专利名称：一种运用荧光pcr技术检测食品中过敏原杏仁成分的方法
技术领域：
本发明涉及属于过敏原检测技术，具体地说是运用荧光PCR反应来检测过敏原的技术， 特别是食品中过敏原杏仁成分的方法。
背景技术：
食物过敏是人们对食物产生的一种不良反应，属于机体对外源性物质的一种变态反应。 近二十年来，食物过敏逐渐被重视，已被认为是严重的公共卫生问题，而且WHO预测食物 过敏可能成为今后最常见的流行病之一。根据美国FDA资料统计，在美国，2%的成年人和 5%的婴幼儿患有食物过敏症，每年大约30000人需要临床紧急治疗，150人死于食物引起的 过敏反应。在所有过敏反应中，花生和树坚果过敏占10-47%。
FDA于2005年10月5日发布《食品过敏原标识和消费者保护法案一2004》(FALCPA)， 规定主要食物过敏原包括树坚果等八种食物的成分。日本标签标注也要求将树坚果列为推荐 标注成分。据国外有关学者应用ELISA方法结合PCR—ELISA法对商品进行调査，在35种 市售商品中就有7种含有过敏原杏仁成分而未在标签中标识。
目前国内外对过敏原杏仁成分的检测研究主要集中在ELISA、 PCR—ELISA、 PCR、荧 光PCR及生物传感器检测等方面。目前对于过敏原的检测方法FDA和AOAC共同研究推荐 使用的试剂盒有三种，均为ELISA方法。但如果产品中蛋白质遭到破坏，ELISA方法就检测 不到。而DNA比蛋白质稳定，PCR方法较ELISA方法更为准确，并且避免了对大量抗体的 需求，欧盟、日本和AOAC都建议使用PCR方法进行确证，但没有明确特异性的引物序列。
由于杏仁于苹果、梨等同属蔷薇科植物，其主要过敏原蛋白基因序列具有高度的同源性， 本研究针对杏仁成分Pru du 1. 06BDNA序列设计引物及TaqMan探针，建立了运用荧光PCR 技术检测食品中过敏原杏仁成分的方法。
发明内容
针对上述情况，本发明克服了现有技术中的缺点，提供了运用荧光PCR技术检测食品中 过敏原杏仁成分的方法，具体的讲就是，外切酶探针荧光PCR技术(Taqman探针法)检测 食品中过敏原杏仁成分的方法。
其技术内容包括使用该方法所使用的引物、探针及构建的报告质粒。其中引物、探针 的全部序列如下
引物
所用弓1物序列一 TTTGGTTGAAGGAGATGCTC 所用引物序列二 TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG 探针
所用探针序列TCCATCAGCAGATGCCACCAAC
以及由上述序列衍生出来的、差别不大于8个碱基的寡核苷酸序列以及每个序列的反义 互补序列，或它们的变体，或它们的部分序列。还包括与之配套的荧光PCR反应条件。本发明是通过以下技术方案实现的-
(1) 设计特异性寡核苷酸引物、探针，将探针法探针序列三用FAM荧光基团标记，用 于外切酶探针荧光PCR技术检测；
(2) 以探针法引物序列一和探针法引物序列二作为引物，以食品中过敏原杏仁成分的相 关基因DNA为模板，进行目的基因的特异性扩增；
(3) 扩增过程中使用荧光PCR仪进行实时荧光光强度测量，并将数据传输至电脑通过 配套软件进行分析可以观察到对食品中过敏原杏仁成分进行特异性扩增产生的特定波长的 FAM荧光信号，则证明待测样品中存在食品中过敏原杏仁成分；如没有观察到任何一种荧光 信号则证明待测样品中不存在食品中过敏原杏仁成分。
本研究所建立的荧光PCR方法，与坚果类如花生、榛仁、栗子、核桃、松子、夏果，水 果类如苹果、梨、杨梅、李子等没有交叉反应，具有很好的特异性，检测灵敏度可达到5 mg/kg。
本发明中荧光PCR反应体系中各组分构成比例如下
成分 浓度 加样量
PCR体系预混合物 2倍 25pL
探针法所用引物序列一 lO^mol/L 2pL
探针法所用引物序列二 10拜ol/L 2nL
探针法所用探针序列一 lO^mol/L L5pL DNA样品 5jiL
双蒸水 14.5pL
总体积 50 nL
荧光PCR扩增程序如下
(1) 50'C 2分钟
(2) 95°C 10分钟
(3) 95°C 15秒
(4) 60°C1分钟
(5) 回到第3步，重复45次
扩增过程中使用荧光PCR仪进行实时荧光光强度测量，并将数据传输至电脑通过配套 软件进行分析可以观察到对食品中过敏原杏仁成分进行特异性扩增产生的特定波长的FAM 荧光信号，则证明待测样品中存在食品中过敏原杏仁成分；如没有观察到任何一种荧光信号 则证明待测样品中不存在食品中过敏原杏仁成分。
与现有技术相比，本发明的有益效果是可以检测由于产品中蛋白质遭到破坏，ELISA 方法不能检出的食品中过敏原杏仁成分。本发明用PCR的方法扩增靶基因，避免了 ELISA 反应的复杂处理过程，节约时间；PCR鉴定方法受到的其他蛋白的干扰较小，较ELISA方法 更为准确。
图1杏仁添加至巧克力样品DNA，荧光信号强度。 图2购买国际杏仁过敏原参考物质DNA，荧光信号强度。 图3非杏仁的其他坚果及蔷薇科其他植物DNA，荧光信号强度。
具体实施例方式
下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步详细描述。 实施例l
样本不含杏仁成分的巧克力做添加基质。取l g研磨成糊状的杏仁加入99g巧克力中 40'C水浴融化，搅拌30min,充分混合均匀。取3 g上述添加杏仁的巧克力加入27 g巧克力 中，以此不断稀释，最终制成含杏仁1000mg/kg、 100mg/kg、 20 mg/kg 、 10mg/kg、 5 mg/kg 的巧克力。
l.样品处理
(1)分别取300mg样品，放入1.5 mL离心管中，加入600 ^LCTAB缓冲液(CTAB 55mmol/L、 EDTA20 mmol/L、 Tris 100 mmol/L， 10。/o盐酸调pH值至8.0) ，15 (20 mg/ml)蛋白酶K， 65'C 温育30min;加入500jiL酚氯仿异戊醇(25: 24: 1)混合液强烈振荡，离心12000rpm15 min;吸取上清液加入等体积异丙醇，强烈振荡后离心12000 rpm， 10min，弃上清；用200 jiL TE溶解(TE量视DNA沉淀多少而定)；加等体积氯仿异戊醇(24: 1)混合液强烈振荡，离 心12000rpml5min;吸取上清液加入等体积异丙醇，强烈振荡后离心12000 rpm， 10min，弃 上清；用200^LTE溶解。溶解的溶液作为样品重复上述步骤纯化DNA。用DNA分析仪检测其 纯度及浓度。
2. PCR扩增
成分浓度加样量
PCR体系预混合物2倍25nL
探针法所用引物序列一2|iL
探针法所用引物序列二
探针法所用探针序列一10nmol/Ll单
DNA样品
双蒸水
总体积50
荧光PCR扩增程序如下
(1) 50'C 2分钟 (2) 95°C10分钟
(3) 95°C 15秒
(4) 60'C1分钟200910068848.7
(5)回到第3步，重复45次 PCR共进行7管PCR实验，其中DNA样品所加入的分别为含榛果成分为1000 mg/kg、 100mg/kg、 20mg/kg 、 10mg/kg、 5mg/kg样品、空白对照及阳性对照。 3.被检测样品荧光PCR图谱观察
荧光PCR过程中可以观察到各浓度样品分别在23.2、 35.2、 37.0、 38.0、 39.0、 39.1循环 产生了明显的FAM荧光，结果如图l。
图1中的各条曲线所代表的FAM荧光强度信号分别是
1. 阳性对照；
2. 含杏仁成分1000 mg/kg巧克力DNA样品；
3. 含杏仁成分100 mg/kg巧克力DNA样品；
4. 含杏仁成分20 mg/kg巧克力DNA样品；
5. 含杏仁成分10 mg/kg巧克力DNA样品；
6. 含杏仁成分5 mg/kg巧克力DNA样品；
7. 空白对照； 实验表明该方法检测灵敏度达到5 mg/kg。
实施例2
样本国际杏仁过敏原参考物质40mg/kg、 20mg/kg 、 10mg/kg、 5 mg/kg l.样品处理
(1)分别取300 mg样品，放入1.5 mL离心管中，加入600 CTAB缓冲液(CTAB 55mmol/L、 EDTA20mmol/L、 Tris 100 mmol/L， 10。/o盐酸调pH值至8.0) ，15 pL (20mg/ml)蛋白酶K，， 65。C温育30min;加入500 nL酚氯仿异戊醇(25: 24: l)混合液强烈振荡，离心12000rpm 15min;吸取上清液加入等体积异丙醇，强烈振荡后离心12000 rpm， 10min，弃上清；用200 ^LTE溶解(TE量视DNA沉淀多少而定)；加等体积氯仿异戊醇(24: 1)混合液强烈振荡， 离心12000rpml5min;吸取上清液加入等体积异丙醇，强烈振荡后离心12000 rpm， 10min， 弃上清；用200pLTE溶解。溶解的溶液作为样品重复上述步骤纯化DNA。用DNA分析仪检测 其纯度及浓度。
2. PCR扩增
成分浓度加样量
PCR体系预混合物2倍25pL
探针法所用引物序列一1O拜ol/L2joL
探针法所用引物序列二lOpmol/L2pL
探针法所用探针序列一10,1/L1.5|xL
dna样品5jjL双蒸水 总体积
14.5pL 50 (iL
荧光PCR扩增程序如下
(1) 50°C 2分钟
(2) 95°C 10分钟
(3) 95°C 15秒
(4) 60°C 1分钟
(5) 回到第3步，重复45次
PCR共进行5管PCR实验，其中DNA样品所加入的分别40 mg/kg、20 mg/kg 、10 mg/kg、 5 mg/kg参考物质的DNA及空白对照。 3.被检测样品荧光PCR图谱观察
荧光PCR过程中可以观察到各浓度样品分别在32.2、 34.6、 35.1、 36.8循环产生了明显 的FAM荧光，结果如图2。
图2中的各条曲线所代表的FAM荧光强度信号分别是
1. 含40 mg/kg杏仁成分的参考物质DNA样品；
2. 含20 mg/kg杏仁成分的参考物质DNA样品；
3. 含10 mg/kg杏仁成分的参考物质DNA样品；
4. 含5 mg/kg杏仁成分的参考物质DNA样品；
5. 空白对照。
实验表明该方法检测灵敏度达到5 mg/kg得到国际参考物质的确证。 实施例3
样本杏仁；坚果类如花生、榛仁、栗子、核桃、松子、夏果；水果类如苹果、梨、杨 梅、李子。
1. 样品处理
(1)分别取300 mg样品，放入l.5 mL离心管中，加入600 CTAB缓冲液(CTAB 55mmol/L、 EDTA20證ol/L、 TrislOOmmol/L， 100/o盐酸调pH值至8.0) ，15 (20mg/ml)蛋白酶K,, 65。C温育30min;加入500 ^L酚氯仿异戊醇(25: 24: l)混合液强烈振荡，离心12000rpm 15min;吸取上清液加入等体积异丙醇，强烈振荡后离心12000rpm， 10min，弃上清；用200 HLTE溶解(TE量视DNA沉淀多少而定)加等体积氯仿异戊醇(24: 1)混合液强烈振荡， 离心12000rpml5min;吸取上清液加入等体积异丙醇，强烈振荡后离心12000 rpm， 10min， 弃上清；用200pLTE溶解。溶解的溶液作为样品重复上述步骤纯化DNA。用DNA分析仪检测 其纯度及浓度。
2. PCR扩增
成分 浓度 加样量PCR体系预混合物
探针法所用引物序列
探针法所用引物序列
探针法所用探针序列
DNA样品
10nmol/L 10|_imol/L
2nL 耻
14單 50
双蒸水 总体积
荧光PCR扩增程序如下
(1) 50°C 2分钟
(2) 95°C 10分钟
(3) 95。C 15秒
(4) 60°C 1分钟
(5) 回到第3步，重复45次
PCR共进行11管PCR实验，其中DNA样品所加入的分别为待测样品的原浓度DNA
样品o
3.被检测样品荧光PCR图谱观察
荧光PCR过程中可以观察到杏仁DNA在30.2循环产生了明显的FAM荧光，结果如图3 。 图3中的曲线所代表的FAM荧光强度信号分别是待测样品的原浓度DNA样品。
实验表明该方法特异性强。 序列列表
SEQUENCE LISTING
<110>天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心
120> —种运用荧光PCR技术检测食品中过敏原杏仁成分的方法
<140> 200910068848.7 <141> 2009-05-15
<160> 3
<170> Patentln version 3.5 <210> 1<211> 20 <212> DNA <213>人工合成<220><221> prim—bind<222> (1)..(20)<400> 1世ggttgaaggagatgctc 20<210> 2<211> 21<212> DNA <213>人工合成<220><221> prim一bind <222> (1)..(21)<400> 2tagttgctggtgctctttatg 21<210> 3<211> 22<212> DNA <213>人工合成<220><221> prim一bind <222> (1)..(22)<400> 3tccatcagcagatgccaccaac 2权利要求
1.一种运用荧光PCR技术检测食品中过敏原杏仁成分的方法，其特征在于，一种荧光PCR技术是指外切酶探针荧光PCR技术(TaqMan)探针技术检测食品中过敏原杏仁成分的方法。
2. 根据权利要求1所述的一种运用荧光PCR技术检测食品中过敏原杏仁成分的方法,其特征在于，外切酶探针荧光PCR技术(TaqMan探针法)检测杏仁的方法所使用的引物、探针的序列如下引物所用引物序列一TTTGGTTGAAGGAGATGCTC所用弓I物序列二 TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG探针所用探针序列TCCATCAGCAGATGCCACCAAC
3. 根据权利要求2所设计的引物序列、探针序列，其特征在于，还包括由上述三条引物和探针衍生出来的、差别不大于8个碱基的寡核苷酸序列以及每个序列的反义互补序列，或它们的变体，或它们的部分序列。
4. 根据权利要求1所述的一种运用荧光PCR技术检测食品中过敏原杏仁成分的方法，其特征在于，PCR反应体系中各组分构成比例如下-成分浓度加样JPCR体系预混合物2倍25nL探针法所用引物序列一2jiL探针法所用引物序列二10(imol/L2|iL探针法所用探针序列一1 Oj^nol/LDNA样品5pL双蒸水14.5fiL总体积50
5.根据权利要求l所述的一种运用荧光PCR技术检测食品中过敏原杏仁成分的方法，其特征在于，PCR方法中扩增程序为(1) 5(TC 2分钟(2) 95°C10分钟(3) 95。C15秒(4) 60'C1分钟(5) 回到第3步，重复45次。
全文摘要
本发明公开了一种运用荧光PCR技术检测食品中过敏原杏仁成分的方法，属于过敏原检测技术，特别是指外切酶探针荧光PCR技术(TaqMan)检测食品中过敏原杏仁成分的方法。其技术方案是针对过敏原杏仁成分Pru du 1.06B DNA序列设计引物及TaqMan探针，建立荧光PCR检测方法。本发明包括设计的杏仁成分特异性的引物和探针以及与之配套的荧光PCR反应条件。本方法花生、榛仁、栗子、核桃、松子、夏果等没有交叉反应，具有特异性，检测灵敏度可达到5mg/kg。本发明所载明的方法可以用于检测食品中的过敏原，避免使用该类食物导致的过敏反应，具有实际意义。
文档编号C12Q1/68GK101643786SQ200910068848
公开日2010年2月10日 申请日期2009年5月15日 优先权日2009年5月15日
发明者培 刘, 霞 张, 张海滨, 张海英, 徐宝梁, 王乃福, 颖 陈, 高旗利 申请人:天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心