专利名称：鉴定和定位马溃疡和其它消化道出血的方法及仪器的制作方法
鉴定和定位马溃疡和其它消化道出血的方法及仪器发明背景发明领域-本发明总的涉及诊断和检测仪器及方法，更具体涉及马血红蛋 白和马白蛋白的抗体和其在检测并定位马胃和结肠溃疡和其它消化道出血的检测仪 器、试剂盒方法中的应用。在讨论检测和诊断马溃疡之前，先讨论促成马高发消化道溃疡的某些马独特的 消化道解剖结构会有帮助。就人和大多数其它动物而言，胃对进食的反应是分泌胃酸。相反，马在数千年进化钟成为细流进食动物(tricklefeeder)(进食慢却持续或多或少一天中大部分时间)，它们的消化系统也配合这种进食方式，不断产生胃液并且肝 脏分泌胆汁进入前肠。因此，可认为马的胃是一种可在整天中或多或少不断产生胃 酸的酸泵，而无论马是否进食。由于马的解剖结构和现代进食及护理规程，所有的马，尤其是表演用马患胃溃 疡的非常多。例如赛马，据报道多达97%患有消化道溃疡，而展览用马的消化道溃 疡发病率仅稍稍微落后。即使表演马的幼驹也受此病折磨，大约60%的表演马幼驹 患消化道溃疡。而娱乐用马消化道溃疡的发病率低于展览用马，近二十年来所有种 类的马群包括娱乐用马消化道溃疡发病均显著升高。虽然结肠溃疡(马的盲肠和/或结肠溃疡)的发病率远没有被探究，但它们也可能 代表了不同的同样严重的马健康问题。迄今唯一的一项科学研究专门观察了结肠溃 疡发病率显示了令人吃惊的结果。此项研究对马的剖析显示，胃溃疡发病率约55% 结肠溃疡发病率40%。胃和结肠溃疡的发病率不相同，意味着有些马仅患胃溃疡而 另一些马仅患结肠溃疡。然而，患结肠溃疡的马大部分也患胃溃疡，马群无胃或结 肠溃疡的比例低于30%。如上所述，展览用马和赛马的消化道溃疡发病率经统计甚 至比普通马群还要高。本领域已釆用了很多方案来解决马的消化道溃疡问题。此类解决方案包括用抗 酸药暂时中和胃酸、用药物抑制胃酸产生、延长休息时间和进餐时间。近年来，开 发出一种新的高效食物添加剂，能够治疗和/或预防胃溃疡和结肠溃疡，参见2003年5月9日提交的名称为"食物添加剂及其治疗并预防马和其它动物消化道溃疡的方法"的美国专利申请第10/435,367号所述，该专利申请已转让给本发明受让人，该专利 申请的内容全文纳入本文作为参考。虽然已有了此类治疗方法，但高度精确地诊断马胃溃疡仍然非常困难，并且还 几乎不能诊断马的结肠溃疡。已发现，最常用的诊断马溃疡的方法，即利用症状(常 常是模糊的、非特异性的症状如体重减轻、食欲不振、嗜睡或间歇性发热)与可察觉 的治疗结果相结合的方法几乎完全不可靠。这是由于可能有许多潜在原因能引起相 同的症状，并非所有马均表现出相同或甚至明显的溃疡症状。因此，用该技术常常 不比猜测游戏好多少。认为唯一可靠的诊断马胃溃疡方法是采用3米视频内窥镜，其显著缺点是昂贵、 费时和会产生紧张感(对马和对训练者/马主人均如此)。购买一台3米视频内窥镜的 费用相当高，高到让马主人和所有除大部分精英外的训马师无法承担。除费用之外 内窥镜操作烦琐且费时。没有3米视频内窥镜的马主人、训马者和兽医必需向诊所 或有内窥镜的兽医求诊。这将花费额外的时间和支出，因为马失去了马主人、训马 师或常常是兽医经手的照料，会令马甚至更为紧张而且会失败。而且，即使购买和使用了 3米视频内窥镜，结果也只限于此设备的可视范围即 胃组织。虽然可用此类设备有效观测并诊断胃溃疡，却仍然不能用该设备诊断马其 余95%消化道溃疡。因为内窥镜不够长和用内窥镜时要充分排空后肠(大约为75英 尺小肠、盲肠和结肠)这就跟杀了马差不多，因此用内窥镜无法观察后肠。实际上， 近年来文献报道的马结肠溃疡高发病率都是通过死后观察分析才完成的。因此本发明的主要目的是提供一种马溃疡和消化道出血的检测试剂盒和运用该 检测试剂盒的相关方法，来有效诊断马胃溃疡或出血和结肠溃疡或出血。本发明的 相关目的是提供对马胃溃疡或出血或结肠溃疡或出血或两者的高度特异性指征。本 发明的另一个相关目的是高度可靠地鉴定马存在的溃疡或出血和鉴定马存在的溃疡 类型，而不会产生过度假阳性读数。本发明的另一个目的是简单迅速地进行检测，进行此检测的用户不需要专门技 术或进行培训。本发明还有一个目的是它是完全自主进行、不需要实验室分析或额 外的处理设备因此可在任何地方如现场进行检测。本发明还有另一个目的是在几分 钟内快速提供检测结果而不需要更长时间。本发明的马溃疡或出血检测试剂盒的结构还必须耐用和能够长期ie存，试剂盒不需要特殊的贮存条件能确保试剂盒有长期使用寿命。为了提高本发明马溃疡或出血检测试剂盒的市场吸引力，它还应不昂贵从而能够拥有最广泛的市场前景。最终， 还有一个目的是本发明的马溃疡或出血检测试剂盒及其方法的所有上述优点和目的 实现不会带来任何实质性相关缺陷。发明概述本发明克服了以上背景技术所述的缺陷和局限性。本发明提供一种能以高灵敏 度和特异性鉴定马的胃和/或结肠溃疡和其它消化道出血的马溃疡和消化道出血检测 试剂盒以及使用所述检测试剂盒的方法，利用该马溃疡或出血检测试剂盒及方法能 清楚地区别胃溃疡或出血与结肠渍疡或出血。本发明的溃疡或出血检测指粪血检测， 因为它可鉴定所测试马的粪便中的血液成分。根据本发明所述，鉴定到两种血液成分可分别高度表示存在胃溃疡或出血和/或 结肠溃疡或出血。本发明人测到粪便中含有完整的马白蛋白极有可能是来源于结肠。 这是因为胃溃疡时马血液白蛋白(和溃疡产生的到达十二指肠的其它脊髓动物血液成 分)已受到胃酸和胃肽酶降解，而无法在粪便中检测到马白蛋白。然而，胃溃疡或出 血的血液中所含的马血红蛋白至少一部分可逃避胃酸或胃肽酶的作用而留存下来， 而能在粪便中检测到。因此粪便中存在完整的马白蛋白表示存在结肠溃疡或出血，而存在马血红蛋白 表示示存在胃溃疡或出血或结肠溃疡或出血。本领域技术人员将会明白利用马白蛋 白和马血红蛋白作为指示物的马溃疡或出血检测试剂盒及方法，将提供对一种或多 种马溃疡或出血的存在和定位均为良好的指示剂。本发明马溃疡或出血检测试剂盒 和方法的优选实施形式是设计用来检测马白蛋白和马血红蛋白指示物存在的免疫测 定，具体地说，本发明马溃疡或出血检测的优选实施方式是酶联免疫吸附试验("ELISA"检测)，它是生物化学中普遍用于检测样品中是否存在特定物质的方法。 ELISA检测是快速的免疫化学检测，其包含抗体或抗原(免疫分子)和酶(催化生物化学反应的蛋白质)。可用ELISA检测具有免疫原性的物质，主要是蛋白质(与小分子和离子例如葡萄糖和钾离子相反)，例如抗体、细菌性抗原和激素。 一种所谓的 "快速"ELISA检测是侧流免疫测定("LFI")检测，其试验用膜中的液体通道一端连接液体来源另一端连接到液体壑，沿膜有3个不连续的分开区域。第一区域含有偶联显色剂例如有色乳胶小珠或染料或胶体金的标记抗体。所述标记抗体可随液体从第一区流到第二和第三区，最终到达液体壑。如果液体中存在感兴趣的物质，它会结合此标记抗体。第二区，通常为横跨此膜的伸展直线区，包含结合于此膜的抗体。第二区的抗体对感兴趣的物质具有亲和性(将其吸附和固定到该区)，与标记抗体 和结合于第二区抗体的感兴趣的物质可形成"夹心"结构，从而形成着色线，表明 存在感兴趣物质为阳性读数。液体中含的感兴趣的物质越多，与感兴趣物质一同结 合于第二区抗体的标记抗体就越多。第三区，通常也是横跨此膜的伸展直区，只要有足够的流量和体积利用不同的 抗体/抗原反应就能形成着色线，无论是否存在感兴趣的物质。其作用是作为对照表 明该检测系统运行良好。第三区位于第二区与第一区相反的另一侧，可显示受检液 体已越过第二区，从而表明提供给该检测系统的检测液体足够使此检测系统正常工 作。此检测系统的大致说明参见May等的美国专利第5,602,040号，该专利基于两种 抗体。将含吸附于有色乳胶或胶体金颗粒表面的第一抗体的干燥颗粒加到硝酸纤维 素膜第一末端，形成上述第一区。使第二抗体吸附于硝酸纤维素膜形成一条线，产生上述第二区。使液体样品吸附进入硝酸纤维素膜第一末端进行检测。液体流动使第一区中的 颗粒游离此时待测分析物可与所述颗粒上的抗体结合。在第二区，待测分析物也结 合位于线中的第二抗体，从而形成可见的颜色线条表明存在所述分析物。这种类型 的免疫色谱检测技术依赖于流体通过膜的流动，可称为"侧流技术"。将美国专利第 5,602,040号纳入本文作为参考，如Kouvonen等的美国专利第5,712,170号那样，它 们对此领域的该技术进行了极佳的概述。可采用已有的第二种试验形式，利用"竞争性排除"技术来产生阳性或阴性结 果。与上述夹心试验不同，将纯化的抗原(马白蛋白或马血红蛋白)固定于膜条上，而 靶抗体包含在流动相内。当检测样品中不存在靶抗原时，此抗体游离出来与流动相 一起移动而结合于膜条上的固定抗原，在膜条上产生一条线。因此，出现着色线表 示阴性结果。另一方面，如果，检测样品中存在靶抗原，那么此抗原将结合流动相中的抗体， 而不能与试验带结合，从而不出现着色线。因此，此检测中不出现着色线表示阳性 结果。已报道采用Varian，Inc.公司制造的商标名为ONTRAK TESTCUP由Roche Diagnostics独家销售的这种类型的竞争性排除检测技术作药物检测。Bachand的美国 专利第6，375，897对其有所描述，该专利纳入本文作为参考。LFI检测的制造成本相对便宜、易于操作，可提供快速分析而无需实验设备。LFI 检测中的抗体通常通过用感兴趣的物质接种动物，然后动物产生对该物质的抗体而获得。利用这种生物化学关联作为分离和检测感兴趣物质的机理。LFI检测的灵敏度和特异性与放射免疫试验("RIA")检测相当。LFI检测的额外优点是不需要放射性 同位素或放射计数仪。本发明马溃疡或出血检测试剂盒的优选实施方式包括置于一个或两个塑料容器 内的两个试验带。待测马的粪便液滴放在容器(可以是例如桶、罐、塑料袋或杯)中， 加入溶液(可以是水或含有缓冲剂如盐的水)，搅拌此混合物使之彻底混合。用点样器 例如滴眼管从此容器中取几滴液体滴到容器内的试验带上。经优选的检测时间约5-30分钟后，这两个试验带将呈现表示对照指示物的可见 标记，如果存在待检测指示物，可看见的标记意味着检测到那些分别表示胃溃疡或 出血和/或结肠溃疡或出血的指示物。本发明采用两种指示物， 一种表示存在胃溃疡 或出血，另一种表示存在结肠溃疡或出血。优选实施方式中，检测表明存在结肠溃疡或出血的指示性感兴趣物质是马白蛋 白，而检测表明存在胃溃疡或出血或结肠溃疡或出血或兼有胃和结肠溃疡或出血的 指示性感兴趣物质是马血红蛋白。因此，本发明马溃疡或出血检测试剂盒和方法可 诊断胃和/或结肠溃疡或出血从而为立即治疗提供依据。因此可明白本发明所述的马溃疡和消化道出血检测试剂盒和运用此试剂盒的相关方法，能有效地诊断马胃溃疡或出血和结肠溃疡或出血以及其它消化道出血。本 发明的所述马溃疡或出血检测试剂盒和方法提供了对胃渍疡或出血和/或结肠溃疡或 出血的高度特异性指征。本发明的马溃疡或出血检测试剂盒和方法对鉴定马是否存 在溃疡或出血以及鉴定马存在的溃疡类型高度可靠，不会产生过度的假阳性读数。本发明的马溃疡或出血检测试剂盒和方法既简单又实施快速，而且用户进行该 检测无须具备特殊技能或培训。本发明的马溃疡或出血检测试剂盒是完全自主进行， 不需要实验室分析或额外处理设备，从而能在任何地方如现场进行检测。本发明的 马溃疡或出血检测试剂盒和方法可在数分钟内不需要更长时间快速提供检测结果。本发明的马溃疡或出血检测试剂盒的结构兼具耐用性和长期贮存，该检测试剂 盒无需特殊贮存条件并具有长期使用寿命。本发明的马溃疡或出血检测试剂盒的结 构还便宜使它具有最广阔的市场前景。最后，实现本发明的马溃疡或出血检测试剂 盒和方法的所有上述优点和目标不会造成任何实质性相关缺陷。
通过参见以下附图可最好地理解本发明的这些和其它优点 图1是显示马消化道解剖构造的示意图；图2显示用本发明技术构造的用于马溃疡或出血检测的试剂盒的等比例图，盒 中的第一容器装有胃溃疡或出血试验带，第二容器装有结肠溃疡或出血试验带；图3显示用本发明技术构造的用于马溃疡或出血检测的试剂盒的另一实施方式的等比例图，盒中只有一个容器，装有胃溃疡或出血试验带和结肠溃疡或出血试验带；禾口图4是说明用马溃疡或出血检测试剂盒检测表明是否存在马白蛋白和检测是否 存在马血红蛋白的结果图。优选实施方式的详述在讨论本发明的马溃疡或出血检测试剂盒和方法之前，先简单讨论一下马消化 系统的解剖构造会有帮助。参见图l，显示马20的侧面，图解说明了马的消化道。 马20的消化道可分成前肠，用参考数字22表示，和后肠，用参考数字24表示。马20的消化道从它的嘴26开始，继续延伸通过食道28进入胃30，然后进入小 肠32，胃和小肠一起构成马20的前肠22。马20的前肠22构成马20消化道相对容 量的约35%-40%。从小肠32开始，消化道延伸通过盲肠34、大结肠36和小结肠38终止于直肠 40。马20的消化道的这些组件共同组成马20的后肠24。后肠24构成马20消化道 相对容量的约60-65%。本发明马溃疡或出血检测试剂盒的优选实施方式见图2所示。显示了用于检测 胃溃疡或出血的含有马溃疡或出血检测试剂盒的第一容器50。该第一容器50有一加 入待分析液体的孔52。位于此第一容器50上还有一视窗54，通过此视窗可看到其 中的含检测标记带58和对照标记带60的试验带56，可显示存在胃溃疡或出血。图2还显示了马溃疡或出血检测试剂盒包括的用以检测结肠溃疡或出血的第二 容器70。第二容器70上有一加入待分析液体的孔72。第二容器70上也有一视窗74， 通过此视窗可看到其中的含检测标记带78和对照标记带80的试验带76。当检测到 感兴趣物质的存在时，检测标记带78变得可见，从而显示存在结肠溃疡或出血。虽 然看起来第一容器50和第二容器70彼此靠近，但在如图2所示的实施方式中它们 是分开的。现参见图3，显示装有一容器90的另一种实施方式的检测试剂盒。所述容器卯 上只有一个加入待分析液体的(但更宽)孔92。容器90的两侧还有第一和第二视窗94 和96。通过第一视窗94可看到其中的含检测标记带100和对照标记带102的试验带 98。当检测到感兴趣物质的存在时，检测标记带100变得可见，从而显示存在胃溃疡或出血。将足够的液体通过孔92加入容器90时，对照标记带102变得可见。通过第二视窗96可看到其中的含检测标记带106和对照标记带108的试验带 104。当检测到感兴趣物质的存在时，检测标记带106变为可见，从而显示存在胃溃 疡或出血。将足够的液体通过孔92引入容器90时，对照标记带108变得可见。图2中试验带56和76和图3中试验带98和104的构建是本领域技术人员公知 的。同样，设计具有不同容器的各种其它类型的检测试剂盒的结构也是本领域技术 人员公知的。图2和3所示检测装置的关键部分是用于检测胃和结肠溃疡或出血的 抗体的类型及其衍生物，这将在后面讨论。在讨论之前，先对图2和3所示检测试剂盒的操作进行简要描述。兽医、训马 师或马主人收集待测马的代表性粪便样品(范围从几克到一次完整粪便)。然后将粪便 样品放进容器例如桶或罐或塑料袋中，将其与水溶液(可以是水或含有缓冲剂如盐的 水)通过振荡、搅拌或揉搓相混合。然后，兽医、训马师或马主人用滴眼管或其它常 规装置将几滴液体通过容器50和70上的孔52和72(分别见图1的实施方式)或通过 容器90上的孔92(图2的实施方式)滴入此检测装置。几分钟后，图1实施方式中的对照标记带60和80变得可见，图2实施方式中 的对照标记带102和108变得可见，表示检测试剂盒的操作正确。如果检测到马白 蛋白，图1实施方式的检测标记带58将变得可见，图2实施方式的检测标记带100 变得可见。同样，如果检测到马血红蛋白，图1实施方式的检测标记带78变得可见， 或图2实施方式的检测标记带106变得可见。凭此检测来诊断胃和/或结肠溃疡或出 血，如果检测到任何一种或检测到两种可为立即治疗提供依据。虽然图2和3所示实施方式显示了图2所示实施方式的分开的试验带56和76 和图3所示实施方式的分开的试验带98和104，但本领域技术人员立即就能明白可 将这两种检测合并在一个膜上。此外，除检测标记带显色表示检测到马白蛋白或马 血红蛋白的上述检测之外，也可采用竞争性排除技术，该技术中检测标记带显色表 示没有检测到马白蛋白或马血红蛋白。在本发明马溃疡或出血检测试剂盒及方法的优选实施方式中，当检测到的感兴 趣物质是马白蛋白时，表示存在结肠溃疡或出血，当检测到的感兴趣物质是马血红 蛋白时，表示存在胃溃疡或出血。因为在马粪便中检测到马白蛋白只可能来源于结 肠，因此选择马白蛋白来表明存在结肠溃疡或出血具有特异性。这是因为胃溃疡或 出血到达十二指肠的其它脊椎动物的血液会受到胃酸和胃肽酶的降解，因此在粪便 中检测到马白蛋白根本不可能来源于胃溃疡或出血。然而，胃酸和胃肽酶的作用不可能完全降解或消化马血红蛋白。粪便中检测到 的马血红蛋白可以来源于胃和/或结肠，因此表明有胃溃疡或出血和/或结肠溃疡或出 血。因而，对结肠性和胃渍疡或出血的区分依赖于马白蛋白是否存在。参见图4，可见如果检测到马白蛋白，则肯定存在结肠溃疡或出血。如果未检测 到马白蛋白但检测到马血红蛋白，则有可能存在胃溃疡或出血。如果马白蛋白或马 血红蛋白均未被检测到，则既不存在胃溃疡或出血也不存在结肠溃疡或出血。最后， 如果同时检测到马白蛋白和马血红蛋白，则可能只存在结肠溃疡或出血，或者同时 存在胃溃疡或出血或者结肠溃疡或出血。因此，本领域技术人员将明白本发明的马 溃疡或出血检测试剂盒及方法提供了诊断胃和/或结肠溃疡或出血、和为这些溃疡的 治疗提供了可靠的机制和方法。马白蛋白检测马白蛋白检测是一种高灵敏度的单克隆/多克隆免疫测定法。建立此种免疫测定 方法需要4个步骤，分别称为免疫接种、融合、克隆和制备。第一阶段是免疫接种， 用马类独有的马白蛋白基因序列衍生的马白蛋白肽序列注射家兔、小鼠、大鼠、豚 鼠或其他合适的实验动物。这将激发实验动物的免疫反应，其血液和脾脏产生大量 抗体。约6周时，动物抽血用ELISA试验检验抗体。包括使实验动物血与马血清体外 反应。如果存在抗体，ELISA将发生颜色变化。如果存在的抗体水平不够高，需要 对实验动物进行一次或多次马白蛋白加强注射。可用这些第一批血液来制备多克隆 抗体。此阶段通常需要约3个月。此阶段得到的多克隆抗体可用来构建检测试剂盒。第二阶段是融合，在该阶段中，处死实验动物取其脾脏分离分泌马抗体的细胞。 然后将这些细胞与骨髓瘤细胞系融合使它们可以无限增殖，如Stanker等人的美国专 利第5,552,295号所述，该专利纳入本文中作为参考。 一旦无限增殖化成功，可无限 次培养这些细胞以不断提供抗体。然后将杂交瘤(融合细胞)接种到多个96孔微量滴定板内。用另一次ELISA试验 检测这些细胞，将那些显示能分泌相应抗体的细胞移到另一个微量滴定孔内扩增。 用ELISA试验进一步检测这些细胞得到能产生所需抗体的纯细胞系，此阶段通常需 要约5-6周。第三阶段是克隆，将第二阶段中检测阳性的细胞进行克隆并用ELISA试验进一 步检测。为了得到稳定的克隆可能需要多轮克隆。然后将这些克隆注射小鼠腹腔产 生腹水。纯化腹水液中的单克隆抗体然后备用。本领域技术人员不难明白这种技术将产生特异性针对马白蛋白的新单克隆抗体。此第三阶段通常需要约3个月。可用抗原免疫鸡，在鸡蛋蛋黄中产生抗体。因为鸡能下足够多的蛋来提供抗体， 因此这项技术不需要上述的克隆阶段。然而，这些抗体的纯化阶段与上述类似。第四即最后阶段是制备检测试剂盒。按本领域常规将所述抗体涂布在多孔硝酸 纤维素膜或尼龙膜上。当将马白蛋白放到此检测装置上时，它被吸入通过膜寻找结 合于带有显色剂的标记抗体，最终被检测标记带中的抗体捕获。标记抗体导致颜色 深度变化清楚表明所检测的马粪便中存在马白蛋白。本领域技术人员将会明白这种 新的抗体试验对马白蛋白兼具灵敏度(灵敏度高达约百万分之一(l微克/毫升))和特异 性。马血红蛋白检测马血红蛋白检测是一种高灵敏度的单克隆/多克隆免疫测定法。建立此种免疫测 定方法需要4个步骤，分别为免疫接种、融合、克隆和制备。第一阶段是免疫接种， 用马类独有的马血红蛋白基因序列衍生的马血红蛋白肽序列注射家兔、小鼠、大鼠、 豚鼠或其他合适的实验动物。这将激发实验动物的免疫反应，其血液和脾脏产生大 量抗体。约6周时，动物抽血用ELISA试验检验抗体。包括使实验动物血与马血清体外 反应。如果存在抗体，ELISA将发生颜色变化。如果存在的抗体水平不够高，需要 对实验动物进行一次或多次马血红蛋白加强注射。可用这些第一批血液来制备多克 隆抗体。此阶段通常需要约3个月。此阶段得到的多克隆抗体可用来构建检测试剂J§L 。第二阶段是融合，在该阶段中，处死实验动物取其脾脏分离分泌马抗体的细胞。 然后将这些细胞与骨髓瘤细胞系融合使它们可以无限增殖，如以上面Stanker等人的 专利中所述。 一旦无限增殖化成功，可无限次培养这些细胞以不断提供抗体。然后将杂交瘤(融合细胞)接种到多个96孔微量滴定板内。用另一次ELISA试验 检测这些细胞，将那些显示能分泌相应抗体的细胞移到另一个微量滴定孔内扩增。 用ELISA试验进一步检测这些细胞得到能产生所需抗体的纯细胞系，此阶段通常需 要约5-6周。第三阶段是克隆，将第二阶段中检测阳性的细胞进行克隆并用ELISA试验进一 步检测。为了得到稳定的克隆可能需要多轮克隆。然后将这些克隆注射小鼠腹腔产 生腹水。纯化腹水液中的单克隆抗体然后备用。本领域技术人员不难明白这种技术 将产生特异性针对马血红蛋白的新单克隆抗体。此第三阶段通常需要约3个月。可用抗原免疫鸡，在鸡蛋蛋黄中产生抗体。因为鸡能下足够多的蛋来提供抗体， 因此这项技术不需要上述的克隆阶段。然而，这些抗体的纯化阶段与上述类似。第四即最后阶段是制备检测试剂盒。按本领域常规将所述抗体涂布在多孔硝酸 纤维素膜或尼龙膜上。当将马血红蛋白放到此检测装置上时，它被吸入膜寻找结合 于带有显色剂的标记抗体，最终被检测标记带中的抗体捕获。标记抗体导致颜色深 度变化清楚表明所检测的马粪便中存在马血红蛋白。本领域技术人员将会明白这种 新的抗体试验对马兼具灵敏度(灵敏度高达约百万分之一(l微克/毫升))和特异性。组合检测将马白蛋白检测与马血红蛋白检测组合到一个检测试剂盒中，创建了一种马溃 疡或出血的简单的、费用低廉、高灵敏度和特异性的诊断检测。或者用分开的试剂 盒来提供这两种检测。优选的实施方式中，这两种试验带与同一个单孔相连，从而 应用一次粪便液就能满足两次检测。如果马白蛋白检测结果阳性，表明有结肠溃疡或出血。如果只有马血红蛋白检 测结果阳性，表明有胃溃疡或出血。如果两种结果均为阳性，那么表明要么是结肠 溃疡或出血，要么兼有胃溃疡或出血和结肠溃疡或出血。本领域技术人员将明白此 双重检测可提供方便、非侵入性的胃溃疡或出血(目前诊断困难并且费用昂贵)以及结 肠溃疡或出血(目前的试验不能精确诊断)的检测。虽然本发明的马溃疡或出血检测试剂盒和方法是以诊断马的胃溃疡或出血和结 肠溃疡或出血为目标的优选实施方式，但考虑本发明的范围还包括可用其诊断其它 动物的胃溃疡或出血和结肠溃疡或出血。可专门设计具体动物的特殊溃疡或出血检 测试剂盒用它来检测该具体动物的白蛋白和血红蛋白。或者通过提供能与多种动物 的白蛋白特异性结合的白蛋白抗体以及能与多种动物的血红蛋白特异性结合的血红 蛋白抗体来制造一种通用的动物胃溃疡或出血和结肠溃疡或出血的检测试剂盒。因此，从本发明的优选实施方式详细描述中可以明白，本发明所述马溃疡和消 化道出血检测试剂盒和该试剂盒的使用方法能有效诊断马胃溃疡或出血和结肠溃疡 或出血。本发明的马溃疡或出血检测试剂盒和方法提供了存在胃溃疡或出血和/或结 肠溃疡或出血或二者的高特异性指标。本发明的马溃疡或出血检测试剂盒和方法对 鉴定马溃疡或出血的存在以及鉴定马溃疡的类型或出血部位相当可靠，不会产生过 度的假阳性读数。本发明的马溃疡或出血检测试剂盒和方法操作简单快速，不需要专门技术或培 训，用户就能进行检测。本发明的马溃疡或出血检测试剂盒完全自主，不需要实验室分析或其它处理设备，能在任何地方例如现场进行检测。本发明的马溃疡或出血 检测试剂盒和方法能在几分钟内快速提供检测结果，而不需要更长时间。本发明的马溃疡或出血检测试剂盒的结构建兼具耐用性可长期贮存，此试剂盒 不需要特殊贮存条件具有长期使用寿命。本发明的马溃疡或出血检测试剂盒的构建 便宜而提高了它的市场吸引力，因此具有最广阔的市场前景。最后，本发明的马溃 疡或出血检测试剂盒和方法的所有上述优点和目标的实现不会引起任何实质性相关 缺陷。虽然上述的本发明马溃疡或出血检测试剂盒已得到证明并通过参见本发明的具 体实施方式和应用对其进行了描述，但说明和描述的目的不意味着穷尽或限制本发 明于所公开的具体实施方式
和应用。本领域普通技术的人员将明白到在不背离本发 明思路和范围的前提下，可对本文所述的本发明进行许多改变、修饰、变化或变更。 选择并描述具体实施方式
和应用来提供对本发明原理及其实际应用的最佳说明让本 领域普通技术人员将本发明用于各种实施方式和作出各种修饰以适合所考虑的特定 用途。因此，当按照公平、合法和公正原则进行解释时，所有此类改变、修饰、变 异和变更应视为本文附件的权利要求书所限定的本发明的范围内。
权利要求
1.一种用于检测并定位马溃疡或消化道出血的快速检测试剂盒，其包括第一试验带，用于快速免疫测定或过氧化物酶反应以检测马胃溃疡或出血和/或结肠溃疡或出血；和第二试验带，用于快速免疫测定以检测马结肠溃疡或出血。
2. 如权利要求1所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述第一试验带检测马血红蛋白，所述马血红蛋白的存在指示存在是马胃溃疡或出血和/或结肠溃疡或出血。
3. 如权利要求2所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述第一试验带含有抗 马血红蛋白抗体，所述抗体能特异性结合马血红蛋白。
4. 如权利要求3所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述抗马血红蛋白抗体 结合马血红蛋白的灵敏度等于或大于约百万分之一(l微克/毫升)。
5. 如权利要求3所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述抗马血红蛋白抗体 是单克隆抗体。
6. 如权利要求3所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述抗马血红蛋白抗体 是多克隆抗体。
7. 如权利要求3所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述抗马血红蛋白抗体 分离自接种过的家兔、小鼠、大鼠或豚鼠的血清或浸软的脾脏。
8. 如权利要求3所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述抗马血红蛋白抗体 是用能产生和分泌特异性结合马血红蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系制备的。
9. 如权利要求3所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述抗马血红蛋白抗体 是用免疫细胞与无限增殖骨髓瘤细胞系杂交并表达马血红蛋白抗体来制备的。
10. 如权利要求9所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述免疫细胞分离自 接种过的家兔、小鼠、大鼠或豚鼠的血清或浸软的脾脏。
11. 如权利要求1所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述第一试验带还包 含可证明所述检测正常进行的对照指示物。
12. 如权利要求1所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述第二试验带检测 马白红蛋白，所述马白红蛋白的存在表明马存在结肠溃疡或出血。
13. 如权利要求12所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述第二试验带含有 抗马白蛋白抗体，所述抗体能特异性结合马白蛋白。
14. 如权利要求13所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述抗马白蛋白抗体结合马白蛋白的灵敏度等于或大于约百万分之一(l微克/毫升)。
15. 如权利要求13所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述抗马白蛋白抗体 是单克隆抗体。
16. 如权利要求13所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述抗马白蛋白抗体 是多克隆抗体。
17. 如权利要求13所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述抗马白蛋白抗体 分离自接种过的家兔、小鼠、大鼠或豚鼠的血清或浸软的脾脏。
18. 如权利要求13所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述抗马白蛋白抗体 是用能产生和分泌特异性结合马白蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系制备的。
19. 如权利要求13所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述抗马白蛋白抗体 是用免疫细胞与无限增殖骨髓瘤细胞系杂交并表达马白蛋白抗体来制备的。
20. 如权利要求19所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述免疫细胞分离自 接种过的家兔、小鼠、大鼠或豚鼠的血清或浸软的脾脏。
21. 如权利要求1所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述第二试验带还包 含可显示所述检测正常进行的对照指示物。
22. 如权利要求1所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述第一和第二试验 带包含同时检测马血红蛋白和马白蛋白的单条试验带，所述马血红蛋白的存在表明马 存在胃溃疡或出血和/或结肠溃疡或出血，所述马白蛋白的存在表明马存在结肠溃疡 或出血。
23. —种制备检测并定位马溃疡或消化道出血的快速检测试剂盒的方法，包括 提供第一试验带，该试验带通过快速免疫试验或过氧化物酶反应检测马胃溃疡或出血和/或结肠溃疡或出血；和提供第二试验，该试验带通过快速免疫试验检测马结肠溃疡或出血。
24. 如权利要求23所述的方法，其特征在于，第一试验带检测马血红蛋白，马 血红蛋白的表明马存在胃溃疡或出血和/或结肠溃疡或出血。
25. 如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述第一试验带含有能特异性结 合马血红蛋白的抗马血红蛋白抗体。
26. 如权利要求23所述的方法，其特征在于，第二试验带检测马白蛋白，马白 蛋白的存在表明马存在结肠溃疡或出血。
27. 如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述第二试验带含有特异性结合马白蛋白的抗马白蛋白抗体。
28. 如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述第一试验带还含有证明所述 检测已正常进行的对照指示物，所述第二试验带也含有证明所述检测已正常进行的 对照指示物。
29. 如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述第一和第二试验带包含 同时检测马血红蛋白和马白蛋白的单条试验带。
全文摘要
本发明公开了一种诊断和检测装置以及使用该装置的相关方法，得到马白蛋白和马血红蛋白的抗体用于检测装置、试剂盒，和检测及定位马胃和结肠溃疡或出血的方法中。将待检测马的粪便液滴与缓冲液一起放入容器中彻底混合，然后从容器中取几滴液体放入检测试剂盒中。检测试剂盒中出现可视标记意味着检测到马血红蛋白和马白蛋白标记物，它们分别表明存在胃和/或结肠溃疡或出血。
文档编号G01N33/558GK101221174SQ200710186699
公开日2008年7月16日 申请日期2007年11月20日 优先权日2006年11月28日
发明者F·L·佩里格里尼, S·D·卡特 申请人:自由健康有限公司