专利名称：基于积分球增强光散射检测技术的均相亲和分析新方法
技术领域：
本发明意在用荧光分光光度计等测量光致发光信号的仪器，通过本身为多活性位点的生 物分子或所制备的多活性位点加合物，与带强散射能力或能产生荧光共振能量转移效应的生 色团所标记的对应生物活性成分相结合，生成有强散射能力或荧光共振能量转移效应的非共 价产物复合物(团聚物)，联用积分球增强发光信号测量比例的光信号检测技术，建立一种不 需分离出产物复合物的均相亲和分析新方法，可用于免疫分析和配体类药物的离体筛选。
本发明所述方法是一种表征单活性位点或多活性位点生物分子同其它生物活性成分相互 作用的通用方法。生物分子所含活性位点的数目取决于与其发生相互作用生物活性成分的结 合性质。通常单一肽链蛋白也可有多个不同的抗原决定簇。当用针对特定抗原决定簇的单抗 与蛋白抗原结合时，单一肽链蛋白大多为单活性位点的生物分子；当用多克隆抗体或多个单 抗与之结合时，单一肽链蛋白也可成为多活性位点的生物分子；而基本没有对称性的简单小 分子半抗原或配体类药物，通常为单活性位点的生物分子。
背景技术：
生物活性分子可通过非共价键相互作用特异结合成非共价产物复合物。只要生物分子之 间结合的亲和力足够高，反应达到平衡后，相互结合成分量的变化也有明确的化学计量关系。 因此，利用这类高选择性结合反应，可测定混合物中生物活性成分的含量或生物分子之间相 互作用的亲和力，此即亲和分析，其典型代表是免疫分析和配体类药物的离体筛选。
在亲合分析的结合反应过程中，物质都没有共价键的变化，通常难测量吸收、荧光等信 号的变化确定所生成的非共价产物复合物量。为了便于用常用仪器测量所生成的非共价产物 复合物或未结合成分的量，常需将亲和分析中的待测成分标准品或与其结合的对应生物活性 成分，用带有便于检测信号的物质(如放射性同位素或酶)进行标记，然后通过测定非共价产 物复合物中或剩余的未结合成分中的标记信号强度，直接或间接确定非共价产物复合物的量。
但采用这类对结合反应中的某个成分进行标记的策略面临一个问题如何选择性测定未 结合的带标记成分量或产物复合物量。解决此问题的最简单策略是将非共价产物复合物从反 应混合物中分离出来后再定量。因此，使用这类标记亲和分析方法，按是否需分离出非共价 产物复合物再定量，分成非均相亲和分析和均相亲和分析两种。非均相亲和分析需分离出产 物复合物再定量，而均相亲和分析则不需分离出非共价产物复合物就可直接定量。均相亲和 分析方法效率更高、干扰更少、操作更简便，对于免疫分析和配体药物离体筛选更有价值。 但均相亲和分析方法很难建立，目前实用的亲和分析技术主要是采用标记的非均相亲和分析 方法。另外，按照分析策略的差异，使用标记的亲和分析又分成直接亲合分析和竞争性亲合 分析。直接亲合分析用带标记的过量生物活性成分与待测成分反应，达到平衡后分离出非共
价产物复合物或未结合的带标记成分进行定量。竞争性亲合分析中，将待测成分的标准品用 适当方法进行标记后，将设定量的被标记标准品与待测样品混匀后竞争结合对应的生物活性 成分，达到平衡后将非共价产物复合物与未结合的被标记标准品尽可能完全地分离后再进行 定量。现有亲和分析方法都依赖于这两种策略表征生物分子之间的相互作用。
只有直接测定亲和分析反应混合物中的非共价产物复合物的量或剩余未结合生物活性成 分量，才能建立均相亲和分析方法。现有常用测量技术中，能满足此要求的主要有两种方法 光散射检测技术和荧光共振能量转移技术。
光散射是指体系中的颗粒在激发光照射下，在颗粒周围除了激发光传播方向以外都能检 测到光信号的现象。体积越大的颗粒对激发光的散射作用越强。在亲合分析的结合反应过程 中，所生成的非共价产物复合物的体积都比未结合成分的体积大，故随着亲和分析反应体系 中非共价产物复合物的生成，反应体系的光散射信号就会增高。所以，基于光散射检测技术 可建立均相亲和分析方法，其代表是免疫比浊法。但是，现有免疫比浊法灵敏度低，局限于 测定细菌等体积较大的物质，还不能成为一种通用的均相亲和分析方法。
要利用光散射检测技术建立通用性的均相亲和分析方法，就必须在亲和分析的反应过程 中，显著增加所生成的非共价产物复合物与未结合成分的光散射能力差异。影响颗粒光散射 能力的主要因素是散射颗粒的体积和其内部所含生色团之间的相互作用。因此，需采用特殊 策略促进亲和分析反应体系生成体积比未结合成分更大的非共价产物复合物(散射颗粒)，并 促进产物复合物中生色团发生强相互作用，才能用光散射检测技术建立均相亲和分析新方法。 本发明用多活性位点生物分子同带强散射能力生色团标记的对应生物活性成分结合成大体积
的非共价产物团聚物(用如图la所示Sigma-Aldrich公司销售的Dendrimer412368-5G交联含
活化羧基的生物活性分子，则得到如图lb所示的多活性位点共价加合物；用结构如图lb所 示多活性位点共价加合物同带强生色团标记的对应生物活性成分结合，则丰成结构如图2所 示非共价产物复合物)；而且，此非共价产物团聚物内部因生色团之间空间距离缩短，可促进 有强散射能力的标记生色团之间可发生强相互作用，进一步增强产物团聚物的光散射能力。 这些特殊策略从优化产物复合物光散射能力内因的角度，促进用光散射检测技术建立通用性 均相亲和分析方法。
在激发光照射下，颗粒的光散射信号是三维空间分布的。采用本发明所述积分球(图3， 以下所述积分球及圆柱形流式样品管设计参数均与Shimadzu RF-540荧光分光光度计匹配) 汇聚三维空间的光散射信号，肯定能显著提高光散射信号的测量比例。这是因为测量光散射 信号常用的荧光分光光度计等仪器，通常只测定与激发光成直角处的光散射信号，使得来自 颗粒的绝大部分光散射信号没有被测量(图4)。以Shimadzu RF-540荧光分光光度计为例，本 发明所述积分球增强光散射信号测量比例的机制可简述如下。Shimadzu RF-540荧光分光光度 计检测窗口的直径约3.0 cm。假定检测器由二极管阵列构成，每个二极管检测点相当于放置 在积分球表面的一个点；通过相当于检测器窗口平面内所有二极管的光信号加和为所检测的 信号总量。假定光散射信号分布以积分球中心到检测窗口中心的距离为半径的球面，这样， 检测窗口沿着与球心的连线在发光信号分布球面的最大投影对应的球面积代表了可检测信号 的当量面积。假定光散射信号在空间是均匀分布。那么，对于半径为3cm的积分球，通过积 分球汇聚和导向光信号用于检测有望将测量比例提高到10倍以上(图4，激发光信号分布球 面的表面积大于4x兀x3x3 cm2，检测窗口投影对应面积约为7txl.5xl.5，比值为16倍)。另一 方面，光散射信号在空间的分布是很不均匀的，其信号在光散射与激发光夹角接近90°时最弱， 而夹角偏离90。后光散射信号逐渐增强，到接近0°或用180。处可增加近10倍(J Am Chem Soc, 2005; 127:12115-12121)。据此文献的数据估算，在光散射与激发光夹角为90。附近检测到的光 散射信号强度总量，只有全部光散射信号强度总量的5%左右。因此，综合上述两方面的因 素，用积分球汇聚三维空间的散射信号用于检测，其测量比例比不用积分球时肯定可远高于 10倍。因此，使用积分球汇聚光散射信号用于测量就是从优化信号测量外因的角度提高光散 射的测量比例，促进将光散射检测技术用于建立通用性的均相亲和分析新方法。
此外，荧光共振能量转移技术已用于均相亲和分析，但其都需要把作为供体和接受体的 荧光生色团分别标记在能与待测生物活性成分结合的不同生物活性成分上。例如，将针对同 一个蛋白分子上不同抗原决定簇的两个单抗，分别标记上荧光供体和荧光接受体，用于与待 测生物活性成分结合，生成夹心状的免疫复合物，通过测量荧光共振能量转移，可建立均相 免疫分析体系。但此均相亲和分析方法不是一种通用性技术，因为其技术上要求两种单抗针 对相同蛋白质上的不同抗原决定簇，在制备这类单抗时筛选更复杂，尤其此方法很难用于测 量小分子半抗原或配体类药物同耙蛋白的相互作用。相反，用本发明所述的方法将单活性位 点生物分子交联成多活性位点共价加合物，就只需要一种单抗且对此单抗所识别的抗原决定 簇无任何要求；辅助以积分球增强荧光信号的测量比例，不仅可表征大分子之间的相互作用， 还可表征小分子半抗原以及配体类药物等同对应蛋白的相互作用。因此，采用本发明所述的 方法，以荧光共振能力转移技术为基础也可建立一种通用性的均相亲和分析新方法。
发明内容
本发明的关键技术环节在于联用以下策略，建立不分离出非共价产物复合物就可在均相 体系直接测量生物分子含量和相互作用亲和力的均相亲和分析新方法(l)将单活性位点生物 大分子或小分子，与含多个相同活泼官能团的树状分子或其它有类似功能的分子交联，生成 多活性位点共价加合物(本身为多活性位点的生物分子不需交联)，再与带强生色团标记的对 应生物活性成分结合，生成带强生色团标记的大体积非共价产物复合物；(2)在荧光分光光度 计等可测量光散射信号的仪器上，用所设计带圆柱形流式样品管的积分球，汇聚在三维空间 呈不均匀分布的光散射信号用于检测，显著提高光散射信号的测量比例。这两种策略的联合 应用，是建立本发明所述均相亲和分析方法的决定性基础。应用此发明所述方法，其特征在 于按如下步骤进行-
(一)、在亲和分析的反应体系中，用特殊策略生成有强光散射能力的非共价产物团聚物， 其特征在于按如下步骤进行
(1) .将单活性位点生物分子的标准品，与含多个相同活泼官能团的树状分子或其它有类 似功能的分子交联，生成多活性位点共价加合物；本身为多活性位点的生物分子不需交联；
(2) .将可与本身为多活性位点的生物分子或按步骤(l)所得的多活性位点共价加合物相 结合的对应生物活性成分标准品，用有强光散射能力的生色团(如纳米金或银粒子、水溶性卟 啉类物质)进行标记；
(3) .将本身为多活性位点的生物分子对应标准品或按步骤(l)所得的多活性位点共价加 合物，与按步骤(2)所得带强光散射能力生色团标记的生物活性成分相结合v生成有强光散射 能力的非共价产物团聚物；
(4) .测定本身为多活性位点生物分子的含量时，用设定量的带强光散射能力生色团标记 的对应生物活性成分直接与待测样品反应，生成有强光散射能力的非共价产物团聚物；反应 达平衡后，所生成的这种非共价产物团聚物的量，与来自样品的待测多活性位点生物分子的 含量正相关；
(5) .测定单活性位点生物分子的含量时，先按步骤(l)制备相应的多活性位点共价加合 物；测定时先将待测样品与此多活性位点共价加合物混匀，再加入设定量的带强生色团标记 的对应生物活性成分，使其发生竞争结合；达到平衡后，所生成的有强光散射能力的非共价 产物团聚物的量，与来自样品的待测单活性位点生物分子的含量负相关；
(6) .测定与按步骤(2)所制备的带强光散射能力生色团标记的生物活性成分结合性质相 同的生物分子含量时，先将待测样品与带强光散射能力生色团标记的该生物活性成分标准品 混匀，再加设定量的本身为多活性位点的相应生物分子或按步骤(l)所制备的相应多活性位点 共价加合物，使其发生竞争结合；反应达到平衡后，所生成的有强光散射能力的非共价产物 团聚物的量，与来自样品的待测生物活性分子的含量负相关； ，
(7) .测定生物活性分子之间亲和力时，令本身为多活性位点的生物分子或按步骤(l)所制 备的多活性位点共价加合物为A，按步骤(2)所制备的带强光散射能力生色团标记的对应生物 活性成分为B;在反应体系中固定A和B的浓度且二者比例接近1:1;测定时，先在反应体 系中加入待测成分(使其浓度在尽可能宽范围内变化)，再加入与此待测成分有相同结合性质 的生物活性成分(A或B)，混匀后加入设定量的可与待测成分结合的生物活性成分(B或A)，使 其发生竞争结合；反应达平衡后，所生成的有强光散射能力的非共价产物团聚物的量与外加 待测成分的量负相关；再用Scatchard作图法分析所生成的有强光散射能力的非共价产物团聚 物的量对外加待测成分量的响应，确定解离常数表示二者之间相互作用的亲和力；
(8).在步骤(2)中，还可用一对有荧光共振能量转移效应的生色团分别标记同一种生物 活性成分，将二者等比例混匀后，再与本身为多活性位点的相应生物分子或步骤(l)所得的相 应多活性位点共价加合物结合，使其生成有强荧光共振能量转移效应的非共价产物团聚物； 然后参照步骤(4)到步骤(7)表征生物分子间的相互作用。
(二)、用安装有流式样品管的积分球(其规格与所用荧光分光光度计等测量仪器相匹配。 以下所述积分球及圆柱形流式样品管的参数均与ShimadzuRF-540荧光分^;光度计匹配)，汇
聚在三维空间不均匀分布的光散射或荧光信号用于检测，其特征在于按如下步骤进行-
(1) .用石英或玻璃制造圆柱形流式样品管(内径0.40cm，夕卜径0.60cm，长2.5 cm);测 量前用缓冲液以流动注射方式清洗；
(2) .制造用于汇聚光散射信号的积分球；在此积分球壁上开三个园孔(分别正对荧光分 光光度计等光散射信号测量仪器的激发窗口和检测窗口的两园孔直径都为0.62cm;用于导出 透射光的园孔直径为0.82 cm);其中，孔中心连线过积分球球心的一对园孔用于安置圆柱形 流式样品管(使圆柱形流式样品管的轴心线与荧光分光光度计等光散射信号测量仪器的激发 窗口轴心线尽量重合)，另一园孔作为光散射汇聚后进入检测窗口的出口(作为光散射出口的 园孔，其轴心线与荧光分光光度计等光散射信号测量仪器检测窗口的轴心线尽量重合)；将透 射光用内部强吸光的玻璃直管(内径0.61cm，外径0.81cm)引导到积分球以外，样品管、导光 管与积分球壁上园孔之间的空隙都用合适的垫圈密封；将焦距60cm的汇聚镜(焦距应远远大 于所用积分球的直径)安装在激发窗口和圆柱形流式样品管之间，将激发光汇聚成焦点位于积 分球以外的近平行激发光(避免激发光透过样品管直接进入积分球内而造成很高的背景)，并 垂直地照射到圆柱形样品管针对激发窗口的底面上；
(3) .将激发光通路和圆柱形流式样品管用内径3.0 cm的不透光塑料直管连接(此直管的 轴心线与激发光通路的轴心线尽量重合)，将积分球汇聚的散射光经出射园孔与检测窗口用内 径3.0 cm的不透光塑料直管连接(此直管的轴心线与检测窗口的轴心线尽量重合)，尽可能降 低背景和杂散光；
(4) .用注射器手动或步进马达自动把适量液体样品输送到圆柱形流式样品管内；
(5) .用安装了积分球的荧光分光光度计等光散射测量仪器，测量光散射强度；
(6) .与(一)中所述步骤(8)对应，用安装了积分球的荧光分光光度计等仪器，测量共振能 量转移所产生的荧光。
本发明从增强被测物质光散射能力(内因)的角度，设计特殊策略增大非共价产物复合物 的体积，并促进内部生色团之间的相互作用，从而提高散射颗粒的光散射能力；同时，从增 强光散射信号测量比例(外因)的角度，用积分球显著提高光散射信号测量比例，使光散射信 号强度对待测物量变化的响应系数显著提高，籍此建立一种通用性均相亲和分析新技术，可 用于免疫分析和小分子配体药物的离体筛选。
本发明应用中，除了用有强光散射能力的生色团标记对应成分外，还可用一对能发生荧 光共振能量转移的生色团分别标记相同的生物活性成分，并借助积分球增强荧光信号测量比 例的检测技术，也可建立起测量荧光共振能量转移效应的均相亲和分析方法，可用于免疫分 析和小分子配体药物的离体筛选。
附图中所用浓度都换算成游离瘦肉精的当量浓度(C)， /表示光散射强度。PAMAM Dendrimer 412368 (表面有4个氨基)来自Sigma-Aldrich， USA。
图la Dendrimer和活化后待交联的生物活性分f结构示意图。
图lb用图la中所示的Dendrimer与对应生物活性分子交联生成的多活性位点共价加合
物结构示意图。
图2用图lb所示的多活性位点共价加合物问带强生色团标记的对应生物分子^f生成的
非共价产物合物结构示意图。 图3用于Shimadzu RF-540荧光分光光度计的积分球不意图。 图4本发明实施中用积分球增加光散射信号测量比例的原理示意图。 图5瘦肉精共价加合物与纳米金粒子标记单抗所生成非共价产物复合物的光散射谱。 图6比较积分球增加散射信号测量比例的效应。
图7比较Dendrimer交联痩肉精成共价加合物对非共价产物复合物光散射能力的增强 效应。
图8本发明方法测定瘦肉精含量的响应曲线。
图9本发明方法测定瘦肉精单抗含量的响应曲线。.
图io本发明方法测定瘦肉精衍生物与其单抗结合的亲和力。具体实施实例
以Sigma所售PAMAM Dendrimer 412368 (表面有4个氨基)交联的痩肉精共价加合物同 纳米金粒子标记抗瘦肉精的单抗相互作用为例，在Shimadzu RF-540荧光分光光度计上安装 带圆柱形流式样品管的积分球，按照如下步骤实施本发明(结果参见附图5到附图10):
1) 瘦肉精半抗原同Dendrimer连接
A. 用亚硝酸钠在低温下将瘦肉精重氮化，再与溴乙酰苯胺连接；
B. 将Dendrimer用N-羟基琥珀酰亚胺活化羧基的氧化型巯基乙酸反应(修饰其氨基)后， 再用NaBH4还原，生成表面带4个巯基的Dendrimer;
C. 将带巯基的Dendrimer同与溴乙酰苯胺相连的瘦肉精反应，生成表面带4个痩肉精半 抗原的共价加合物；过制备型HPLC柱纯化。
2) 纳米金粒子标记抗瘦肉精单抗
A. 制备lOmn纳米金粒子，测定游离纳米金粒子吸收谱和光散射谱；
B. 将所得纳米金粒子用0.2。/。的PEG600稳定，加入未稀释的商品抗瘦肉精单抗，搅拌 反应10min后置于4'C备用；
C. 测定标记产物的吸收谱和光散射谱。
3) Dendrimer交联的瘦肉精共价加合物与纳米金粒子标记单抗结合生成非共价产物复合 物后，比较用积分球增加光散射信号测量比例的效应
A. 配制线性浓度梯度的瘦肉精共价加合物溶液；
B. 加入与瘦肉精共价加合物最高浓度稍过量的纳米金粒子标记对应单抗，调整所有溶 液体积相同；
C. 反应达平衡后，取适量反应液，用注射器手动加样到流式样品管中；
D. 打开积分球上盖(不用积分球)，激发与发射等波长，扫描在中等浓度下Dendrimer交 联瘦肉精共价加合物反应液的光散射谱(图5);
E. 关上积分球上盖(用积分球)，相同方式扫描光散射谱；
F. 打开积分球上盖(不用积分球)，在最大光散射波长下测量上述不同瘦肉精共价加合物 浓度反应体系的光散射信号；
G. 关上积分球上盖(用积分球)，在相同散射波长下测量上述溶液的光散射信号强度；
H. 线性回归比较两种测量方式的线性响应系数差异，考察积分球对散射信号测量比例 的增加效应(图6)。
4)用本发明所述方法，比较瘦肉精共价加合物和游离的瘦肉精衍生物，，与纳米金粒子标 记的相同单抗反应，所生成的非共价产物复合物的光散射能力差异
A. 制备瘦肉精衍生物用亚硝酸钠低温下将瘦肉精重氮化，与乙酰苯胺反应，过制备 型HPLC柱纯化后作为瘦肉精衍生物的标准品，测定其偶氮产物在近紫外区吸收峰 的摩尔消光系数；
B. 据所得摩尔消光系数，测定Dendrimer交联的瘦肉精共价加合物在相同紫外波长下 的吸收，确定其中所含瘦肉精的量；
C. Dendrimer交联瘦肉精共价加合物为线性浓度梯度下，与设定量纳米金粒子标记的 单抗反应，用本发明所述方法测量散射信号；
D. 相同当量游离瘦肉精衍生物在相同的浓度梯度下，与相同设定量的纳米金粒子标记 单抗反应达到平衡后，用本发明所述方法测量光散射信号；
E. 回归分析比较二者响应系数的差异，确定用Dendrimer将瘦肉精交联成多活性位点 共价加合物对颗粒散射信号的增强效应(图7)。
5) 用本发明所述方法均相测定瘦肉精共价加合物含量
A. 用所制备的Dendrimer交联瘦肉精共价加合物，在其线性浓度梯度下与设定量纳米 金粒子标记单抗反应，生成非共价产物复合物；
B. 用本发明所述方法测量产物复合物的光散射信号，制作标准曲线；回归分析数据建 立所需要的响应函数关系(图6和图7);
C. 将已知量Dendrimer交联瘦肉精共价加合物与健康人血清混合作为待测样品，取适 量样品与设定量的纳米金粒子标记相同单抗反应，生成非共价产物复合物，用本发 明所述方法测量光散射信号；
D. 根据响应函数关系，确定样品中Dendrimer交联瘦肉精共价加合物含量，与已知量 比较；
6) 用本发明所述方法测定瘦肉精含量
A. 设定Dendrimer交联痩肉精共价加合物量和接近等当量的对应纳米金粒子标记单抗 反应体系；
B. 将设定量的瘦肉精共价加合物和不同量的游离瘦肉精标准品混匀，加入设定量的纳 米金粒子标记抗瘦肉精单抗，均相竞争结合，反应生成非共价产物复合物；
C. 将设定量的Dendrimer交联瘦肉精共价加合物同待测瘦肉精样品混匀，加入与设定 量的纳米金粒子标记抗瘦肉精单抗，均相竞争结合，反应生成非共价产物复合物；
D. 使用积分球测定不同体系的光散射信号强度；线性回归确定响应函数(图8);据响应
函数确定待测样品中瘦肉精的含量；
7) 用本发明所述方法均相测定瘦肉精单抗含量
A. 设定Dendrimer交联瘦肉精共价加合物量和接近等当量的对应纳米金粒子标记单抗 反应体系；
B. 将设定量的纳米金粒子标记抗痩肉精单抗同无标记的相同单抗标准品混匀；
C. 加入设定量的Dendrimer交联瘦肉精所生成的共价加合物，在均相发生竞争结合反 应，生成对应的非共价产物复合物；
D. 用本发明所述方法测量光散射信号；并建立产物复合物光散射信号同外加抗瘦肉精 单抗待标准品的响应函数(图9);
E. 类似方法，用未知样品代替已知单抗，相同方法测定产物复合物的光散射信号；据 响应函数确定待测样品中的单抗含量；
8) 用本发明所述方法测定瘦肉精的衍生物(痩肉精重氮盐同乙酰苯胺的共价加合物)与其 单抗结合的亲和力
A. 设定Dendrimer交联瘦肉精共价加合物量和接近等当量的对应纳米金粒子标记单 抗反应体系；
B. 在游离瘦肉精衍生物尽可能宽浓度范围内，先将设定量的Dendrimer交联瘦肉精共 价加合物同待测的痩肉精衍生物混匀，再加入纳米金标记的对应单抗，均相竞争结 合达到平衡；
C. 用本发明所述的光散射检测方式，测定游离瘦肉精衍生物对生成带强生色团标记非 共价产物复合物散射信号的影响；
D. Scatchard作图法分析所生成的非共价产物复合物散射信号随外加游离瘦肉精衍生 物浓度的变化(图10);确定瘦肉精衍生物同其对应单抗所形成复合物的解离常数。
权利要求
1.一种在亲和分析过程中，用本身为多活性位点的生物分子或通过特殊策略获得的多活性位点共价加合物，与带强生色团标记的对应生物活性成分结合，生成有强光散射能力的非共价产物团聚物，并在荧光分光光度计等可测量光散射的仪器上，用安装有圆柱形流式样品管的积分球，显著提高光散射信号的测量比例；联用这两种策略，建立不需分离出产物复合物的均相亲和分析新方法，用于测定生物活性分子含量及相互作用的亲和力，其特征在于按如下步骤进行(一)、在亲和分析的反应体系中，用特殊策略生成有强光散射能力的非共价产物团聚物，其特征在于按如下步骤进行(1).将单活性位点生物分子的标准品，与含多个相同活泼官能团的树状分子或其它有类似功能的分子交联，生成多活性位点共价加合物；本身为多活性位点的生物分子不需交联；(2).将可与本身为多活性位点的生物分子或按步骤(1)所得的多活性位点共价加合物相结合的对应生物活性成分标准品，用有强光散射能力的生色团(如纳米金或银粒子、水溶性卟啉类物质)进行标记；(3).将本身为多活性位点的生物分子对应标准品或按步骤(1)所得的多活性位点共价加合物，与按步骤(2)所得带强光散射能力生色团标记的生物活性成分相结合，生成有强光散射能力的非共价产物团聚物；(4).测定本身为多活性位点生物分子的含量时，用设定量的带强光散射能力生色团标记的对应生物活性成分直接与待测样品反应，生成有强光散射能力的非共价产物团聚物；反应达平衡后，所生成的这种非共价产物团聚物的量，与来自样品的待测多活性位点生物分子的含量正相关；(5).测定单活性位点生物分子的含量时，先按步骤(1)制备相应的多活性位点共价加合物；测定时先将待测样品与此多活性位点共价加合物混匀，再加入设定量的带强生色团标记的对应生物活性成分，使其发生竞争结合；达到平衡后，所生成的有强光散射能力的非共价产物团聚物的量，与来自样品的待测单活性位点生物分子的含量负相关；(6).测定与按步骤(2)所制备的带强光散射能力生色团标记的生物活性成分结合性质相同的生物分子含量时，先将待测样品与带强光散射能力生色团标记的该生物活性成分标准品混匀，再加设定量的本身为多活性位点的相应生物分子或按步骤(1)所制备的相应多活性位点共价加合物，使其发生竞争结合；反应达到平衡后，所生成的有强光散射能力的非共价产物团聚物的量，与来自样品的待测生物活性分子的含量负相关；(7).测定生物活性分子之间亲和力时，令本身为多活性位点的生物分子或按步骤(1)所制备的多活性位点共价加合物为A，按步骤(2)所制备的带强光散射能力生色团标记的对应生物活性成分为B；在反应体系中固定A和B的浓度且二者比例接近1∶1；测定时，先在反应体系中加入待测成分(使其浓度在尽可能宽范围内变化)，再加入与此待测成分有相同结合性质的生物活性成分(A或B)，混匀后加入设定量的可与待测成分结合的生物活性成分(B或A)，使其发生竞争结合；反应达平衡后，所生成的有强光散射能力的非共价产物团聚物的量与外加待测成分的量负相关；再用Scatchard作图法分析所生成的有强光散射能力的非共价产物团聚物的量对外加待测成分量的响应，确定解离常数表示二者之间相互作用的亲和力；(8).在步骤(2)中，还可用一对有荧光共振能量转移效应的生色团分别标记同一种生物活性成分，将二者等比例混匀后，再与本身为多活性位点的相应生物分子或步骤(1)所得的相应多活性位点共价加合物结合，使其生成有强荧光共振能量转移效应的非共价产物团聚物；然后参照步骤(4)到步骤(7)表征生物分子间的相互作用。(二)、用安装有流式样品管的积分球(其规格与所用荧光分光光度计等测量仪器相匹配。以下所述积分球及圆柱形流式样品管的参数均与Shimadzu RF-540荧光分光光度计匹配)，汇聚在三维空间不均匀分布的光散射或荧光信号用于检测，其特征在于按如下步骤进行(1).用石英或玻璃制造圆柱形流式样品管(内径0.40cm，外径0.60cm，长2.5cm)；测量前用缓冲液以流动注射方式清洗；(2).制造用于汇聚光散射信号的积分球；在此积分球壁上开三个园孔(分别正对荧光分光光度计等光散射信号测量仪器的激发窗口和检测窗口的两园孔直径都为0.62cm；用于导出透射光的园孔直径为0.82cm)；其中，孔中心连线过积分球球心的一对园孔用于安置圆柱形流式样品管(使圆柱形流式样品管的轴心线与荧光分光光度计等光散射信号测量仪器的激发窗口轴心线尽量重合)，另一园孔作为光散射汇聚后进入检测窗口的出口(作为光散射出口的园孔，其轴心线与荧光分光光度计等光散射信号测量仪器检测窗口的轴心线尽量重合)；将透射光用内部强吸光的玻璃直管(内径0.61cm，外径0.81cm)引导到积分球以外，样品管、导光管与积分球壁上园孔之间的空隙都用合适的垫圈密封；将焦距60cm的汇聚镜(焦距应远远大于所用积分球的直径)安装在激发窗口和圆柱形流式样品管之间，将激发光汇聚成焦点位于积分球以外的近平行激发光(避免激发光透过样品管直接进入积分球内而造成很高的背景)，并垂直地照射到圆柱形样品管针对激发窗口的底面上；(3).将激发光通路和圆柱形流式样品管用内径3.0cm的不透光塑料直管连接(此直管的轴心线与激发光通路的轴心线尽量重合)，将积分球汇聚的散射光经出射园孔与检测窗口用内径3.0cm的不透光塑料直管连接(此直管的轴心线与检测窗口的轴心线尽量重合)，尽可能降低背景和杂散光；(4).用注射器手动或步进马达自动把适量液体样品输送到圆柱形流式样品管内；(5).用安装了积分球的荧光分光光度计等光散射测量仪器，测量光散射强度；(6).与(一)中所述步骤(8)对应，用安装了积分球的荧光分光光度计等仪器，测量共振能量转移所产生的荧光。
2. 根据权利要求1中(一)的步骤(l)所述，其特征在于将单活性位点的生物分子与含多个相同活泼官能团的树状分子或其它有类似功能的分子交联，生成多活性位点共价加合物；这是单活性位点生物分子在亲和反应中生成非共价产物团聚物的必要前提，也是本发明的创 新点之一。
3. 根据权利要求1中(一)的步骤(3)所述，其特征在于用本身为多活性位点的生物分子 或多个活性位点共价加合物，与带强光散射能力生色团标记的对应生物活性成分结合，生成 有强光散射能力的非共价产物团聚物。这是本发明的关键创新点之一。
4. 根据权利要求1中(二)的步骤(1)到步骤(4)所述，其特征在于以流动注射方式进样， 并用圆柱形流式样品管盛装液体样品，增加信号测量重复性和液体样品的光散射效率。
5. 根据权利要求1中(二)的步骤(1)到步骤(4)所述，其特征在于在荧光分光光度计等光 散射信号测量仪器上，用装有流式样品管的积分球汇聚分布在三维空间的光散射信号进行检 测。这也是本发明的创新点之一。
6. 根据权利要求1中(一)的步骤(8)和(二)的步骤(6)所述，其特征在于可用能产生强荧 光共振能量转移效应的一对生色团分别标记参与亲和反应的同一种生物活性成分，再与本身 为多活性位点的相应生物分子或相应多活性位点共价加合物结合，从而使所生成的非共价产 物团聚物中产生荧光共振能量转移效应，从而不需分离出其产物团聚物，，1」用荧光表征生物 分子之间的相互作用。
7. 根据权利要求2到权利要求5所述，本发明的特征在于用有多个相同活性位点的生物分子(天然或交联生成)与带强光散射能力的生色团标记的生物活性成分结合，生成有强光 散射能力的非共价产物团聚物，再用积分球增强的光散射检测技术作为检测手段，从而建立 一种通用性的均相亲和分析新方法。
全文摘要
一种用有多个相同官能团的树状分子或其它有类似功能的分子，将单活性位点生物分子交联，生成多活性位点共价加合物(本身为多活性位点的生物分子不需交联)，再与带强光散射能力的生色团所标记的对应生物活性成分结合，生成非共价产物团聚物，并联用积分球增强光散射信号测量比例的光散射检测技术，不需从反应混合物中分离出这种非共价产物复合物而直接测定其含量，从而建立起来的均相亲和分析新方法，可用于免疫分析和配体类药物离体筛选；用一对有强荧光共振能量转移效应的生色团代替有强散射能力的生色团进行标记，也可建立基于测定荧光共振能量转移的类似均相亲和分析方法。
文档编号G01N21/64GK101178360SQ200710092738
公开日2008年5月14日 申请日期2007年9月24日 优先权日2007年9月24日
发明者于明安, 飞 廖, 杨晓兰, 谢国明, 萍 邓, 巍 陆 申请人:重庆医科大学