专利名称：一种运用荧光pcr技术检测食品中过敏原榛果成分的方法
技术领域：
本发明涉及属于过敏原检测技术，具体地说是运用荧光PCR反应来检测过敏原的技术， 特别是食品中过敏原榛果成分的方法。
技术背景食物过敏是人们对食物产生的一种不良反应，属于机体对外源性物质的一种变态反应。 近二十年来，食物过敏逐渐被重视，已被认为是严重的公共卫生问题，而且WHO预测食物 过敏可能成为今后最常见的流行病之一。根据美国FDA资料统计，在美国，2%的成年人和 5%的婴幼儿患有食物过敏症，每年大约30000人需要临床紧急治疗，150人死于食物引起的 过敏反应。在所有过敏反应中，花生和树坚果过敏占10-47%。FDA于2005年10月5日发布《食品过敏原标识和消费者保护法案一2004》(FALCPA)， 规定主要食物过敏原包括树坚果等八种食物的成分。日本标签标注也要求将树坚果列为推荐 标注成分。据国外有关学者应用ELISA方法结合PCR—ELISA法对商品进行调查，在41种 市售商品中就有27种含有过敏原榛果成分而未在标签中标识。目前国内外对过敏原榛果成分的检测研究主要集中在ELISA、 PCR—ELISA、 PCR、荧 光PCR及生物传感器检测等方面。目前对于过敏原的检测方法FDA和AOAC共同研究推荐 使用的试剂盒有三种，均为ELISA方法。但如果产品中蛋白质遭到破坏，ELISA方法就检测 不到。而DNA比蛋白质稳定，PCR方法较ELISA方法更为准确，并且避免了对大量抗体的 需求，欧盟、日本和AOAC都建议使用PCR方法进行确证，但没有明确特异性的引物序列。 本研究针对榛果成分rCor a 1.0401 DNA序列设计引物及TaqMan探针，建立了运用荧光PCR 技术检测食品中过敏原榛果成分的方法。 发明内容针对上述情况，本发明克服了现有技术中的缺点，提供了运用荧光PCR技术检测食品中 过敏原榛果成分的方法，具体的讲就是，外切酶探针荧光PCR技术(Taqman探针法)检测 食品中过敏原榛果成分的方法。其技术内容包括使用该方法所使用的引物、探针及构建的报告质粒。其中引物、探针 的全部序列如下引物所用引物序列一CCCCGCTGTTTGTGATAT所用弓1物序列二 ATGATAATAAGCGATACTGTGAT探针所用探针序列TCCCGTTCTCGTCCCTGCGGT以及由上述序列衍生出来的、差别不大于8个碱基的寡核苷酸序列以及每个序列的反义 互补序列，或它们的变体，或它们的部分序列。还包括与之配套的荧光PCR反应条件。 本发明是通过以下技术方案实现的(1) 设计特异性寡核苷酸引物、探针，将探针法探针序列三用FAM荧光基团标记，用 于外切酶探针荧光PCR技术检测；(2) 以探针法引物序列一和探针法引物序列二作为引物，以食品中过敏原榛果成分的相 关基因DNA为模板，进行目的基因的特异性扩增；(3) 扩增过程中使用荧光PCR仪进行实时荧光光强度测量，并将数据传输至电脑通过 配套软件进行分析可以观察到对食品中过敏原榛果成分进行特异性扩增产生的特定波长的 FAM荧光信号，则证明待测样品中存在食品中过敏原榛果成分；如没有观察到任何一种荧光 信号则证明待测样品中不存在食品中过敏原榛果成分。本研究所建立的荧光PCR方法，与花生、麦粉、花生、栗子、松子、夏果、核桃等没有 交叉反应，具有很好的特异性，检测灵敏度可达到5mg/kg。本发明中荧光PCR反应体系中各组分构成比例如下成分 浓度 加样量PCR体系预混合物 2倍 25pL探针法所用引物序列一 10nmol/L 2pL探针法所用引物序列二 10pmol/L 2pL探针法所用探针序列一 10pmol/L 1.5pL DNA样品 5pL双蒸水 14.5nL总体积 50荧光PCR扩增程序如下(1) 50°C 2分钟(2) 95°C 10分钟(3) 95°C15秒(4) 60°C1分钟(5) 回到第3步，重复45次扩增过程中使用荧光PCR仪进行实时荧光光强度测量，并将数据传输至电脑通过配套 软件进行分析可以观察到对食品中过敏原榛果成分进行特异性扩增产生的特定波长的FAM 荧光信号，则证明待测样品中存在食品中过敏原榛果成分；如没有观察到任何一种荧光信号 则证明待测样品中不存在食品中过敏原榛果成分。与现有技术相比，本发明的有益效果是可以检测由于产品中蛋白质遭到破坏，ELISA 方法不能检出的食品中过敏原榛果成分。本发明用PCR的方法扩增靶基因，避免了 ELISA 反应的复杂处理过程，节约时间；PCR鉴定方法受到的其他蛋白的干扰较小，较ELISA方法 更为准确。
图1榛果DNA，荧光信号强度。 图2榛果添加至巧克力样品DNA，荧光信号强度。 图3非榛果的其他坚果DNA，荧光信号强度。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步详细描述。 实施例1样本榛果。 l.样品处理(I )分别取300mg样品研磨成粉状，放入1.5 mL离心管中，加入600 pLCTAB缓冲液(CTAB 55mmol/L、 EDTA20 mmol/L、 Tris 100 mmol/L， 10。/。盐酸调pH值至8.0) ，15 (20mg/ml) 蛋白酶K， 65。C温育30min;加入500 pL酚氯仿异戊醇(25: 24: 1)混合液强烈振荡， 离心12000rpml5min;吸取上清液加入等体积异丙醇，强烈振荡后离心12000 rpm， 10min， 弃上清；用200nLTE溶解(TE量视DNA沉淀多少而定)；加等体积氯仿异戊醇(24: 1) 混合液强烈振荡，离心12000rpml5min;吸取上清液加入等体积异丙醇，强烈振荡后离心 12000 rpm， 10 min，弃上清；用200 pLTE溶解。溶解的溶液作为样品重复上述步骤纯化DNA。用DNA分析仪检测其纯度及浓度。 2. PCR扩增成分 浓度 加样量 PCR体系预混合物 2倍 25pL探针法所用引物序列一 1(Himol/L 2pL探针法所用引物序列二 1Opmol/L 2nL探针法所用探针序列一 lOpmol/L 1.5pL DNA样品 5pL 双蒸水 14.5nL 总体积 50 nL荧光PCR扩增程序如下(1) 50°C 2分钟(2) 95'C 10分钟(3) 95°C 15秒(4) 60°C 1分钟(5) 回到第3步，重复45次PCR共进行6管PCR实验，其中DNA样品所加入的分别为待测样品的原浓度DNA样品; 待测样品的10'倍稀释DNA样品；待测样品的1(^倍稀释DNA样品；待测样品的103倍稀释DNA样品；待测样品的104倍稀释DNA样品；待测样品的105倍稀释DNA样品。 3.被检测样品荧光PCR图谱观察荧光PCR过程中可以观察到各浓度样品分别在28.9、 32.4、 35.4、 37.3、 38.2、 40.28循 环产生了明显的FAM荧光，结果如图l。图1中的各条曲线所代表的FAM荧光强度信号分别是-1. 待测样品的原浓度DNA样品；2. 待测样品的101倍稀释DNA样品；3. 待测样品的102倍稀释DNA样品；4. 待测样品的10M咅稀释DNA样品；5. 待测样品的104倍稀释DNA样品；6. 待测样品的105倍稀释DNA样品； 实施例2样本不含榛果成分的巧克力做添加基质。取l g研磨成糊状的榛果加入99g巧克力中 4(TC水浴融化，搅拌30min，充分混合均匀。取3 g上述添加榛果的巧克力加入27 g巧克力 中，以此不断稀释，最终制成含榛果1000mg/kg、 100mg/kg、 30mg/kg、 20mg/kg 、 10mg/kg、 5mg/kg的巧克力。(1)分别取300 mg样品，放入L5 mL离心管中，加入600 pL CTAB缓冲液(CTAB 55mmol/L、 EDTA20 mmol/L、 Tris 100 mmol/L, 10。/。盐酸调pH值至8.0) ,15 [iL (20 mg/ml)蛋白酶K， 65。C 温育30min;加入500nL酚氯仿异戊醇(25: 24: 1)混合液强烈振荡，离心12000rpm15 min;吸取上清液加入等体积异丙醇，强烈振荡后离心12000卬m， 10min，弃上清；用200 nL TE溶解(TE量视DNA沉淀多少而定)；加等体积氯仿异戊醇(24: 1)混合液强烈振荡，离 心12000rpml5min;吸取上清液加入等体积异丙醇，强烈振荡后离心12000卬m， 10min，弃 上清；用200pLTE溶解。溶解的溶液作为样品重复上述步骤纯化DNA。用DNA分析仪检测其 纯度及浓度。l.样品处理2. PCR扩增成分PCR体系预混合物探针法所用引物序列一探针法所用引物序列二探针法所用探针序列一DNA样品双蒸水总体积荧光PCR扩增程序如下浓度 2倍1Ojxmol/L 1Ojxmol/L25pL l早加样量5pL 14单 50 nL(2) 95'C 10分钟(3) 95。C 15秒(4) 60°C 1分钟(5) 回到第3步，重复45次PCR共进行7管PCR实验，其中DNA样品所加入的分别为含榛果成分为1000 mg/kg、 100mg/kg、 30mg/kg、 20mg/kg 、 10mg/kg、 5 mg/kg样品及空白对照。 3.被检测样品荧光PCR图谱观察荧光PCR过程中可以观察到各浓度样品分别在26.5、 31.5、 32.00、 33.88、 34.29、 37.64循环产生了明显的FAM荧光，结果如图l。图1中的各条曲线所代表的FAM荧光强度信号分别是1. 含榛果成分1000 mg/kg巧克力DNA样品；2. 含榛果成分100 mg/kg巧克力DNA样品；3. 含榛果成分30 mg/kg巧克力DNA样品；4. 含榛果成分20 mg/kg巧克力DNA样品；5. 含榛果成分10 mg/kg巧克力DNA样品；6. 含榛果成分5 mg/kg巧克力DNA样品；7. 空白对照； 实验表明该方法检测灵敏度达到5 mg/kg。实施例3样本榛果、麦粉、花生、栗子、松子、夏果、核桃。1. 样品处理(1)分别取300mg样品研磨成粉状，放入1.5 mL离心管中，加入600 nLCTAB缓沖液(CTAB 55mmol/L、 EDTA20 mmol/L、 Tris 100 mmol/L， 10。/o盐酸调pH值至8.0) ，15 pL (20mg/ml) 蛋白酶K， 65。C温育30min;加入500^L酚氯仿异戊醇(25: 24: 1)混合液强烈振荡， 离心12000rpml5min;吸取上清液加入等体积异丙醇，强烈振荡后离心12000 rpm， 10min， 弃上清；用200pLTE溶解(TE量视DNA沉淀多少而定)；加等体积氯仿异戊醇(24: 1) 混合液强烈振荡，离心12000rpml5min;吸取上清液加入等体积异丙醇，强烈振荡后离心 12000 rpm， 10min，弃上清；用200TE溶解。溶解的溶液作为样品重复上述步骤纯化DNA。 用DNA分析仪检测其纯度及浓度。2. PCR扩增成分 浓度 加样量PCR体系预混合物 2倍 25|aL探针法所用引物序列一 lOpmol/L 2pL探针法所用引物序列
探针法所用探针序列
DNA样品
双蒸水
总体积
10拜ol/L
耻
5jjL 14单 50 >iL
荧光PCR扩增程序如下
(1) 50°C 2分钟
(2) 95°C 10分钟
(3) 95。C 15秒
(4) 60°C 1分钟
(5) 回到第3步，重复45次
PCR共进行7管PCR实验，其中DNA样品所加入的分别为待测样品的原浓度DNA样品。
3.被检测样品荧光PCR图谱观察
荧光PCR过程中可以观察到榛果DNA在29.3循环产生了明显的FAM荧光，结果如图3。 图3中的曲线所代表的FAM荧光强度信号分别是待测样品的原浓度DNA样品。
实验表明该方法特异性强。l为原浓度样品。
序列列表
SEQUENCE USITNG
<110>天津出入境检验检疫局动植物与食品检验中心
<120> —种运用荧光PCR技术检测食品中过敏原榛果成分的方法
<140> 200910068850.4 <141> 2009-05-15
<160> 3<170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA <213>人工合成
<220>
<221> prim一bind
<222> (1)..(18)
<400> 1
ccccgctgtttgtgatat 18
<210> 2
<211> 23
<212> DNA <213>人工合成
<220>
<221> prm一bind<222> (1)"(23)
<400> 2
atgataataagcgatactgtgat 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA <213>人工合成
<220>
<221> prim一bind <222> (1)..(21)
<400> 3
tcccgtttctcgtccctgcggt 2权利要求
1.一种运用荧光PCR技术检测食品中过敏原榛果成分的方法，其特征在于，一种荧光PCR技术是指外切酶探针荧光PCR技术(TaqMan)探针技术检测食品中过敏原榛果成分的方法。
2. 根据权利要求1所述的一种运用荧光PCR技术检测食品中过敏原榛果成分的方法，其特征在于，外切酶探针荧光PCR技术(TaqMan探针法)检测榛仁的方法所使用的引物、探针的序列如下引物所用引物序列一CCCCGCTGTTTGTGATAT所用弓I物序列二 ATGATAATAAGCGATACTGTGAT探针所用探针序列TCCCGTTCTCGTCCCTGCGGT
3. 根据权利要求2所设计的引物序列、探针序列，其特征在于，还包括由上述三条引物和探针衍生出来的、差别不大于8个碱基的寡核苷酸序列以及每个序列的反义互补序列，或它们的变体，或它们的部分序列。
4. 根据权利要求1所述的一种运用荧光PCR技术检测食品中过敏原榛果成分的方法，其特征在于，PCR反应体系中各组分构成比例如下成分浓度加样量PCR体系预混合物2倍25 jjL探针法所用引物序列一10,ol/]L2pL探针法所用引物序列二2jjL探针法所用探针序列一10jimol/Lv1.5(iLDNA样品5jiL双蒸水14,5|aL总体积50
5.根据权利要求1所述的一种运用荧光PCR技术检测食品中过敏原榛果成分的方法，其特征在于，PCR方法中扩增程序为(1) 50°C 2分钟(2) 95" 10分钟(3) 95°C 15秒(4) 60°C1分钟(5) 回到第3步，重复45次。
全文摘要
本发明公开了一种运用荧光PCR技术检测食品中过敏原榛果成分的方法，属于过敏原检测技术，特别是指外切酶探针荧光PCR技术(TaqMan)检测食品中过敏原榛果成分的方法。其技术方案是针对过敏原榛果成分rCor a 1.0401 DNA序列设计引物及TaqMan探针，建立荧光PCR检测方法。本发明包括设计的榛果成分特异性的引物和探针以及与之配套的荧光PCR反应条件。本方法，与花生、麦粉、花生、栗子、松子、夏果、核桃等没有交叉反应，具有很好的特异性，检测灵敏度可达到5mg/kg。本发明所载明的方法可以用于检测食品中的过敏原，避免使用该类食物导致的过敏反应，具有实际意义。
文档编号C12Q1/68GK101643787SQ200910068850
公开日2010年2月10日 申请日期2009年5月15日 优先权日2009年5月15日
发明者培 刘, 吴冬雪, 霞 张, 张海滨, 张海英, 王乃福, 颖 陈, 高旗利 申请人:天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心