专利名称：一种测定麦汁、发酵液和啤酒中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的方法
技术领域：
本发明是涉及啤酒技术领域，确切的说是采用高效液相色谱测定麦汁、发酵液和
啤酒中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸含量的方法。
背景技术：
酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，都属于氨基酸，最初来源于麦汁，是酵母重要的营养 物质。酵母对这三种氨基酸的代谢会形成相应的高级醇，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸分别同 酪醇、13 _苯乙醇和色醇相对应。这三种醇是啤酒重要的风味物质，检测这三种氨基酸的含 量对控制啤酒风味物质的生成很有意义。而且酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的含量可以反映 麦芽的溶解程度，有利于制麦过程的精细化控制。此外，其含量在发酵前后的变化还可以反 映酵母对氨基酸的同化情况，体现出酵母的发酵活性。可见，这三种氨基酸的含量对于啤酒 生产的过程控制意义重大。 绝大多数的氨基酸检测大都需要衍生，不但成本很高、检测时间很长，而且对系统 的各项要求也很高。 由于酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸具有紫外吸收特性，理论上可以直接用液相色谱 方法进样检测。针对这三种氨基酸的检测，有方法采用PH为2. 80的0. 1M磷酸二氢钾水溶 液作为流动相，检测氨基酸口服液中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。因为磷酸二氢钾是一种 缓冲盐，对液相色谱系统损伤较重，较易造成系统堵塞，影响分析的进行。对于方法的应用 十分不利。还需要准确调节流动相的pH值，操作较为繁琐。 而啤酒中这三种氨基酸的的检测都是采用柱前或者柱后的衍生法，没有直接测定 法的报道。衍生法的准确性受到衍生剂稳定性的影响。而且这些柱前和柱后衍生法都要 用到必需准确调节pH值的三水乙酸钠溶液作流动相。三水乙酸钠溶液同样也是一种缓冲 盐，对体系有损伤。此外，由于这些衍生法还要用乙腈作为有机相，如果缓冲盐和乙腈同时 使用，系统受到污染就更容易造成堵塞。因此，这些方法成本较高，操作繁琐，且耗费时间很 长，检测一个样品的时间大多要1小时左右。
发明内容
为了避免采用各种昂贵的氨基酸衍生试剂、缓冲盐，从而减少缓冲盐对色谱系 统的损害以及节约分析时间，本发明提供了一种待测液直接进样、快速准确检测麦汁、发 酵液和啤酒中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,简称HPLC)方法，对啤酒生产的过程控制很有意义。 本发明所述的测定麦汁、发酵液和啤酒中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸含量的方法 包括 (1)标样配制程序配置酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸标准溶液； (2)待测液前处理程序啤酒或者发酵液经排气后过滤，麦汁直接过滤后进样；
(3)分别针对标样和待测液的梯度洗脱程序流动相A :0. 01%的三氟乙酸水溶 液；流动相D:乙腈； (4)待测液和标样谱图对比检测待测液和标样谱图对比，以保留时间定性，色谱 峰面积定量。 更详细地说，(1)标样配置程序中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸标准储备液分别为 158. 76mg/L， 225. 7mg/L和143. 28mg/L。 (2)待测液前处理程序所述的过滤采用0. 22um针筒式过滤器膜。
(3)分别针对标样和待测液的梯度洗脱程序采用Waters Atlantis C18 (250mm*46mm， id)色谱柱，色谱柱的温度设定在3(TC，检测波长定在280nm。
进行梯度洗脱时，在0-6分钟，流动相A的比例维持在95% ，流动相D的比例维持 在5 %;6. 0-9-6. 5分钟，流动相A的比例由95 %至93 % ，流动相D的比例由5 %变化至7 % ， 这种比例一直保持到22. 0分钟；在22. 0-22. 5分钟，流动相A的比例由93%降至40% ，流 动相D的比例由7%变化升至60%，这种比例从22. 5分钟开始持续到25. 5分钟以彻底清 洗色谱柱；在25. 5-26. 0分钟，流动相A的比例由40%增加到95% ，流动相D的比例由60% 降至5% ，在第26. 0-35. 0分钟，流动相比例一直保持在95%的A，和5%的D，在第35分钟 结束时完成一个待测液的整个梯度运行；每个步骤流速都是1. 0m1/分钟，流动相比例的转 换以等度线性方式进行，即A的变化率和D的变化率相等，并且一直以经过计算的恒定的速 率变化。 (4)待测液和标样谱图对比检测。待测液和标样谱图对比，以保留时间定性，色谱 峰面积定量。计算公式如下C样-^^，
A标 式中C#——待测液中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的含量，单位mg/L ; C标——标样中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的含量，单位mg/L ;
A#——待测啤酒中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的色谱峰面积；
Afe——标样中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的色谱峰面积。 本发明采用直接测定法，不需要使用昂贵的衍生试剂，也无须调节溶液的pH值和 对系统有损伤的缓冲盐，操作简单。液相色谱中采用梯度洗脱的目的在于縮短分析时间，提 高分离效果。啤酒中的含有成千上万种化学成分，组成非常复杂，组分之间的极性差别很 大。为了能够节约分析时间，提高分离效率并且在每次分析结束时有效地清洁色谱柱，使色 谱柱始终保持最佳状态，非常有必要进行梯度洗脱。本发明采用的梯度洗脱程序可以在20 分钟成功分离啤酒中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，并在35分钟内完成整个梯度运行，分 析快速、准确。 通过以上所述的方法，使方法加标回收率为99. 5% -100. 5%，重现性％ RSD(n = 6)《1.8%，最小检出限为0. lmg/L，从而准确、可靠的测定麦汁、发酵液和啤酒中的酪氨 酸、苯丙氨酸和色氨酸含量，具有很高的灵敏度。
图1是在280nm下标样和待测液分离谱图。
其中大写英文字母代表的意义
4
A-发酵液分离谱图 B-麦汁分离谱图 C-啤酒分离谱图 D-标样谱图 图2是在210nm下标样和待测液分离谱图。 其中大写英文字母代表的意义 A-发酵液分离谱图 B-麦汁分离谱图 C-啤酒分离谱图 D-标样谱图
具体实施例方式(1)标样配制 标准储备液用天平分别准确称取酪氨酸0. 0162g，苯丙氨酸0. 0228g，色氨酸0. 0144g，用0. 1M的盐酸水溶液溶解，并定容至100ml，得到酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸标准储备液的浓度为158. 76mg/L，225. 7mg/L和143. 28mg/L。 标准工作液各取0. 4ml的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸标准储备液，混匀，得到包
含这三种氨基酸的混合标准工作液。 (2)待测液前处理 啤酒或者发酵液经排气后，0. 22um针筒式过滤器膜过滤，麦汁直接经0. 22um针筒式过滤器膜过滤后进样。[O(HO] (3)梯度洗脱程序
3. l选择色谱柱 采用Waters公司生产、品牌为Atlantis的C18色谱柱(250mm*46mm， id)。这款色谱柱非常适用于采用水相为主的流动相的分析方法，对于极性较强在普通C18色谱柱上保留很弱的组分有很好的保留和分离特性。检测时色谱柱的温度设定在3(TC，进样量为10ul。酪氨酸的特征吸收波长为(220，274.5)，由于在220nm下待测液中相邻杂质峰的干扰，所以其检测波长定在280nm。苯丙氨酸的特征吸收波长为(210)，检测波长210nm。色氨酸的特征吸收波长为(219. 0，279. 2)，可以在210和280nm检测。检测时使用Waters公司的2996 二极管阵列检测器。
3. 2流动相的配制 流动相A :用移液枪取100ul的三氟乙酸，加入超纯水定容至1L，得到0. 01%的三
氟乙酸水溶液。 流动相D :乙腈 所有流动相均需经0. 45 ii m滤膜抽滤，并用超纯氦脱气5分钟后上机使用。
3. 3梯度洗脱 见表l。采用美国Waters公司提供的Waters 2695高效液相色谱仪。进行梯度洗脱时，在0-6分钟，流动相A的比例维持在95%，流动相D的比例维持在5% ;6. 0_9_6. 5分钟，流动相A的比例由95%至93%，流动相D的比例由5%变化至7%，这种比例一直保持到22. 0分钟；在22. 0-22. 5分钟，流动相A的比例由93 %降至40 % ，流动相D的比例由7%变化升至60%，这种比例从22. 5分钟开始持续到25. 5分钟以彻底清洗色谱柱；在25. 5-26. 0分钟，流动相A的比例由40%增加到95% ，流动相D的比例由60%降至5% ，在第26. 0-35. 0分钟，流动相比例一直保持在95%的A，和5%的D，在第35分钟结束时完成一个待测样品的整个梯度运行；每个步骤流速都是1. 0m1/分钟，流动相比例的转换以等度线性方式进行。即A的变化率和D的变化率是相等的，并且一直以经过计算的恒定的速率变化，即表格中曲线6。曲线6是Waters公司的数据处理软件Empower对流动相换相的一种参数设定。共有l-ll条曲线可供选择。而曲线6是其中最常用的一种形式。
表1 :流动相的梯度洗脱程序
步骤时间~~S S iS~
St印Time Flowrat 水(O. 01°/。三氟乙 乙腈 Curve ^ 、 .
e 酸) acetoni
Water (0. 01%TFA) trile
10. 01.095. 05. 06
26. 01.095. 05. 06
36. 51.093, 07. 06
422. 01.093. 07. 06
22. 51.04060. 06
625. 51.040. 060. 06
726. 01.095. 05. 06
835. 01.095. 05. 06 (4)待测液和标样谱图对比检测 图1 :将和标样直接进样检测，得到在280nm下的分离谱图。其中谱线A是待测发酵液，谱线B是待测麦汁，谱线C是待测啤酒，谱线D是酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的混合标准。谱图上的Tyr是酪氨酸的英文縮写，Phe是苯丙氨酸的英文縮写，Trp是色氨酸的英文縮写。 图2 :将待测液和标样直接进样检测，得到在210nm下的分离谱图。其中谱线A是待测发酵液，谱线B是待测麦汁，谱线C是待测啤酒，谱线D是酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的混合标准。谱图上的Tyr是酪氨酸的英文縮写，Phe是苯丙氨酸的英文縮写，Trp是色氨酸的英文縮写。 待测液和标样谱图对比，以保留时间定性，色谱峰面积定量。计算公式如下
6
「 — A样氺G标
式中C#——待测液中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的含量，单位mg/L ;
C标——标样中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的含量，单位mg/L ;
A样——待测啤酒中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的色谱峰面积；
Afe——标样中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的色谱峰面积；
上述步骤中所采用的试剂如下 试剂DIKMA(迪马)公司的三氟乙酸(分析纯，)，Aldrich(西格玛)公司的酪氨酸(98%，色谱纯)、苯丙氨酸(99%，色谱纯)和色氨酸(99. 5X，色谱纯)，Burdick & Jackson公司的乙腈(色谱纯)，南京化学试剂公司的盐酸(37%，分析纯)。
权利要求
一种采用高效液相色谱测定麦汁、发酵液和啤酒中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的方法，包括标样配制、待测液前处理程序、梯度洗脱程序以及待测液和标样谱图对比检测程序，其特征在于梯度洗脱程序流动相的配置为流动相A0.01％的三氟乙酸水溶液；流动相D乙腈。
2. 根据权利要求1所述的高效液相色谱测定麦汁、发酵液和啤酒中的酪氨酸、苯丙 氨酸和色氨酸的方法，其特征在于所述待测液前处理程序为啤酒或者发酵液经排气后经0. 22um针筒式过滤器膜过滤，麦汁直接经0. 22um针筒式过滤器膜过滤后进样。
3. 根据权利要求1所述的高效液相色谱测定麦汁、发酵液和啤酒中的酪氨酸、苯丙氨 酸和色氨酸的方法，其特征在于所述梯度洗脱程序采用Waters公司的Atlantis C18色谱 柱，色谱柱的温度设定在3(TC，检测波长定在280nm。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的高效液相色谱测定麦汁、发酵液和啤酒中的酪 氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的方法，其特征在于梯度洗脱程序为在0-6分钟，流动相A的比例 维持在95 % ，流动相D的比例维持在5 % ;6. 0-9-6. 5分钟，流动相A的比例由95 %至93 % ， 流动相D的比例由5%变化至7%，这种比例一直保持到22. 0分钟；在22. 0-22. 5分钟，流 动相A的比例由93 %降至40 % ，流动相D的比例由7 %变化升至60 % ，这种比例从22. 5分 钟开始持续到25. 5分钟以彻底清洗色谱柱；在25. 5-26. 0分钟，流动相A的比例由40%增 加到95% ，流动相D的比例由60%降至5% ，在第26. 0-35. 0分钟，流动相比例一直保持在 95%的A，和5%的D，在第35分钟结束时完成一个待测样品的整个梯度运行；每个步骤流 速都是1. 0m1/分钟，流动相比例的转换以等度线性方式进行。
5. 据权利要求4所述的高效液相色谱测定麦汁、发酵液和啤酒中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的方法，其特征在于待测液和标样谱图对比检测计算公式如下CH: ， A血'—.式中C^一待测液中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的含重，单位mg/L ;q示一标样中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的含量，单位mg/L ;A^—待测啤酒中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的色谱峰面积；Ag—标样中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的色谱峰面积。
全文摘要
本发明涉及一种采用高效液相色谱测定麦汁、发酵液和啤酒中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的方法，包括标样配制、待测啤酒前处理程序、梯度洗脱程序以及待测液和标样谱图对比检测程序，其中梯度洗脱程序中流动相A0.01％的三氟乙酸水溶液；流动相D乙腈，在Waters AtlantisC18(250mm*46mm，id)色谱柱上进行，分为七个步骤；每个步骤流速都是1.0ml/分钟，流动相比例的转换以等度线性方式进行。在280nm检测酪氨酸和色氨酸，210nm检测苯丙氨酸和色氨酸。本发明无需衍生，直接测定，不但避免了使用昂贵且不稳定的衍生剂以及对液相色谱系统损害较大的缓冲盐，而且无需调节流动相的pH值，操作简单，方法的加标回收率为99.5％-100.5％，重现性％RSD(n＝6)≤1.8％，最小检出限为0.1mg/L。
文档编号G01N30/34GK101762665SQ20081018759
公开日2010年6月30日 申请日期2008年12月26日 优先权日2008年12月26日
发明者单连菊, 李梅, 杨朝霞, 杨梅, 董建军 申请人:青岛啤酒股份有限公司