专利名称：一种代谢组学技术在宫内发育迟缓中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医用医药技术领域，更具体涉及一种基于核磁共振的代谢组学技术在
检测实验动物或人类宫内发育迟缓中的应用，并有希望扩展至利用代谢组学方法确证生物 标记物，检测实验动物或人类胎儿宫内发育迟缓。
背景技术：
本发明涉及基于核磁共振的代谢组学技术在检测实验动物或人类宫内发育迟缓 中的应用，主要用于各医疗研究单位的产前早期诊断实验室和各个实验室关于产前早期诊 断的研究。将基于核磁共振的代谢组学技术应用在检测实验动物或人类宫内发育迟缓方 面。与其他检测方法相比，其有灵敏、特异、早期、无创或微创等优点，在检测宫内发育迟缓 方面具有广阔的前景。 产前早期诊断的方法在前人的基础上取得进步。其研究热点从基因组学扩展到了 蛋白组学、代谢组学等各种"组学"上来。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后系统生 物学(Cowley AW Jr. The elusive field of systems biology. Physiol Genomics. 2004 ; 16(3) :285-286)的重要组成领域，也是目前组学领域研究的热点之一。代谢组学是通过考 察生物体系受剌激或扰动后(如将某个特定基因变异或环境变化后)，其代谢产物的变化 或代谢产物随时间的变化，来研究生物体系代谢途径的一种技术。其关注的对象主要是各 种代谢路径底物和产物的小分子物质(丽< lkD)。其采用的研究方法有核磁共振波谱、质 谱、高效液相色谱、红外光谱、紫外可见光谱以及各种原子光谱等(管恩泽，等.代谢组学技
术在疾病诊断中的应用.中国临床药理学与治疗学2008 ;01 ;薛骞.代谢组学技术中医药
发展的重大契机.中华中医药学刊2008;01)，其中尤以核磁共振波谱、质谱最为常用。经 过各种方法检测后可以得到海量的数据。对于这些数据，代谢组学也综合了分析化学中的 化学计量学和化学信息学的研究方法。对海量谱学数据进行聚类分析，从中提取出代谢特 征及其相关的变化规律、变化物质，建立相关代谢谱图，从整体上阐释机体的代谢变化与特 性变化之间的有机联系。 基于核磁共振和模式识别的代谢组学技术是目前研究和应用较多的一种(管恩
泽，等.代谢组学技术在疾病诊断中的应用.中国临床药理学与治疗学2008;01;廖沛球，
等.基于NMR的代谢组学方法对硝酸钕急性生物效应的研究.分析化学2008 ;04)，它不需 要进行样品的提取、纯化等复杂的预处理过程，就能够快速地检测机体代谢表达谱的改变， 甚至可以在活体上进行相关检测。它主要利用生物体液和组织的核磁共振谱提供生物体 内全部小分子代谢物的丰富信息，通过模式识别的方法对生物体液和组织进行系统测量、 分析，将这些代谢信息与病理生理过程中的生物学事件关联起来。利用高分辨率核磁共振 技术对完整器官或组织细胞内许多微量代谢组分进行检测，可得到相应的生物体代谢物信 息。核磁共振检测很适合研究代谢产物中的复杂成分。利用核磁共振技术测量生物体液， 可得到丰富的有关生物标志物的大量的、多维的信息。 为了充分抽提所获得数据中的潜在信息，对数据的后期分析需要应用一系列的化学计量学和多元分析方法，因此在数据分析过程中应用的技术也就集中在模式识别技术 上。模式识别是一种借助大量信息和经验进行推理的方法， 一般分为非监督性模式识别和 监督性模式识别两类。近期对各类疾病的代谢组学研究大多来自核磁共振技术，且在临床 早期诊断上充分显示了该技术的潜在优势(周京琳.基于核磁共振的代谢组学技术在生命 科学领域的研究进展.国际口腔医学杂志2008;02)。对肿瘤、先天性遗传疾病等的发病机 制、早期诊断和防治措施等的代谢组学研究可能成为近期研究热点。采用多种技术从多个 角度、多个层次进行全组分研究，设法展现并解析所有谱峰，从而从整体上去研究机体代谢 的全部组分，应该是代谢组学分析技术发展的方向。目前，国内外对基于核磁共振的代谢组 学技术在生命科学领域的研究是一项刚开始的全新的研究课题。 至今，临床上宫内发育迟缓的传统诊断方法有B型超声检查、脐动脉血流速频分 析以及系列生化测定法(赵三存.胎儿宫内发育迟缓的早期诊断.中国实用妇科与产科杂 志1994 02)。 B超通过测量胎头双顶径、头围、胸径、腹径、股骨长度等值，可用来诊断宫内 发育迟缓，但该法存在确定时间晚(24周左右)的缺点，对于及时发现并予以纠正治疗是极 其不利的，超声辐射及热效应对胎儿的毒性更是让许多孕妇对这种方法敬而远之。而多普 勒脐动脉血流频谱分析技术特异性不高，已有的系列生化检测方法特异性也不高且敏感性 较低，有些是有创性检查(如羊水检查)，这些方法只能作为辅助诊断方法，并且由于其创 伤风险较大，不值得提倡。 基于核磁共振技术的代谢组学方法已广泛应用于生物代谢、新药研发、毒理学研 究、疾病预防和诊断等领域(陈慧梅，等.代谢组学及其研究方法和应用.肾脏病与透析肾 移植杂志2005 ;14 :59 ;李灏，等.代谢组学技术及其在临床研究中的应用.遗传2008 ;30 : 389 ;施钰琳，等.代谢组学及其应用研究新进展.医学综述2007 ;13 :1543)。采用核磁共 振代谢组学技术检测胎儿和母体生物代谢变化，以提供全息定量信息，寻找和确证母体外 周血中反映宫内发育迟缓的特异性生物标志物，用于临床早期诊断。该检测指标的灵敏性 和变化时间将远远优于现有的B超检查方法。而且目前尚未见与产前早期诊断相关的代谢 组学研究的报道，经检索未见到一种代谢组学技术在宫内发育迟缓中的应用或在国内外尚 未见相似报道。
发明内容
本发明是一种代谢组学技术在宫内发育迟缓中的应用。目的是为了早期对检测宫 内发育迟缓进行诊断提供依据。本发明具有灵敏性高、特异性好、早期、无创或微创等优点。
本发明成功建立了多种外源物(如尼古丁、咖啡因、乙醇)所致实验动物宫内发育 迟缓的有效模型，为后续宫内发育迟缓的研究提供了模型基础。 本发明的动物模型所用动物为Wistar大鼠，来自湖北省预防医学科学院的实验 动物中心，也可以为其他啮齿类动物。 本发明的目的是为早期检测宫内发育迟缓提供了依据，即寻找怀孕母体外周血中 能特异性反映外源物所致宫内发育迟缓的生物标志物，并建立检测该生物标志物变化的方 法。 本发明是这样实现的代谢组学(刘昌孝，等.代谢组学的发展与药物研究开发 用.天津药学2005;17)是将高分辨核磁共振波谱的分析解读或质谱的代谢产物分子质量测定与多变量数据分析为基础的模式识别有机地结合在一起，其主要研究的是作为各种代 谢路径的底物和产物的小分子代谢物(丽< 1000)。其样品主要是尿液、血浆或血清、唾液 以及细胞/组织的提取液。为回答生物代谢的变化问题提供全息定量信息的检测方法，基 于核磁共振技术的代谢组学方法(李芳，等.基于核磁共振的代谢组学研究及其应用.海 峡药学2008 ;03)已广泛应用于生物代谢、新药研发、毒理学研究、疾病预防和诊断等领域。 其中，在毒理学研究中，通过分析与毒性作用的靶位和作用机制密切相关的生物体液中的 代谢产物谱随时间的变化，可以确定毒性作用的靶器官和组织、毒性作用的过程和生物标 志物。因此，基于核磁共振技术的代谢组学可以反映出毒性效应的终点状况，并可以与生化 和病理改变联系起来。本发明将基于核磁共振的代谢组学技术应用于外源物发育毒性的研 究，建立基于核磁共振波谱技术的体液定量代谢组学方法，通过检测多种生物标本(母体 血、胎血、羊水)的核磁共振波谱，分析正常和宫内发育迟缓状态下实验受孕动物或人体生 物标本中的波谱变化，寻找母体外周血中能特异性反映外源物所致宫内发育迟缓的核磁共 振谱。为进一步利用现代分析方法(如蛋白质技术等)，建立基于核磁共振的早期检测技 术，研制出能简便、灵敏、特异、快速的检测该生物标志物变化的临床核磁共振早期检测试 剂盒，提供理论依据。因此，本发明为基于核磁共振波谱代谢组学技术在宫内发育迟缓中应 用。 下面详细说明实现本发明的总的实施方法和具体的实施方法
本发明从系统生物学(Cowley AW Jr. The elusive field of systems biology. PhysiolGenomics. 2004 ;16(3) :285-286)的角度出发，运用基于核磁共振等代谢组分析鉴 定原理成批分析正常受孕和外源物(尼古丁、咖啡因、乙醇)所致宫内发育迟缓模型大鼠的 不同孕期生物样本(包括母体血、胎血、羊水)的核磁共振波谱，并利用模式识别进行分析 比较正常受孕和外源物所致宫内发育迟缓模型大鼠不同孕期的生物样本的核磁共振波谱， 并确定特异性核磁共振波谱，以定性或定量分析宫内发育迟缓病特异核磁共振波谱为原 理，为后续研究提供理论和实验依据。 —种代谢组学技术在宫内发育迟缓中的应用其步骤是 (1)收集样本收集正常受孕和宫内发育迟缓实验受孕动物或孕妇模型不同孕期 的生物样本(包括母体血、胎血、羊水)，在液氮中速冻，并在超低温冰箱(_78°C--82°C)中 保存待测。 (2)核磁共振波谱测定使用配置在600腿z核磁共振谱仪上的超低温 (_258°C -262°C)探头，采集生物样本的高分辨核磁共振质子谱CH核磁共振)。将分别 采集血浆的全谱、CPMG自旋回波(T2加权)谱以及扩散加权编辑谱。采集羊水的N0ESYPR1D 谱。固相萃取-LC-NMR联用系统，2D C0SY， T0CSY， HSBC， HMQC等NMR谱图将用于未知代谢 物结构和特征的确定。 (3)模式识别法分析动物代谢组谱图将使用多变量数据分析为基础的模式识别 方法(本发明中主要应用主成分分析(PCA)和0PLS-DA)，对步骤(2)中所得的代谢组谱图 进行分析，通过和正常受孕样品数据的比较，寻找由胎儿发育毒性引起的实验模型系统的 代谢组变化，进一步从代谢组变化中确定特异的核磁共振波谱。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果 1)灵敏基于核磁共振波谱技术的体液定量代谢组学方法，是通过检测怀孕母体外周血的核磁共振波谱来反映宫内发育迟缓胎儿的内环境代谢改变，因此与现有通过B超 等技术进行产前检查相比，其检测结果具有高灵敏性。 2)特异系列生化及其他检测方法往往特异性不高，而本发明可以找到特异的核 磁共振图谱。 3)早期现有技术主要以B超为主，B超诊断宫内发育迟缓最早为人体孕中晚期 (24周)，而本发明可将诊断时间至少提前到孕早中期(8-12周)，可用于临床宫内发育迟缓 的早期诊断。 4)无创或微创某些检测方法具有创性(如羊水检查)，而本发明的结果最终只需 取少量怀孕母体的外周血进行检测，因此具有无创性或微创性。 5)本发明一种代谢组学技术在宫内发育迟缓中的应用至今在国内外尚未见相似 报道。
图1.母鼠血浆^ CPMG核磁共振图.(A)空白对照组；(B)尼古丁组；(C)咖啡因 组. 图2.胎鼠血浆^ CPMG核磁共振图.(A)空白对照组；(B)尼古丁组；(C)咖啡因 组. 图3.羊水1H N0ESYPR1D核磁共振图.(A)空白对照组；(B)尼古丁组；(C)咖啡因 组. 图4.基于母鼠血浆IH CPMG NMR谱的主成分分析得分图(a)和OPLS-DA装载图 (b)(空白对照组B ;尼古丁组參). 图5.基于母鼠血浆IH CPMG NMR谱的主成分分析得分图(a)和OPLS-DA装载图 (b)(空白对照组B ;咖啡因组參). 图6.基于胎鼠血浆IH CPMG NMR谱的主成分分析得分图(a)和OPLS-DA装载图 (b)(空白对照组B ;尼古丁组參). 图7.基于胎鼠血浆1H CPMG NMR的主成分分析得分图(a)和OPLS-DA装载图(b) (空白对照组B ;咖啡因组參). 图8.基于羊水1H N0ESYPR1D NMR谱的主成分分析得分图(a)和OPLS-DA装载图 (b)(空白对照组B ;尼古丁组參). 图9.基于羊水1H N0ESYPR1D NMR谱的主成分分析得分图(a)和OPLS-DA装载图 (b)(空白对照组B ;咖啡因组參).
具体实施例方式
下面结合具体实施例子，进一步阐述本发明。 实施例1尼古丁和咖啡因所致宫内发育迟缓模型的建立 实施过程 实验方法大鼠于每日6PM按雌雄比2 : l合笼，次晨观察雌鼠阴栓和镜检，查 到阴栓或精子之日为受孕Od。将孕鼠随机分为3组正常对照组、尼古丁组、咖啡因组，每 组10只，于孕12d开始，分别给予尼古丁 2mg kg—1 d—1皮下注射，咖啡因组给予咖啡因
6180mg kg—1 d—1灌胃，正常对照组给予等体积蒸馏水。孕20d先用异氟醚麻醉孕鼠，再经 颈动脉取部分血，肝素抗凝并制备血浆。迅速取出子宫，先用干净的注射器吸取每只胎鼠羊 水，并加入1 %的叠氮化钠1滴防腐。取胎鼠血，用EDTA抗凝，所有胎鼠血合并，离心制备血 浆。收集母体血浆、胎鼠血浆和羊水，在液氮中速冻，并在超低温(-78°C -82°C )冰箱中保 存待测。根据低于正常对照组胎仔平均体重的两个标准差作为宫内发育迟缓发生的诊断标 准，确定宫内发育迟缓模型。 实验结果如表1所示，和正常对照组比较，孕期咖啡因和尼古丁暴露组大鼠胎儿
出生体重和胎盘重明显降低，根据宫内发育迟缓的诊断标准，咖啡因和尼古丁暴露组宫内
发育迟缓发生率分别为45. 9%和73. 9%。提示宫内发育迟缓模型成功。 表1.大鼠孕期咖啡因和尼古丁暴露对胎仔重、胎盘重和宫内发育迟缓发生率的
影响.
组另lj胎仔体重(g)胎盘重(g)宫内发育迟缓率(％)
正常对照组3.9 ±0.30.48 ±0.070
尼古丁处理组3.2 ± 0.2"0.32 ± 0.09"73.,
咖啡因处理组3.4 ± 0.3*求 0.33 ±0.1245.(T S士s， n = 10.与正常对照组相比，**P < 0. 01. 实施例2基于核磁共振代谢组学技术在宫内发育迟缓模型大鼠中的应用
(1)动物处理与取材大鼠受孕、给药及处理方法见实施例1。孕20d先用异氟醚 麻醉孕鼠，再经颈动脉取部分血，肝素抗凝，制备血浆。收集正常受孕和咖啡因所致宫内发 育迟缓模型大鼠不同孕期的生物样本(包括母体血、胎血和羊水)，制备血浆，在液氮中速 冻，并在超低温(-78°C -82°C )冰箱中保存待测。 (2)核磁共振波谱测定将血浆样本配成生理盐水的含钠和钾的磷酸缓冲液，使 其浓度为30mmol/L，pH值为7. 4。将羊水配成含钠和钾的磷酸缓冲液，使其浓度为150mmo1/ L，pH值为7. 4。使用配置在600MHz核磁共振谱仪上的超低温(-258 °C -262 °C )探头，采 集大鼠的母体血浆(图1)、胎血浆(图2)和羊水(图3)的高分辨核磁共振质子谱。
(3)识谱及数据处理分别采集血浆的全谱、CPMG自旋回波(T2加权)谱以及扩 散加权编辑谱。采集羊水的N0ESYPR1D谱。2D C0SY， T0CSY， HSBC， HMQC等NMR谱图用于谱 峰的归属和未知代谢物结构和特征的确定。将采集到的NMR谱用TOPSPIN 2. 0系列软件进 行相位校正，基线校正，谱峰定标等处理，然后用AMIX软件进行谱峰的积分和数据归一化， 用SIMCA-P+11软件进行PCA和OPLS-DA，分别对尼古丁和咖啡因所致宫内发育迟缓大鼠的 母体血浆(图4和图5)、胎血浆(图6和图7)和羊水(图8和图9)的代谢组谱图进行分 析，最后在MATLAB上用自编程序进行代谢物相关系数的图形描述。 (4)比较和确定差异性特征波谱通过和正常受孕样品数据的比较，寻找胎鼠发 育毒性引起实验模型系统的代谢组变化。建立生物标志物图谱。初步结果表明，尼古丁和 咖啡因均可引起母体血浆、胎鼠血浆及羊水中一些主要代谢产物的改变，且尼古丁的影响
7要大于咖啡因；咖啡因对咖啡因孕鼠和胎鼠均有毒性作用，其中对胎鼠的毒性作用要大于 孕鼠。
权利要求
一种核磁共振的代谢组学技术在检测宫内发育迟缓中的应用，其步骤为A、收集样本；B、核磁共振波谱测定；C、模式识别法分析动物代谢组谱图。
2. 如权利要求1所述的一种核磁共振的代谢组学技术在检测宫内发育迟缓中的应用， 其特征为收集样本是收集正常受孕和宫内发育迟缓实验受孕动物或孕妇模型不同孕期的生物样本包括母体血、胎血、羊水，在液氮中速冻，并在超低温冰箱-78t: —82t:中保存待
3. 如权利要求l所述的一种核磁共振的代谢组学技术在检测宫内发育迟缓中 的应用，其特征为核磁共振波谱测定是使用配置在600MHz核磁共振谱仪上的超低 温-25『C -2621:探头，采集生物样本的高分辨核磁共振质子谱；将分别采集血浆的全 谱、CPMG自旋回波谱以及扩散加权编辑谱；采集羊水的N0ESYPR1D谱；固相萃取-LC-NMR联 用系统，2D C0SY， T0CSY， HSBC， HMQC等NMR谱图将用于未知代谢物结构和特征的确定。
4. 如权利要求1所述的一种核磁共振的代谢组学技术在检测宫内发育迟缓中的应用， 其特征为模式识别法分析动物代谢组谱图是将使用多变量数据分析为基础的模式识别方 法，对步骤B中所得的代谢组谱图进行分析，通过和正常受孕样品数据的比较，寻找由胎儿 发育毒性引起的实验模型系统的代谢组变化，进一步从代谢组变化中确定特异的核磁共振 波谱。
全文摘要
本发明涉及一种代谢组学技术在宫内发育迟缓中的应用。其主要特征是从系统生物学(Cowley AW Jr.The elusive field of systems biology.Physiol Genomics.2004；16(3)285-286)的角度出发，应用基于核磁共振波谱技术的代谢组学方法，寻找实验受孕动物或孕妇母体外周血中能特异性反映宫内发育迟缓的核磁共振谱图，为进一步诊断宫内发育迟缓提供依据。分析时用核磁共振技术检测正常怀孕和宫内发育迟缓实验受孕动物或孕妇的生物样本(包括母体血、胎血和羊水)，采集代谢组谱图，并利用模式识别法分析代谢组谱图，通过分析比较，确定宫内发育迟缓的代谢组变化，从代谢组变化中得到一或多个(组)反映宫内发育迟缓的核磁共振谱图，为后续进一步确证生物标记物，代谢组学技术在宫内发育迟缓中的应用提供了理论和实验依据。具有灵敏性高、特异性好、早期、无创或微创等优点。
文档编号G01N24/08GK101713753SQ20081019719
公开日2010年5月26日 申请日期2008年10月8日 优先权日2008年10月8日
发明者冯江华, 刘岩松, 唐惠儒, 张本坚, 李小军, 梁赅, 汪晖, 鄢友娥 申请人:武汉大学