一种食品中过敏原的检测方法

专利名称：一种食品中过敏原的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种食品的检测方法，特别是涉及一种对食品中可能存在的过敏原进行快 速检测的方法。
背景技术：
近年來，食物过敏现已成为一个公众性食品安全问题。调査显示全世界范围内有1%~ 2%的成年人对食品过敏，而低于三岁的儿童中有8。/。以上对食品过敏，发达国家过敏患者 的比例更高。产生的临床症状包括皮肤反应(荨麻疹、血管性水肿、湿疹)，呼吸症状(哮喘、 鼻炎)，肠胃症状(呕吐、腹泻、肠胃痉挛)，系统反应(心血管症状包括过敏性休克)等。在 过去的几十年中，食品过敏的发病率和流行情况闩益增加，给临床变态反应学和食品工业 造成了巨大的压力。加上现在人们生活习惯的改变，食品国际贸易日益拓宽，特别是转基 因食品的大量涌现，过敏症状亦趋于多样化、复杂化和严重化。因此，对食品过敏原的检 测与分析就是一个极其重要的问题。目前的研究表明，食品过敏原为分子量介于10 000 70 000之间的蛋白或糖蛋白，是 食品中蛋白质的极小一部分，分别属于不同的蛋白家族。但是极其微量的食品过敏原蛋白 即可引起严重的过敏反应，因此系统全面、精确可靠的食品过敏原检测和分析技术体系成 为必需。目前过敏原的检测主要有以下几种1. 利用抗原抗体特异性反应的原理进行检测通常采用酶联免疫的方法。利用食品过敏原抗体和过敏原进行特异性的结合，然后酶 标记的二抗与过敏原形成复合物，利用显色底物，通过颜色的深浅來判断食品中过敏原的 含量。除此以外，还有双免疫扩散实验、免疫印迹实验、火箭免疫电泳实验等，都是利用 抗原抗体特异性结合的原理进行检测的方法。在实验过程中，由于过敏原非特异性吸附在 酶标板的底部，检测过程中出现非特异性的结合，使得检测结果出现假阳性或假阴性的结 果。2. 利用表达过敏原的基因进行PCR分析食品过敏原检测的一个新靶标就是特殊食品蛋白的cDNA。 DNA分子可以通过PCR技术扩增，在PCR过程中DNA分子的引物也得到了扩增^产物即可利用分子量的大小在琼脂 糖电泳上进行分离。一般来说通过引物的选择可以使具有一定同源性的DNA分子之间的交 叉反应降低到最低程度，尽可能地避免假阳性结果的产生。PCR扩增技术一般用来对各 种食品中经基因修饰的成份(如转基因大豆和转基因玉米)进行检测和定量分析。而直到 现在，只有两种PCR方法专门针对食品过敏原(榛实和小麦)的检测。两种方法均具有很 高的灵敏度，都可以达到0.001%。但是PCR的方法操作复杂，需要专门的技术人员进行检 测，而且成本高，对人体和环境有一定的毒害作用。3. 组胺释放实验组胺释放实验主要是通过食品过敏原激发致敏的靶细胞，引起细胞释放组胺，组胺含 量可应用荧光测定法、放射免疫法等方法测定，与适宜参照进行比较，确定组胺释放率阳 性标准，从而进行过敏原活性测定及鉴定的一类方法。通常用抗IgE抗体作阳性参照，以 样品介质为阴性参照，以排除实验过程中组胺的非特异性释放，因此，必须设样品对照及 非致敏靶细胞对照。有报道利用玻璃纤维包被的微量滴定板來分离组胺与千扰成分，进行 食品中过敏原活性的检测。但影响组胺释放的因素比较多，需要合适的参照系统才能够进 行准确检测，检测成本高，歩骤复杂。4. 过敏原指纹图谱快速检测方法质谱技术是蛋白组学中准确鉴定蛋白的关键性技术，特别是MALDI-TOF/MS (飞行质 谱)常用于肽指纹图谱鉴定。在食物总蛋白双向电泳指纹图谱的基础上，对总蛋白双向电 泳图谱上的单个点进行了飞行质谱分析。以飞行质谱图谱的分子量峰和图谱形状为基本参 数來鉴定特征性的蛋白点。通过分析过敏原蛋白的特征，对食品中过敏原进行检测鉴定。 但是需要专门的大型精密仪器，检测成本高，分析困难，需要专门的检测人员和分析人员。综上所述，虽然目甜研究的有关过敏原检测的方法很多，但都存在检测速度慢，成本 居高不下的问题，而且需要特定的分析仪器进行机读，制约了食品中过敏原检测方法的发 展。发明内容针对上述问题，本发明的目的是提供一种操作简便，结果准确，成本低廉，单样本或 多样本可以进行自由检测的食品中过敏原的检测方法。为了实现上述目的，本发明提供了一种食品中过敏原检测方法，该方法包括如下步骤 a.将可拆式酶标板作为检测食品中过敏原的载体；将常见过敏原的兔源抗体固定在酶标板孑L内；b. 在酶标板孔内加入食品过敏原的抽提物，使食昂中可能存在的过敏原与兔源抗体特 异性结合，形成结合物；c. 再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠源过敏原单克隆抗体，使其与过敏原特异 性结合成为复合物；d. 最后加入过敏原显色剂，在HRP的作用下，使显色剂产生颜色变化，根据颜色的 变化判定样本中过敏原的存在与否及过敏原浓度。步骤(c)中，所形成的复合物为过敏原兔源抗体一过敏原一过敏原鼠单克隆抗体一辣根 过氧化物酶。歩骤(d)中，所述过敏原显色剂为3， 3'， 5， 5'—四甲基联苯胺。 歩骤(d)中，显色剂颜色的变化可采用目测法或酶标仪测定。本发明的优点在于它有效地克服了现有食品中过敏原检测方法存在的不足，提供了一 种能够大量筛选食品中过敏原的方法。与现有技术相比，本发明具有如下显著特点1、 所使用的板条酶标为可拆式，因此单样本或多样本、单项目或多项目可自由检测， 并可根据客户需要随时调整过敏原项目；2、 该方法操作简便，快速，结果准确、特异；3、 利用自产食品过敏原及抗体，可以适用于不同客户的需要；4、 该方法的后续分析可实现自动化，检验报告完整、严谨；5、 检测成本较国外专门的分析仪器和试剂低得多，便于推广和使用。


图l是本发明的流程图。
具体实施方式
下列实施例是对本发明的进一歩解释和说明，对本发明不构成任何限制。 图l示出了本发明的食品中过敏原检测方法的流程，如图示，该方法包括如下步骤a. 将酶标板条作为检测食品中过敏原的载体，该酶标板为可拆式，它活动的置于试剂 盒内，其上具有酶标板孔。酶标板条采用本领域中的常规产品，测试B"U'先将l-100ng/ml 的兔源过敏原抗体IO(HJ包被在酶标板孔内，在4C条件下过夜或在37C条件下孵育2h, 使抗体与酶标板孔紧密结合；b. 在酶标板孔内加入不同浓度梯度的ioow食品组织捣碎液，使食品中可能存在的过敏原与兔源抗体特异性结合，在37'C条件下孵宵30min后使其形成兔源过敏原抗体—过 敏原的结合物；c. 接着加入HRP标记的鼠源过敏原单克隆抗体W(HU，在37'C条件下孵宵40min后 使其与食品中的过敏原特异性结合成为兔源过敏原抗体一过敏原一鼠源过敏原单克隆抗体一HRP复合物；d. 最后在所形成的复合物中加入浓度为4%的过敏原显色剂50^1，在本例中，过敏原 显色剂为3， 3'， 5， 5'—四甲基联苯胺，在HRP的作用下，使显色剂产生颜色变化，加 入50jil终止液终止反应，在本例中终止液为2mol/l的硫酸。根据颜色的深浅判定样本中 过敏原的存在与浓度，在本例中，判断方法是对比样品孔与空白孔(以双蒸水代替样品) 颜色的不同，如果样品孔的颜色明显超过空白孔的颜色，则判断样品中存在过敏原，颜色 越深，说明样品中过敏原的浓度越大。该方法的结果也可以通过配套的过敏原免疫分析系统(即酶标仪)进行分析，该系统 包括免疫分析系统主机、打印机、免疫分析软件，通ik免疫分析系统获得的反应后酶标板 孔内液体的吸光值，并对这些检验原始数据进行分析、结果储存及打印即可实现对样本中 过敏原的存在及浓度的识别，对提高食品的安全性水平有很强的现实意义。本发明通过抗原抗体特异性结合的反应，实现了对食品中各种过敏原进行定性/半定 量的检测。
权利要求
1. 一种食品中过敏原检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤a.将可拆式酶标板作为检测食品中过敏原的载体，将常见过敏原的兔源抗体固定在酶标板孔内；b.在酶标板孔内加入食品过敏原的抽提物，使食品中可能存在的过敏原与兔源抗体特异性结合，形成结合物；c.再加入辣根过氧化物酶标记的鼠源过敏原单克隆抗体，使其与过敏原特异性结合成为复合物；d.最后加入过敏原显色剂，在辣根过氧化物酶的作用下，使显色剂产生颜色变化，根据颜色的变化判定样本中过敏原的存在与否及过敏原浓度。
2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的步骤(d)中，所述过敏原显色剂为 3,3'， 5，5'—四甲基联苯胺。
3. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的步骤(d)中颜色的变化可采用目测 法或酶标仪测定。
全文摘要
本发明公开了一种食品中过敏原检测的方法，它包括如下步骤a.将可拆式酶标板作为检测食品中过敏原的载体，将常见过敏原的兔源抗体固定在酶标板孔内；b.在酶标板孔内加入食品过敏原的抽提物，使食品中可能存在的过敏原与兔源抗体特异性结合，形成结合物；c.再加入辣根过氧化物酶标记的鼠源过敏原单克隆抗体，使其与过敏原特异性结合成为复合物；d.最后加入过敏原显色剂，在辣根过氧化物酶的作用下，使显色剂产生颜色变化，根据颜色的变化判定样本中过敏原的存在与否及过敏原浓度。本方法操作简便，结果准确，成本低廉，单样本或多样本、单项目或多项目均可以自由检测。
文档编号G01N21/78GK101285840SQ20081010908
公开日2008年10月15日 申请日期2008年5月23日 优先权日2008年1月4日
发明者张轶群, 曹立民, 李振兴, 洪 林, 王晓斐, 郭永超 申请人:中国海洋大学