专利名称：一种从外周血中大量扩增晚期内皮祖细胞的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种从人外周血中获得较多晚期内 皮祖细胞集落从而可大量扩增晚期内皮祖细胞的培养方法。
背景技术：
Asahara等人于1997年报道成人外周血CD34+细胞群在体外能诱导分化 成内皮样细胞，这类细胞表达一系列内皮细胞抗原，具有在体内参与血管 形成的功能，被命名为内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells, EPCs)， 从而更新了血管新生的概念，即在成人体内不仅存在着人们己经认识到的 血管新生现象(angiogenesis)，也存在着血管生成现象(vasculogenesis)。 随着内皮祖细胞的深入研究，Hur J等报道可将EPCs分为早期EPCs和晚期 EPCs,如他们描述是将一定密度的从外周血来源的单个核细胞种入铺了纤 连蛋白或胶原的培养板，而后用含VEGF的商业培养基培养.培养4-7天有 黏附细胞出现，细胞形态呈梭形，在2-3周生长较旺盛，4周以后开始死亡， 呈现有限的增殖能力，传代次数有限，这类细胞出现较早，称早期内皮祖 细胞，实为比较分化的EPCs，这也是我们平素所指的EPCs。培养晚期出现 的EPCs是在以上的单个核细胞继续培养2-3周开始长出，呈集落状生长， 细胞形态呈鹅卵石状，在4-8周生长旺盛，可以长至12周，增殖能力较强， 能传30代左右，Lin等证明这类细胞来源于骨髓，可能是血液血管干细胞 (hemangioblast)的后代，其生长特征表明它属于分化早阶段的EPCs，称 为晚期内皮祖细胞。功能比较证明晚期EPCs较早期EPCs有更强的整合进 内皮的能力和体内形成血管的能力。由于脐血来源的EPCs在临床应用中存 在着免疫源性问题，所以目前更能接近临床的是自体外周血中的EPCs。但目
前存在的问题是成人外周血中内皮祖细胞的含量稀少，特别是有心血管危 险因素，老龄及心衰需要EPC治疗的患者体内有相对少的EPCs数量，且从 已有临床资料分析得知在一些疾病患者体内EPCs形成血管的功能降低，总 之数量稀少和功能减低的EPCs限制了它在临床的有效应用，所以获得高数量及高质量的EPCs是目前EPCs研究领域急需解决的一个难点。
目前常用的培养晚期EPCs的方法如下用己知的Ficoll密度梯度法 从外周血中分离单个核细胞层；将一定密度的单个核细胞种入铺了纤连蛋 白或胶原的培养皿中，而后用EGM2商业培养基培养,每隔一天更换培养基 一次，培养2-3周开始有呈集落状生长，细胞形态呈鹅卵石状的晚期内皮 祖细胞。传统方法最大缺点是获得晚期内皮祖细胞集落较少，每100ml正 常人外周血只可获得两个晚期内皮祖细胞集落，这样细胞获得率低且用时 长，实验室阶段是浪费所需外周血的数量，在临床应用方面是因细胞获得 量少影响了其临床疗效，阻碍了其临床使用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种从人外周血中获得较多晚期 内皮祖细胞集落从而可大量扩增晚期内皮祖细胞的培养方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是 一种从外周血中 大量扩增晚期内皮祖细胞的方法，其特征在于，将从外周血中分离的单个 核细胞种植到经预处理的铺有以晚期内皮祖细胞或脐带内皮细胞为滋养层 的培养皿中，获得较多的晚期内皮祖细胞集落，再大量扩增晚期内皮祖细 胞。
所述的从外周血中大量扩增晚期内皮祖细胞的方法，按下列步骤进行:
(1) 分离人外周血单个核细胞:取外周血适量，用Ficoll密度梯度法 分离单个核细胞；
(2) 体外培养单个核细胞将单个核细胞种植到预处理的铺有以晚期
内皮祖细胞或脐带内皮细胞为滋养层的胶原包被的培养皿中培养，培养液
为EGM2;
(3) 晚期内皮祖细胞集落数及细胞功能的鉴定进行细胞形态、功能
及细胞表面分子的表达。 .
预铺的滋养细胞经10Gy-20Gy剂量放射处理。 所述的取外周血分离单个核细胞，外周血的量为100ml-400ml。 培养皿中预铺了滋养细胞的细胞浓度为1X103个/m1-1X104个/ml。种植的外周血单个核细胞的浓度为1 X 1()7个/ml-8X 107个/1111。 ^述的包被培养皿的胶原质量百分比浓度为1%。
具体地说，按下列步骤进行
(1) 分离人外周血单个核细胞取人静脉抗凝血100ml，用Ficoll密 度梯度离心法分离单个核细胞；
(2) 培养皿中滋养层细胞的制备将先前培养获得的晚期内皮祖细胞 或脐带内皮细胞1X103个细胞种植到1%胶原包被的6孔板中，以EGM2为培 养液，在37。C，5。/。C02孵箱中培养6小时，待细胞贴壁生长后，经10Gy剂量 照射后，抑制其生长；
(3) 体外培养单个核细胞将分离好的单个核细胞按2.5乂107个细胞 /ml种植到上述的6孔板中，以EGM2为培养液，在37°C, 5°/(￡02孵箱中培养， 每隔一天换液一次；培养第六天开始有集落出现，在生长到培养的第九到 十二天即可以消化集落将细胞继续传代；
(4) 晚期内皮祖细胞特性的鉴定。
本发明的有益效果是提供一种新的外周血晚期内皮祖细胞集落的培 养方法。通过在种植外周血单个核细胞前，在培养皿中提前预铺含晚期内 皮祖细胞或脐带内皮细胞的滋养层细胞，而后将单个核细胞种植进去，从 而将提前两周左右获得了比传统方法多20倍的晚期内皮祖细胞的克隆数 目，可以以有限的外周血获得高质量高数量的具有治疗价值的晚期内皮祖 细胞。
图1是晚期内皮祖细胞集落生长及细胞特有形态说明
A本集落为晚期内皮祖细胞生长的特有集落形态及特有的细胞呈鹅卵 石样生长形态；
B为没有铺滋养层细胞，唯有单个核细胞培养6天时的生长状态；
C为有铺滋养层细胞后种植单个核细胞培养6天时的生长状态，可见有
小的、多的集落存在；
D为有铺滋养层细胞后种植单个核细胞培养9天时的生长状态，可见
有大的，多的集落存在；图2是晚期内皮祖细胞功能鉴定(扩增成集落状生长的晚期内皮袓细 胞与Matrigel混合12小时后可见管状结构形成)；
图3是晚期内皮祖细胞的生物特性的鉴定。
具体实施例方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明 本发明是一种从外周血单个核细胞中大量扩增晚期内皮祖细胞的方 法，是通过以下步骤实现的
(1) 分离人外周血单个核细胞取人静脉抗凝血100ml，用Ficoll密 度梯度离心法分离单个核细胞。
(2) 培养皿中滋养层细胞的制备将先前培养获得的晚期内皮祖细胞
或HUVECs (脐带内皮细胞)1X1()3个细胞种植到1%胶原包被的6孔板中， 以EGM2为培养液，在37。C，5。/。C02孵箱中培养6小时，待细胞贴壁生长后， 经10Gy剂量照射后，抑制其生长。
(3) 体外培养单个核细胞即将分离好的单个核细胞种植到制备好的 6孔板中，以EGM2为培养液，在37。C，5。/。C02孵箱中培养，每隔一天换液一
上述体外培养液是市场上统一销售的培养液；单个核细胞按5X107个 细胞种植到1%胶原包被的6孔板中；胶原的包被浓度为5_10ul/cm2;滋养 层辐射剂量10Gy。
(4)晚期内皮祖细胞特性的鉴定
细胞形态学鉴定每ml外周血经Ficoll密度梯度离心法可获得l-2 X106个单个核细胞，经种植到滋养层细胞上，每隔一天换液一次，在种植 后第六天即出现呈集落状生长，细胞形态呈鹅卵石状的集落，且生长迅速， 每100ml可获得40个左右的晚期内皮祖细胞的集落，如图1。
细胞功能鉴定在培养第9天，将晚期内皮祖细胞集落单独消化后， 经EGM2培养2-3天后，再次消化后取2X 104个细胞与500ulEGM2培养液混 合后种植入有预铺Matrigel基质膜的载玻片的培养皿中，经37°C， 5%0)2孵 箱中培养12小时，有管状结构形成，如图2。
细胞生物学特性鉴定培养的集落细胞消化后，传代至75cm2的培养瓶中继续培养，当达到70%的融合后消化下来，用相应抗体标记，行流式细胞 仪的检测，检测结果如图3: CD3199.9%， CD34 12.4%， eN0S 62. 9%， Fit-1 37. 1%， PIH12 100%， Sendo 43. 4%.
本方法所用试剂均为市场上可购试剂，本方法所用所有实验方法均为 实验室常规实验方法。
本发明用辐射处理的晚期内皮祖细胞或HUVECs为滋养层，而后再植入 从外周血分离的单个核细胞，观察其培植状态，6天后即开始长出细胞集落， 其集落生成的数量为传统培养方法产量的20倍，本细胞集落生长具有晚 期内皮祖细胞特有的特点，即呈集落状生长，细胞形态呈鹅卵石状，这可 与早期内皮祖细胞从形态上明显区分开来。同时这些细胞具有内皮祖细胞 特有的特性功能方面即体外形成血管的能力；细胞生物特性方面具有 表达内皮祖细胞特有的细胞标志。本发明在借鉴了造血干细胞发育不能离 开微环境的理论，通过简单的为单个核细胞提供了滋养层，即微环境，较 传统方法多20倍的晚期内皮袓的集落，明显提高了单位周血的晚期内皮祖 细胞的产出率，且集落的出现时间较传统方法早两周左右，不但节约了大 量的周血需要量和时间，也节约了经济成本，且能获得大量的充足的具有 临床治疗价值的晚期内皮祖细胞，为体外扩增及其临床应用提供必要实验 数据。本发明为有效高速的培养具有临床应用价值的晚期内皮祖细胞提供 了实验方法。
实施例l:
1、 分离人外周血单个核细胞取人静脉抗凝血100ml，用PBS平衡盐溶 液1: 1稀释后，将32ml稀释液慢慢顺管壁铺到含18ml的Ficoll分离液 上，以2000r/m，30分钟离心，密度梯度离心后将白色环状云雾层吸出，再 用PBS平衡盐溶液，以1000r/m， 10分钟洗涤两次，最后用培养液重悬细胞， 并用胎盘蓝记数细胞。
2、 培养皿中滋养层细胞的制备将先前培养获得的晚期内皮祖细胞或 HUVECs 1X1()3个细胞种植到1%胶原包被的6孔板中，以EGM2为培养液， 在37。C，5。/oC02孵箱中培养6小时，待细胞贴壁生长后，经10Gy剂量照射后， 抑制其生长。3、 体外培养单个核细胞即将分离好的单个核细胞以5乂107个单个核 细胞种植到制备好的6孔板中，以EGM2为培养液，在37。C，5。/。C02孵箱中培 养，每隔一天换液一次。
4、 细胞鉴定以以上所描述方法进行。
近年来EPCs的应用已经从动物实验走向了临床，主要集中在①下肢 动脉硬化性闭塞症ASO或Burger氏病，应用后能明显增加病患处的新血管 形成，增加踝压指数，减轻静息痛。②急性心梗后不适合PCI经皮导管干 涉CABG冠状动脉搭桥的患者，EPCs能明显提高冠状动脉的血流灌注并提高 左心室的功能。③未来可以作为基因治疗的一个载体，如做基因修饰后的 EPCs治疗等。相继实验报道在脐血中同样存在着EPCs，为EPCs的广泛应 用奠定了基础，使EPCs的研究成为目前的热点，为心脑血管疾病的治疗开 辟一个美好的前景。EPCs参与血管形成起效关键是所应用的EPCs所处发育 阶段和使用的细胞数量。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的 有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例， 但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
权利要求
1、一种从外周血中大量扩增晚期内皮祖细胞的方法，其特征在于，将从外周血中分离的单个核细胞种植到经预处理的铺有以晚期内皮祖细胞或脐带内皮细胞为滋养层的培养皿中，获得较多的晚期内皮祖细胞集落，再大量扩增晚期内皮祖细胞。
2、 根据权利要求1所述的从外周血中大量扩增晚期内皮祖细胞的方法，其特征在于，按下列步骤进行(1) 分离人外周血单个核细胞取外周血适量，用Ficoll密度梯度法 分离单个核细胞；(2) 体外培养单个核细胞将单个核细胞种植到预处理的铺有以晚期 内皮袓细胞或脐带内皮细胞为滋养层的胶原包被的培养皿中培养，培养液 为EGM2;(3) 晚期内皮祖细胞集落数及细胞功能的鉴定进行细胞形态、功能及细胞表面分子的表达。
3、 根据权利要求1或2所述的从外周血中大量扩增晚期内皮祖细胞的 方法，其特征在于，预铺的滋养细胞经10Gy-20Gy剂量放射处理。
4、 根据权利要求2所述的从外周血中大量扩增晚期内皮祖细胞的方法， 其特征在于，所述的取外周血分离单个核细胞，外周血的量为100ml-400ml。
5、 根据权利要求2所述的从外周血中大量扩增晚期内皮祖细胞的方法， 其特征在于，培养皿中预铺了滋养细胞的细胞浓度为1X103个/m1-1X104 个/ml。
6、 根据权利要求2所述的从外周血中大量扩增晚期内皮祖细胞的方法， 其特征在于，种植的外周血单个核细胞的浓度为lX107个/ml-8Xl()7个 /ml。
7、 根据权利要求2所述的从外周血中大量扩增晚期内皮祖细胞的方法， 其特征在于，所述的包被培养皿的胶原质量百分比浓度为1%。
8、 根据权利要求2所述的从外周血中大量扩增晚期内皮祖细胞的方法， 其特征在于，按下列步骤进行(1)分离人外周血单个核细胞取人静脉抗凝血100ml，用Ficoll密 度梯度离心法分离单个核细胞；'(2)培养皿中滋养层细胞的制备将先前培养获得的晚期内皮祖细胞 或脐带内皮细胞lXl(f个细胞种植到1%胶原包被的6孔板中，以EGM2为培 养液，在37°<:,5%(:02孵箱中培养6小时，待细胞贴壁生长后，经10Gy剂量 照射后，抑制其生长；(3) 体外培养单个核细胞将分离好的单个核细胞按2.5乂107个细胞 /ml种植到上述的6孔板中，以EGM2为培养液，在37°C， 5%(:02孵箱中培养， 每隔一天换液一次，培养第六天开始有集落出现，在生长到培养的第九到 十二天即可以消化集落将细胞继续传代；(4) 晚期内皮祖细胞特性的鉴定。
全文摘要
本发明公开了一种从外周血中大量扩增晚期内皮祖细胞的方法，将从外周血中分离的单个核细胞种植到经预处理的铺有以晚期内皮祖细胞或脐带内皮细胞为滋养层的培养皿中，获得较多的晚期内皮祖细胞集落，再大量扩增晚期内皮祖细胞。本发明通过在种植外周血单个核细胞前，在培养皿中提前预铺含内皮细胞的滋养层细胞，而后将单个核细胞种植进去，从而将提前两周左右获得了比传统方法多20倍的晚期内皮祖细胞的集落数目，可以以有限的外周血获得高质量高数量的具有治疗价值的晚期内皮祖细胞。
文档编号C12N5/08GK101525595SQ20091006851
公开日2009年9月9日 申请日期2009年4月17日 优先权日2009年4月17日
发明者吴立华, 宋增璇, 李尚珠, 翟琼莉, 韩忠朝, 马凤霞 申请人:吴立华