因、以及含有该基因的表达载体。本发明的表达载体只要是在原核细胞和/或真核细胞的各种宿主细胞中表达编码本发明的抗体或其片段的基因、可生成这些21多肽即可，没有特别限定。例如有质粒载体、病毒载体(例如腺病毒、反转录病毒)等。以及可与该基因功能性连接的启动子。作为使本发明的多肽在细菌中表达的启动子，当宿主为埃希氏杆菌属细菌时，例如有Trp启动子、lac启动子、rec启动子、XPL启动子、lpp启动子、tac启动子等。作为使本发明的抗体或其片段在酵母中表达的启动子，例如有PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子和ADH启动子，宿主为芽孢杆菌属细菌时，例如有SL01启动子、SP02启动子、penP启动子等。宿主为哺乳动物细胞等的真核细胞时，例如有来自SV40的启动子、反转录病毒的启动子、热激启动子等。宿主细胞使用细菌、特别是大肠杆菌时，本发明的载体可以进一步含有起始密码子、终止密码子、终止子区和可复制单元。宿主使用酵母、动物细胞或昆虫细胞时，本发明的表达载体可以含有起始密码子和终止密码子。此时，可以含有增强子序列、编码本发明的多肽的基因的5'—侧和3'—侧的非翻译区、剪接界、聚腺苷酸化位点、或可复制单元等。还可根据需要含有通常使用的选择标记(例如四环素、氨千青霉素、卡那霉素)。本发明还提供导入了本发明的基因的转化体。上述转化体例如可通过用本发明的表达载体转化宿主细胞来制备。转化体的制备所使用的宿主细胞只要适合上述表达载体、并可转化即可，没有特别限定，可例举本发明
技术领域：
中通常使用的天然细胞或人工建立的细胞系等各种细胞(例如细菌(埃希氏杆菌属细菌、芽孢杆菌属细菌)、酵母(酵母属、毕赤氏酵母属等)、动物细胞或昆虫细胞(例如Sf9)等)。转化可按照本身公知的方法进行。本发明还提供本发明的抗体或其片段的生成方法，该方法包含使本发明的基因在宿主细胞中表达，即，使用上述转化体。本发明的抗体或其片段的生成中，转化体可在营养培养基中培养。营养培养基优选含有转化体生长发育所必需的碳源、无机氮源或有机氮源。碳源例如有葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖等，无机氮源或有机氮源例如有铵盐类、硝酸盐类、氨基酸、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉膏、大豆粕、马铃薯提取液等。还可根据需要含有其它营养素(例如无^L盐(例如氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁)、维生素类、抗生素(例如四环素、新霉素、氨苄青霉素、卡那霉素等)等)。转化体的培养可按照本身公知的方法进行。培养条件例如温度、培养基的pH和培养时间可适当选择。例如，宿主为动物细胞时，培养基可以使用含有约5~20%胎牛血清的MEM培养基(Science,122巻，501页，1952)、DMEM培养基(Virology，8巻，396页，1959)、RPMI1640培养基(J.Am.Med.Assoc.,199巻，519页，1967)、199培养基(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，73巻，1页，1950)等。培养基的pH优选约为6~8,培养通常在约3040。C下进行约15-72小时，可以根据需要进行通气或搅拌。宿主为昆虫细胞时，例如有含胎牛血清的Grace's培养基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82巻，8404页，1985)等，其pH优选约5~8。培养通常在约2040。C下进行15~100小时，可以根据需要进行通气或搅拌。宿主为细菌、放线菌、酵母、丝状真菌时，例如含有上述营养源的液体培养基较为适当。优选pH为58的培养基。宿主为大肠杆菌时，优选的培养基可例举LB培养基、M9培养基(Miller等人.，Exp.Mol.Genet,ColdSpringHarborLaboratory,431页，1972)等。这种情况下，培养通常可以在1443。C下进行约3-24小时，根据需要可同时进行通气或搅拌。宿主为芽孢杆菌属细菌时，培养通常可以在30~40。C下进行约16~96小时，根据需要可同时进行通气或搅拌。宿主为酵母时，培养基例如有Burkholder，s极限培养基(Bostian,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77巻，4505页，1980),pH优选为5~8。培养通常在约20~35。C下进行约14~144小时，并且可以根据需要进行通气或搅拌。分离和纯化。分离和纯化的方法例如有盐析和溶剂沉淀法等利用溶解度差的方法；透析、超滤、凝胶过滤和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳等利用分子量差的方法；离子交换色傳和羟基磷灰石色语等利用电荷差的方法；亲和层析等利用特异性亲和性的方法；反相高效液相色谱等利用疏水性差异的方法；等电点聚焦电泳等利用等电点差的方法等。以上对于本发明的整体情况进行了描述，这里给出为了深化理解而参照的特定实施例，它们的目的只是例举，并不限定本发明的范围。实施例以下给出实施例。如无特别说明，涉及使用试剂盒等的部分是4安照所附说明书进行。(1.人源化2K1抗体的制备)本发明中，制备两种将国际公开公报WO2003/027151所述的来自小鼠的抗人骨桥蛋白抗体一2K1抗体进行人源化的人源化抗人骨桥蛋白抗体(以下称为人源化2K1抗体或R2K1抗体)。各人源化2K1抗体的制备大致按上述公报所述方法制备，因此以下才既略描述。首先，通过使用合成寡DNA的PCR，制备具有图1和图2所示碱基序列的、两种编码人源化抗OPN抗体的重链可变区(VHs)的DNA,和具有图3和图4所示石咸基序列的、两种编码人源化抗OPN抗体的轻链可变区(VLs)的DNA。在以下的记述中，为了将它们区另ij,将图1和图2所示人源化抗人OPN抗体VHs分别称为R2K1-VH1.7和R2K1-VH1.8。同样，将图3和图4所示的人源化抗人OPN抗体VLs分别称为R2K1-VL1.7和R2K1-VL1.8。接着，利用限制酶HindIII识别位点和Bamffl识别位点，将各编码上述人源化抗人OPN抗体VHs的DNA插入到含有人免疫球蛋白恒定区链的基因的表达载体AG-y1中，制备具有R2K1-VH1.7的重链的表达质粒、和具有R2K1-VH1.8的重链的表达质粒。同样，将24各编码上述人源化抗人OPN抗体VLs的DNA插入到含有人免疫球蛋白恒定区k链的基因的表达载体AG-k中，制备具有R2K1-VL1.8的轻链的表达质粒、和具有R2K1-VL1.7的轻链的表达质粒。这些表达质粒导入到大肠杆菌中，使其增殖，使用市售的质粒纯化试剂盒(QIAGEN公司)进行纯化。最后，将上述纯化表达质粒的各种组合，通过磷酸钓法转染CHO-DG44细胞，在含有Geneticin(Invitrogen公司)和透析型FCS(Invitrogen公司)的MEM培养基(Invitrogen公司)中选择细胞，由此得到表达两种人源化2K1抗体的细胞。即，可使由具有R2K1-VH1.8的重链和具有R2K1-VL1.8的轻链组成的人源化2K1抗体一R2Klv1.8抗体；由具有R2K1-VH1.7的重链和具有R2K1-VL1.7的轻链组成的人源化2K1抗体一R2Klvl.7抗体表达。将按照上述顺序得到的各R2K1抗体生成细胞在添加有进行了10%透析型FCS的MEM培养基中充分增殖，接种于细胞培养滚瓶(BDBiosciences公司)中，在37。C、1rpm转速的条件下进行培养。数曰后，确认细胞贴附于器壁并增殖，舍去培养液，更换为500mL不含有血清的MEM培养基，并在上述条件下培养细胞。约2周后，在由器壁剥离并悬浮的细胞增多时结束培养，将培养上清用0.22/mi的滤器过滤并回收，由此得到含有各R2K1抗体的培养上清。以这些培养上清为起始材料，使用蛋白A柱(MILLIPORE公司)和阳离子交换柱(Amersham公司)，得到了各数mg的两种纯化人源化抗体，即R2Klvl.8抗体和R2Klvl.7抗体。在以下所述各种试验中，使用上述得到的纯化抗体。嵌合2K1抗体(以下也称为C2K1抗体)使用按照上述国际公开公报WO2003/027151所述方法获得的抗体。(2.通过ELISA确认与人骨桥蛋白肽的结合性)参考Kon等人的ELISA法(JournalofCellularBiology,88:420~25432(2002)),对各R2K1抗体和CZK1抗体与人骨桥蛋白肽(CVDTYDGRGDSVVYGLRS:SEQIDN0.13)的结合活性进行比较。以下概略描述。学社)与导入了马来酰亚氨基的BSA反应，制备hOPN5-BSA螯合物。将hOPN5-BSA螯合物以200ng/100/^L/孔在4°C下、在ELISA板(Nunc公司)中固定一夜，洗板，然后用添加了1。/。BSA的PBS在4。C下封闭过夜。将用添加1%BSA的PBS稀释的抗体样品以100//L/孔添加到上述板中，在37。C下反应1小时。检测是使用过氧化物酶(HRP)标记抗人IgG(H+L)抗体(和光純药林式会社制备)进行。使用酶标仪(MolecularDevices<^司)测定波长450nm的p及光度。结果证实，R2Klvl.7抗体和R2Klvl.8抗体与hOPN5肽的结合性与C2K1抗体同等(图5)。(3.R2K1抗体对人末梢血单核细胞游走的抑制活性)进行研究。首先，将对健康人肝素采血得到的血液用RPMI1640培养基稀释2倍。将稀释的血液铺于Ficoll-Paque(Pharmacia公司)中，以400xg下在室温下离心30分钟。回收在血浆和Ficoll-Paque交界所见到的白色层，作为单核细胞使用。将这样得到的单核细胞用人TNF-a(20ng/mL)进行过夜培养和活化，将活化后的细胞用于游走试验。游走试验是使用48孔微型化学趋化室装置(microchemotaxischamber,NeuroProbeInc公司)进行。将人OPN与牛凝血酶(Sigma)一起在37。C下反应2小时，进行切割。将以各种浓度添加R2K1抗体和C2K1抗体而得到的混合液预先在37。C下;^置15分钟，然后加入到下侧房室中(人OPN终浓度为10^g/mL)。在其上放置聚碳酸酯滤器(孔径5/mi),再向上侧房室中加入50〃L细胞悬浮液(2x106个细胞26/mL)。在37。C、5%(302存在下培养2小时，然后取下聚碳酸酯滤器，除去上侧滤器表面的细胞，然后将细胞用Diff-Quick(Baxter公司)染色。以40倍的放大倍率下计测上侧滤器表面的细胞数，结果以6孔的平均细胞数(细胞/mm"士SEM表示(表1)。这些结果显示，R2Klvl.7抗体和R2Klvl.8抗体两者与C2K1抗体同样，抑制了由TNF-a活化的人末梢血单核细胞向凝血酶切割型人骨桥蛋白的游走。R2Klvl.7和R2Klvl.8<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>(4.通过ELISA评价热稳定性)将C2K1抗体和两种R2K1抗体用PBS稀释为50〃g/mL，在70°C的水浴下进行2小时处理，然后恢复至室温，通过上述ELISA,将所得的吸光度与未处理样品的吸光度的比例作为残留活性制成图表表示。残留活性使用具有直线性的0.2~2.0范围内的吸光度的值计算(以下相同)。结果表明，上述处理后的残留活性中，R2Klvl.7抗体和R2Klvl.8抗体比C2K1抗体高(图6)。特别是R2Klv1.7抗体显示超过卯％的残留活性。由此可以判断，R2Klvl.7抗体和R2Klvl,8抗体与27C2K1抗体相比，热稳定性提高。(5.通过ELISA评价低pH耐性)将C2K1抗体和两种R2K1抗体的纯化品用PBS稀释为50^g/mL。使用1NHC1和pH计(HORIBA公司)将各稀释剂调节至pH5，在25。C下处理2小时。然后用1MTris-HCl(pH9.5)将各稀释剂调节至pH7，进行上述ELISA,将所得吸光度与未处理样品的吸光度的比例作为残留活性制成图表表示。结果发现，上述处理后的残留活性中，R2Klvl.7抗体比C2K1抗体和R2Klvl.8抗体显著高(图7)。由此表明，R2Klvl.7抗体与R2Klvl.8抗体和C2K1抗体相比，对低pH的耐性提高。(6.通过荧光光谱测定来评价盐酸胍耐性)将C2K1抗体和两种R2K1抗体用含有各浓度的盐酸胍的20mM磷酸钠緩冲液+120mMNaCl(pH7)调节至50〃g/mL(对照未添加盐酸胍)，在10。C下静置过夜，然后测定各样品的荧光光谱。荧光光谱的测定使用FP-6500荧光分光计(JASCO公司)进行。使用光路长3mm的比色皿(cell),在波长320nm~370nm的范围内对由280nm的激发光产生色氨酸发出的荧光进行扫描。在抗体间比较盐酸胍浓度和峰波长之间的关系。结果，对于C2K1，从盐酸胍浓度超过1M的时间点，对于R2Klv1.8，从超过2M的时间点，可观察到由于蛋白立体结构松散而产生的峰波长的位移，而对于R2Klv1.7，直至3.8M也未有峰波长位移(图8)。由此表明，R2Klvl.7抗体与R2Klvl.8抗体和C2Kl抗体比较，对盐酸胍的耐性提高。(7.通过CD评价低pH耐性)将C2K1抗体和R2Klvl.7抗体用20mM柠檬酸緩冲液+120mMNaCl(pH6)调节至2mg/mL。向其中边加入0.1NHC1和蒸馏水边制备具有抗体浓度为1mg/mL的各pH水准的样品，在室温下处理1小时后测定各样品的CD光谱。28CD(圆二色性)的测定使用J-820分光偏振计(JASCO公司)进行。使用光路长O.lmm的比色皿，测定波长205nm~260nm范围内CD光谱。光谱的分析使用基于Yang等人的CD光谱分析法(MethodsinEnzymology,130,208~269(1986))制造的JWSSE-480型蛋白质二次结构分析程序(JASCO公司)。在抗体间比较本方法中计算的随机结构的含有率与处理pH之间的关系。结果表明，对于C2K1抗体，由pH3可见随机结构含有率的升高，而对于R2Klv1.7，直至pH2.7也未见随机结构的升高(图9)。由此确认，R2Klvl.7抗体与C2K1抗体相比，具有低0.3的pH耐性。(8.通过差示扫描量热仪评价热稳定性)将C2K1抗体和R2Klvl.7抗体以1mg/mL的浓度溶解于20mM柠檬酸緩冲液+120mMNaCl(pH6.0)緩冲液中，使用MicroCal公司的超高灵敏度差示扫描量热仪(VPcapillaryDSCplatform)研究热稳定性。结果如图10所示。表示高级结构变性温度的中点转变温度(Tm)在C2K1抗体中是76.0°C，而在R2Klvl.7抗体中是82.8°C，确认升高约6。C。由此表明，R2Klvl.7抗体的热稳定性显著提高。(9.R2Klvl.7对OPN的细胞粘附抑制效果)为了比较本申请发明的R2Klvl.7和公知的人源化抗OPN抗体(参照WO03/027151,以下称为R2KlvO)的药理效果，研究了这两种抗体对人OPN的细胞粘附抑制效果。1.细胞的培养和继代JurkatE6.1细胞购自大日本制药(抹)，使用RPMI1640(10%FCS、青霉素-链霉素)进行继代和培养。2.试剂的制备粘附緩冲液(L-15培养基、1%BSA、50mMHEPES、pH7.4)PMA溶液(粘附緩冲液中含有40ng/mL12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)[SIGMA])29CV染色液(0.5。/。结晶紫、1%曱酰胺、20%曱醇)GST溶液(PBS(-)中含有5^g/mL谷胱甘肽S-转移酶(GST)[SIGMA])人IgG,溶液(PBS(-)中含有400pg/mL)[CALBIOCHEM]3.凝血酶切割型人N末端骨桥蛋白(OPN)的制备GST融合凝血酶切割型人N末端OPN(GST-人N-OPN，1.6mg/mL)如WO02/081522中记载的方法进行制备，用PBS(-)稀释为5^g/mL后，用于试验。4.受试药物的制备将R2Klvl.7(18.6mg/mL)和R2KlvO(4.39mg/mL)用PBS(-)稀释为4、12、40、120和400(wg/mL)，各稀释液均添加人IgGP使总蛋白质浓度为400:g/mL。5.组构成空白组(GST)对照组受试药物组R2Klvl.7(1、3、10、30、lOO^wg/mL)R2Klv0(1、3、10、30、濯^g/mL)6.细胞粘附试验将25pLGST-人N-OPN溶液添加到96孔微孔板的除外空白的所有的孔中，空白组是添加25;wLGST溶液，将该微孔板在37。C下温育1小时，然后用PBS(-)清洗2次。添加50〃LPMA溶液，将该微孔板在37。C下温育30分钟，然后添加25pL受试药物溶液(受试药物组)或人IgG,溶液(空白组和对照组)。JurkatE6.1细胞悬浮于粘附緩冲液中，使浓度为2xl(^个细胞/mL，所有孔中均添加25^L。将悬浮液以15xg离心1分钟，使细胞沉淀于板的底部，然后在37。C下培养1小时。反应结束后，将板倒转，以47xg离心2分钟，除去上清(非粘附细胞)。粘附细胞数的定量是添加25;uLCV染色液，将该微孔板在室温下放置10分钟，对细胞染色并固定，然后将该微孔板用纯水洗330次。在所有的孔中加入251。/。Triton-X100溶液，确认细胞溶解，然后用酶标仪(SPECTRAmax250，MolecularDevices)测定吸光度(测定波长595nm)。7.分析试验是每组使用5个孔。计算各组吸光度的平均值和抑制率，计算IC50值(抑制率为50%时的受试药物浓度)。抑制率是以空白组为100%，对照组为0%。IC50值如下计算绘制X轴以对数表示受试药物浓度，Y轴表示抑制率的图表，通过最小二乘法代入直线回归方程式进行计算。IC50值的计算使用在用量反应中显示直线性的受试药物浓度的数据。由图11所示的结果可以理解公知的人源化抗人OPN抗体的细胞粘附抑制效果极低，而R2Klvl.7具有优异的细胞粘附抑制效果(IC50值6.4)。(10.R2Klvl.7在食蟹猴中对于胶原诱导关节炎的效果)将用弗氏完全佐剂(BectonDickinsonandCompany)乳液化的牛II型胶原(胶原技术研修会)在给药36日前免疫雌性食蟹猴的背部和尾部，在给药15天前加强免疫。根据与免疫前进行比较的体重和近侧指间关节椭圓面积的变化率，将动物随机分成三组给药治疗组(『10)。将25mg/kg或50mg/kg用量的R2Klvl.7或溶剂对照组按每周1次、共8次通过静脉内注入给药。以最初给药日规定为第0天。给药期间的第0、6、13、20、27、34、41、48和55天，监控近侧指间关节椭圆面积作为关节肿胀的体征。用游标卡尺测定前后肢近侧指间关节的短轴和长轴，计算椭圆面积，用16个指的椭圆面积的平均值作为近侧指间关节椭圆面积。以给药前的值为100，计算近侧指间关节椭圆面积的变化率。第0天以及第6、13、20、27、34、41、48和55天(给药6天后)采集血浆，测定R2Klvl.7和抗R2Klvl.7抗体。该测定的R2Klvl.7的血浆浓度与波谷水平对应。数据分析是在删除抗R2Klvl.7抗体阳性动物和试验期间死亡的动物的数据后进行。在25mg/kg用量R2Klvl.7组的1只动物、以及50mg/kg用量R2Klvl.7组的4只动物中产生了抗R2Klvl.7抗体。溶剂对照组的2只动物、25mg/kg用量R2Klvl.7组的2只动物以及50mg/kg用量R2Klvl.7组的1只动物在给药后死亡。死亡例可能是由于剧烈炎症导致的衰竭而死亡。50mg/kgR2Klvl.7的治疗中，与对照溶剂组比寿交，在第27天~第55天期间，通过近侧指间关节椭圆面积的变化率测定的足肿胀显著减少(图l2)。25mg/kg用量R2Klvl.7对于近侧指间关节椭圓面积的变化未显示显著效果。25mg/kg用量和50mg/kg用量的血浆中R2Klvl.7波谷浓度分别为38.41~76.13Ag/mL和73.91~125.3^g/mL。人OPN的SVVYGLR序列与猴OPN的相应序列(SVAYGLR)(SEQIDNO.ll)不同，R2Klvl.7与该人OPN肽的结合亲和性比对应的对猴OPN肽的结合亲和性高100倍以上。考虑到这些发现，推定在关节炎治疗中，R2Klvl.7的有效血浆浓度为100〃g/mL以下。(11.R2Klvl.7的scFv的制备)以上述具有R2K1-VH1.7的重链表达质粒和具有R2K1-VL1.7的轻链表达质粒作为模板，通过PCR制备编码具有VH1.7-接头-VL1.7(接头是编码GGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDN0.14)所示氨基酸序列的碱基序列)结构的单链可变区片段(scFv)的DNA片段。该DNA片段的末端附加有限制酶Sfil和Notl的识别序列。将该DNA片段用限制酶Sfil和Notl消化，插入到同样用Sfil和Notl消化的pCANTAB5E载体(Marks,J.D等人，J.Mol.Biol.,222巻，581~97页,1991)的Sfil位点和Notl位点，由此制备R2K1-VH1.7的scFv表达质粒。该表达质粒中，scFv的编码区的下游附加有编码E-Tag的碱基序列。按照常规方法，将该质粒导入大肠杆菌HB2151抹，接种于SOBAG琼脂板(含2%葡萄糖和100〃g/mL氨苄青霉素的SOB板)，得到转化克隆。由所得克隆提取质粒DNA，通过以该质粒DNA为模板的DNA,咸基序列分析确认scFv的编码区的序列。DNA碱基序列分析是使用32DTCS-QuickStart试剂盒和CEQ2000XLDNA分析系统(两者均为BeckmanCoulter公司)。所得碱基序列如SEQIDN0.9所示。确认了碱基序列的大肠杆菌克隆在含有2%葡萄糖和100^g/mL氨苄青霉素的2xYT培养基中培养后，将其一部分悬浮于加入了1mMIPTG和100〃g/mL氨千青霉素的2xYT培养基中，再培养过夜，进行scFv的表达诱导。培养结束后，通过离心回收细胞，悬浮于含有1mMEDTA的PBS中，在冰上放置30分钟。接着将悬浮液以10,000rpm离心15分钟，回收上清，用0.45^m的滤器过滤，由此得到含有scFv的周质组分。通过使用抗E-Tag抗体的亲和层析，由该周质组分中纯化R2Klvl.7的scFv(以下称为R2Klvl.7-scFv)。对于上述制备的R2Klvl.7-scFv进行凝胶过滤层析，结果由图13所示的分离图谱中确认，几乎均为单体。(12.确认R2Klvl.7-scFv与人骨桥蛋白肽的结合性)通过ELISA法测定纯化的R2Klvl.7-scFv与hOPN5肽的结合活性。方法大致如前所述，在本测定中，使用HRP标记抗E-Tag抗体作为标记抗体。结果如图14所示。确认纯化的R2Klvl.7-scFv未与阴性对照的BSA结合，而与hOPN5肽特异性结合。(13.聚乙二醇修饰抗体片段的制备)按照常规方法，对R2Klvl.7抗体进行胃蛋白酶处理，然后使用蛋白GHP柱(两者均为AmershamBiosciences公司)和Hiprep16/60SephacrylS-200HighResolution柱(AmershamBiosciences公司),4寻到纯化F(ab')2。接着，用0.1MDTT对纯化F(ab')2进行还原处理，活化石危醇基，然后进4亍4吏用SephadexG-25才主(AmershamBiosciences公司)的凝胶过滤，除去DTT。将这样得到的Fab，与马来酰亚胺化聚乙二醇SUNBRIGHTME-120MA(日本油月旨)按照摩尔比1:10混合，在4。C下静置过夜，进行偶联反应。添加碘乙酰胺(NacalaiTesque),终止偶联33反应，然后通过使用Hiprep16/60SephacrylS-200HighResolution柱的凝胶过滤，得到聚乙二醇修饰的F(ab')2(以下可记为F(ab')2-PEG)。该SDS-PAGE的结果如图15所示。通过与作为比较对照的、电泳的未修饰F(ab')2进行比较，可以确认通过聚乙二醇修饰导致分子量增力口。(14.确认F(ab')2-PEG与骨桥蛋白肽的结合活性)使用表面等离子共振测定法确认纯化R2Klv1.7的F(ab')2-PEG与hOPN5肽的结合活性。将生物素化hOPN5肽固定在SensorChipSA(BIAcore公司)上，使用用HBS-EP緩冲液(BIAcore公司)预先稀释为5Z^g/mL的F(ab')2-PEG确认结合活性，结果如图16所示。由信号的升高，可确认本F(ab')2-PGE与hOPN5肽的结合活性与R2Klvl.7相同。产业实用性本发明的人源化抗人骨桥蛋白抗体的活性(抗原结合活性、白细胞游走抑制活性等)和/或稳定性(对热、低pH条件和改性剂的耐性等)优异，因此在以自身免疫疾病、风湿病、类风湿性关节炎和变形性关节病为代表的各种炎症性疾病的预防或治疗中，比起以往的抗人骨桥蛋白抗体可作为更为有效的药物。虽然本发明强调、说明了优选方式，但优选的方式也可以变更，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。本发明可以按照本说明书详述以外的方法实施。因此，本发明包含在所附"权利要求书"的要旨和范围内所包含的所有的变更。本申请是以在日本国申请的特愿2006-152892为基础，其中所公开的内容均包含在本说明书中。这里所述的包含专利或专利申请说明等程度地引入到本说明书中。3权利要求1.人源化抗人骨桥蛋白抗体，该抗体含有由SEQIDNO.1所示氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQIDNO.3所示氨基酸序列组成的轻链可变区。2.权利要求1所述的人源化抗人骨桥蛋白抗体，其中，上述抗体的重链恒定区是人IgYl。3.权利要求1所述的人源化抗人骨桥蛋白抗体，其中，上述抗体的轻链恒定区是人IgK。4.权利要求1所述的人源化抗人骨桥蛋白抗体，其中，上述抗体的重链恒定区为人Igyl，上述抗体的轻链恒定区为人IgK。5.人源化抗人骨桥蛋白抗体，该抗体含有由SEQIDNO.25所示氨基酸序列组成的重链、和由SEQIDNO.27所示氨基酸序列组成的轻链。6.多核苷酸，该多核苷酸含有编码权利要求1所述人源化抗人骨桥蛋白抗体的重链可变区的序列。7.多核苷酸，该多核苷酸含有编码权利要求1所述人源化抗人骨桥蛋白抗体的轻链可变区的序列。8.表达载体，该表达载体含有权利要求6和/或7所述多核苷酸。9.宿主细胞，该宿主细胞中导入了权利要求8所述的表达载体。10.生产人源化抗人骨桥蛋白抗体的方法，该方法包含培养权利要求9所述的宿主细胞，使该细胞表达人源化抗人骨桥蛋白抗体的步骤。11.自身免疫疾病、风湿病、类风湿性关节炎或变形性关节病的治疗药，该药物含有权利要求1-5中任一项所述的人源化抗人骨桥蛋白抗体。12.用于预防或治疗自身免疫疾病、风湿病、类风湿性关节炎或变形性关节病的方法，该方法包含给予治疗有效量的权利要求1~5中任一项所述的人源化抗人骨桥蛋白抗体的步骤。13.权利要求1~5中任一项所述的人源化抗人骨桥蛋白抗体在制备用于预防或治疗自身免疫疾病、风湿病、类风湿性关节炎或变形性关节病的药物中的应用。全文摘要本发明提供比以往的抗人骨桥蛋白抗体活性(抗原结合活性、白细胞游走抑制活性等)和/或稳定性(对热、低酸性条件和改性剂的耐性等)优异的人源化抗人骨桥蛋白抗体。文档编号C12N15/09GK101495632SQ20078002856公开日2009年7月29日申请日期2007年5月30日优先权日2006年5月31日发明者中岛敏博,山本宣哉,樋口浩文,酒井文彦,鸟饲正治申请人:安斯泰来制药有限公司;财团法人化学及血清疗法研究所