专利名称：流式细胞术同步检测肿瘤中多种细胞蛋白表达的方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤细胞分析检测领域，尤其涉及运用流式细胞术检测肿瘤细胞蛋白的 表达。
技术背景目前，在实体肿瘤研究中，由肿瘤组织块制备的单细胞通常全部视为肿瘤细胞进行 测定和研究，当需要做患者自身肿瘤细胞与正常细胞比对时，常需要另外采集正常组织 细胞，这涉及患者意愿、多部门配合、样品存储运输等系列问题，往往不易完善；在比 较肿瘤细胞与正常细胞的蛋白表达水平时，则要在不同的试管中分别检测、分别分析。事实上在肿瘤组织中除大量的肿瘤细胞外还含有血细胞、血管内皮细胞等正常细 胞。如果能用合适的标记抗体加以区分，就可以在一个试管中完成不同细胞的某种蛋白 表达水平测定，达到同步检测、同步分析、互相比较的目的。流式细胞术是借助流式细胞仪通过抗原、抗体反应和荧光标记法完成对细胞各种特 性进行定性定量的一种分析技术。其原理是将悬浮在液流中的单细胞逐个通过测量区， 用仪器检测细胞的光学参数而达到快速、大量地测定细胞的一系列物理特性和生化特 性。 ' 发明内容发明目的本发明所要解决的技术问题是提供一种采用流式细胞术检测肿瘤中细胞 蛋白表达的方法，可满足同步测定多种细胞(两种或以上的细胞)的蛋白表达水平的要求。技术方案为解决上述技术问题，本发明的思路是将使用荧光标记区分不同细胞的 方法与使用抗体标记特异性识别蛋白的方法组合，达到同步检测不同细胞上某一蛋白表 达的目的。流式细胞术同步检测肿瘤中多种细胞的蛋白表达方法的具体步骤如下1、 将新鲜的肿瘤组织制备成单细胞悬液。2、 调节单细胞悬液浓度为±106细胞/10(^1。3、 在一个试管中加入步骤2得到的单细胞悬液，分别按荧光标记抗体的试剂说明 的配比浓度加入能够区分不同待测细胞的荧光标记抗体5-20W，充分混匀，室温避光反 应15 45分钟。通过加入适合的荧光标记与细胞反应显色来区分不同细胞的方法为本 领域公知的技术，例如使用具有不同荧光标记的抗体CD3、 CD19和CD14同时区分T 细胞、B细胞和单核细胞。 4、 在上述试管中，加入待测蛋白的荧光抗体，充分混匀，室温避光反应15 45分 钟。该抗体的颜色标记要与步骤3中标记细胞的荧光颜色相区别。对于不同的蛋白种类， 选择合适的抗体和抗体的加入方式为本领域公知的技术，对于位于细胞膜表面的表达蛋 白，可以直接加抗体反应；对于位于细胞内的表达蛋白，需要先对细胞进行固定、破膜， 然后加抗体反应。例如检测细胞膜上的多药耐药糖蛋白Pgp表达，直接加与细胞荧光不 同的荧光抗体进行反应；在检测细胞核内的凋亡蛋白Bcl-2、增殖细胞核抗原PCNA时， 需要先对细胞进行固定、破膜，然后加与细胞荧光不同的荧光抗体进行反应。5、 离心去除上清液，以清除未结合的荧光标记抗体。6、 悬浮细胞后上流式细胞仪检测、分析多种细胞的蛋白表达。 其中步骤3中所述的待测细胞为肿瘤细胞、基质细胞、血管内皮细胞、浸润淋巴细胞或血细胞中的两种或两种以上的细胞。肿瘤细胞可以是鳞癌细胞、腺癌细胞、未分化 癌细胞、肉瘤细胞或肿瘤干细胞。血细胞可以是淋巴细胞、单核细胞、粒细胞或造血干 细胞。在肿瘤组织制备成单细胞悬液前，新鲜肿瘤组织块可放入含30-60IU/ml抗凝剂的生 理盐水中，以达保湿运输的目的。有益效果本发明的流式细胞术同步检测肿瘤中多种细胞蛋白表达的方法与现有技 术相比具有如下优点:1、 可以了解肿瘤组织块中不同细胞的含量。2、 以往视肿瘤组织块细胞均为肿瘤细胞进行测定和研究，现在通过标记抗体区分 细胞后，可以有效提高对目标细胞测定的准确度和精确度。3、 可以用肿瘤组织块中已有的正常细胞作为内参照，不仅解决了参照细胞不易获 取的问题，而且可以在同一张数据图中进行同步分析，扩大了信息量。4、 降低测定成本，减少分次实验带来的系统误差。
图l为采用本发明方法检测腺癌样本(实施例1)的流式细胞分析图。 图2为采用本发明方法检测鳞癌样本(实施例2)的流式细胞分析图。 图3a为采用传统方法即不进行细胞标记检测甲状腺肿块样本(实施例3)的流 式细胞分析图。图3b至3e为采用本发明方法检测甲状腺肿块样本(实施例3)的流式细胞分 析图。
具体实施例方式
实施例l:对腺癌进行抑癌基因突变产物P53(mutant)表达水平的研究。腺癌标本立即放入含50IU/ml抗凝剂的生理盐水中送实验室制备单细胞悬液，调单 细胞悬液浓度为±106细胞/10(^1。单细胞悬液分为2份，每份100pl。 一份先用荧光标记 CD45鼠抗人单抗(Immunotech公司)l(Hd体标记血细胞，充分混匀后，室温避光反应30 分钟；再用固定和破膜的试剂盒IntmPREpTM对细胞进行固定和破膜后，P53(mutant)鼠 抗人单抗(Ancell公司)20^il标记细胞蛋白，充分混匀后，室温避光反应25分钟；经离心 去除上清液，悬浮细胞后上流式细胞仪FACSCalibur检测、分析。另一份做同型阴性对 照管。图l显示该标本去除血细胞(CD45+)后的腺癌细胞的P53(mutant)表达阳性细胞 率为16.88%。实施例2:观察一例鳞癌细胞增殖水平，进行增殖细胞核抗原(PCNA)的测定。鳞癌标本立即放入含60IU/ml抗凝剂的生理盐水中送实验室制备成单细胞悬液，调 单细胞悬液浓度为±106细胞/10(^1。单细胞悬液分为2份，每份100jxl。 一份先用荧光标 记CD45鼠抗人单抗(Immunotech公司)10pl体标记血细胞，充分混匀后，室温避光反应 45分钟；再用固定和破膜的试剂盒IntraPREpTM对细胞进行固定和破膜后，用鼠抗人单 抗PCNA (Pharmingen公司)IOW标记细胞蛋白，充分混匀后，室温避光反应45分钟； 经离心去除上清液，悬浮细胞后上流式细胞仪FACSCalibur检测、分析。另一份做同型 阴性对照管。图2显示该鳞癌中血细胞(CD45+)的PCNA阳性细胞率为30.35%，腺癌 细胞的PCNA阳性细胞率为40.75%。实施例3:对一例甲状腺肿块进行多药耐药糖蛋白Pgp表达水平的测定。标本在实验室制备成单细胞悬液，调浓度为±106细胞/10(^1。单细胞悬液分为2份， 每份10(^1。 一份先用带有荧光标记1和带有荧光标记2的鼠抗人单抗(Immunotech公 司)CD45、 CD14各10^1分别标记血细胞和巨噬细胞，充分混匀后，室温避光反应45 分钟；再用带有荧光标记3的多药耐药糖蛋白Pgp单抗(Immunotech公司)标记细 胞蛋白，充分混匀后，室温避光反应30分钟，上流式细胞仪FC500检测、分析。图3a 显示采用传统方法即不进行细胞标记时测得的甲状腺肿块Pgp表达水平4.5%;图3b显 示采用本发明流式细胞术同步检测肿瘤中多种细胞蛋白表达的方法时测得甲状腺肿块 中肿瘤细胞占80.4%，血细胞占15.8%，巨噬细胞占1.4%。图3c显示采用本发明流式 细胞术同步检测肿瘤中多种细胞蛋白表达的方法时测得甲状腺肿块中肿瘤细胞Pgp表达 水平2.6%。图3d显示采用本发明流式细胞术同步检测肿瘤中多种细胞蛋白表达的方法 时测得甲状腺肿块中血细胞Pgp表达水平3.6%。图3e为采用本发明流式细胞术同步检 测肿瘤中多种细胞蛋白表达的方法时测得甲状腺肿块中巨噬细胞Pgp表达水平65.5%。
权利要求
1、一种流式细胞术同步检测肿瘤中多种细胞蛋白表达的方法，其特征在于该方法包括以下步骤(1)将新鲜的肿瘤组织制备成单细胞悬液；(2)调节单细胞悬液浓度为±106细胞/100μl；(3)在一个试管中加入步骤(2)得到的单细胞悬液，分别按荧光标记抗体的试剂说明的配比浓度加入能够区分不同待测细胞的荧光标记抗体5-20μl，充分混匀，室温避光反应15～45分钟；(4)在上述试管中，加入待测蛋白的抗体，充分混匀，室温避光反应15～45分钟；(5)离心去除上清液，以清除未结合的荧光标记抗体；(6)悬浮细胞后上流式细胞仪检测、分析多种细胞的蛋白表达。
2、 根据权利要求1所述的流式细胞术同步检测肿瘤中多种细胞蛋白表达的方法， 其特征在于步骤(3)中所述的待测细胞为肿瘤细胞、基质细胞、血管内皮细胞、浸润 淋巴细胞或血细胞中的两种或两种以上的细胞。
3、 根据权利要求2所述的流式细胞术同步检测肿瘤中多种细胞蛋白表达的方法， 其特征在于所述的肿瘤细胞为鳞癌细胞、腺癌细胞、未分化癌细胞、肉瘤细胞或肿瘤干 细胞。
4、 根据权利要求2所述的流式细胞术同步检测肿瘤中多种细胞蛋白表达的方法， 其特征在于所述的血细胞为淋巴细胞、单核细胞、粒细胞或造血干细胞。
全文摘要
本发明公开了一种流式细胞术同步检测肿瘤中多种细胞蛋白表达的方法，包括如下步骤将新鲜的肿瘤组织制备成单细胞悬液；调节单细胞悬液浓度为±10<sup>6</sup>细胞/100μl；在一个试管中加入上述步骤得到的单细胞悬液，分别按试剂说明的配比浓度加入能够区分不同细胞的荧光标记抗体5-20μl，充分混匀，室温避光反应15～45分钟；在上述试管中，加入待测蛋白的抗体，充分混匀，室温避光反应15～45分钟；离心去除上清液，以清除未结合的荧光标记抗体；悬浮细胞后上流式细胞仪检测、分析。该方法可以提高对目标细胞测定的准确度和精确度，并且可以降低测定成本，减少分次实验带来的系统误差。
文档编号G01N33/48GK101126758SQ20071013200
公开日2008年2月20日 申请日期2007年9月6日 优先权日2007年9月6日
发明者吴晓柳, 朱月清, 沈宗丽 申请人:江苏省肿瘤医院