靶向代谢物的检测的制作方法

专利名称：靶向代谢物的检测的制作方法
靶向代谢物的检测相关申请本申请是国际PCT申请，其要求2010年7月7日提交的美国临时申请第61/362，193号的优先权。前述申请的整个文本在此通过引用全文并入。
背景技术：
使用复合式生物/无机设备来快速且灵敏地生物感测核酸和蛋白对识别生物医学的病原体和生化恐怖分子重要性提供法庭证据以及用于识别已知的基因型至关重要。Fl-ATP酶最近已经用于构建能够用于单分子检测(美国专利第6，989，235号)的纳米尺度旋转设备(美国专利公布第2006/0110738号)。这些文件证明了使用生物分子来利用由显微镜可见的检测信号提供DNA的单分子检测的可行性。本发明涉及可以用于检测感兴趣的特定的蛋白的靶的检测方法。发明简述本发明提供了用于高度灵敏地检测感兴趣的代谢物的方法和组合物包括使用包括锚固部件、桥连部件以及 信号产生部件的纳米检测设备，其中锚固部件是分子马达，信号产生部件是纳米棒且桥连部件是特异性地结合于感兴趣的代谢物的蛋白。在第一实施方案中，本发明涉及纳米检测设备，其包括锚固部件、桥连部件以及信号产生部件，其中:(a)锚固部件包括经由定点突变修饰的Fl-ATP酶分子，以便包括在Fl-α或Fl-β子单位的N端上的组氨酸标签(his-tag)和Fl-Y子单位上的半胱氨酸，其中多个Fl-ATP酶分子被固定至显微镜载玻片的表面，使得每一个Fl-ATP酶分子被定位成所述Fl-Y子单位远离所述显微镜载玻片的所述表面，其中所述F1-γ子单位上的所述半胱氨酸被生物素化；(b)所述桥连部件包括结合至或以其他方式应答于待检测的小分子代谢物的存在的蛋白，其中所述桥连部件内的所述蛋白被生物素化并通过生物素-亲和素-生物素链由所述锚固部件的生物素化的Fl-Y子单位连接于所述锚固部件；以及(C)所述信号产生部件包括电磁检测探针，所述电磁检测探针已经在待检测的所述代谢物的存在下，被特异性地结合于所述桥连部件的所述蛋白的部分官能化。 更具体地，所述桥连部件内的所述蛋白是转录调控蛋白，所述转录调控蛋白包括针对特异性DNA序列的结合位点和针对该小分子代谢物的结合位点且所述信号产生部件包括已知结合所述转录调控因子的特异性DNA序列。例如，所述转录调控蛋白是转录激活蛋白，其中当所述特异性DNA序列结合于所述转录激活蛋白时出现所述设备的组装仅发生在所述小分子代谢物结合于所述转录调控蛋白的存在下。可选择地，所述转录调控蛋白是转录阻遏蛋白，其中当所述特异性DNA序列结合于所述转录阻遏蛋白时出现所述设备的组装且所述电磁检测探针在所述小分子代谢物的存在下与所述蛋白分离。
在另一个可选择方案中，所述桥连部件内的所述蛋白是信号转导蛋白，所述信号转导蛋白包括针对该小分子代谢物的结合位点，其中所述信号转导蛋白在结合于所述小分子代谢物时改变构象，且所述信号产生部件包括检测所述信号转导蛋白的所激活的构象的抗体。在又一个可选择方案中，所述桥连部件内的所述蛋白是DNA证明蛋白(proofingprotein)，其识别DNA序列中的修饰碱基，且所述信号产生部件包括对待检测的DNA序列是互补的DNA序列，其中当待检测的所述DNA与固定于所述电磁检测探针的所述DNA序列进行DNA碱基配对时发生所述设备的组装。在本文描述的任一个纳米检测设备中，电磁指示器包括至少一个光颗粒、磁颗粒和热颗粒。在特别优选的实施方案中，电磁指示器是金属纳米棒，优选金纳米棒。在某些实施方案中，电磁指不器包括包含至少一个突光珠和光散射颗粒的光指不器。 在优选的纳米检测设备中，电磁指示器是来自元素金属组的胶态颗粒。还设想了使用方法。例如，本发明描述了一种用于检测分子是否结合了转录调控蛋白的激活因子的方法，包括:(a)制备纳米检测设备，其中所述设备包括锚固部件、桥连部件以及信号产生部件，其中:i)锚固部件包括经由定点突变修饰的Fl-ATP酶分子，以便包括在Fl-α或Fl-β子单位的N端上的组氨酸标签和Fl- Y子单位上的半胱氨酸，其中多个Fl-ATP酶分子被固定至显微镜载玻片的表面，使得每一个Fl-ATP酶分子被定位成所述Fl- Y子单位远离所述显微镜载玻片的所述表面，其中所述F1-γ子单位上的所述半胱氨酸被生物素化；ii)所述桥连部件包括结合至或以其他方式应答于待检测的小分子代谢物的存在的蛋白，其中所述桥连部件内的所述蛋白被生物素化并通过生物素-亲和素-生物素链由所述锚固部件的生物素化的Fl-Y子单位连接于所述锚固部件；以及iii)所述信号产生部件包括电磁检测探针，所述电磁检测探针已经在待检测的所述代谢物的存在下，被特异性地结合于所述桥连部件的所述蛋白的部分官能化；(b)使所述设备与靶向小分子代谢物接触；(c)在允许Fl-ATP酶的活性旋转所述Fl- Y子单位的条件下，向所述设备中添加ATP ；以及(d)比较在靶向代谢物存在下由结合于所述显微镜载玻片的旋转的电磁检测探针产生的信号，与在所述靶向代谢物不存在下由所述探针产生的所述信号，其中在所述代谢物存在下，所述信号的增强表明所述代谢物结合于所述转录调控蛋白。还设想了一种用于检测结合阻遏蛋白的分子的方法，包括:(a)制备纳米检测设备，其中所述设备包括锚固部件、桥连部件以及信号产生部件，其中，所述桥连部件内的所述蛋白是转录调控蛋白，所述转录调控蛋白包括针对特异性DNA序列的结合位点和针对该小分子代谢物的结合位点且所述信号产生部件包括已知结合所述转录调控因子的特异性DNA序列；(b)使所述设备与靶向小分子代谢物接触；(c)在允许Fl-ATP酶的活性旋转所述Fl- Y子单位的条件下，向所述设备中添加ATP ；以及 (d)比较在靶向代谢物存在下由结合于所述显微镜载玻片的旋转的电磁检测探针产生的信号，与在所述靶向代谢物不存在下由所述探针产生的所述信号，其中在所述代谢物存在下，所述信号的减弱表明所述代谢物结合于所述阻遏蛋白。在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于检测分子结合于信号转导蛋白的方法，包括:(a)制备本发明的纳米检测设备，其中所述桥连部件内的所述蛋白是信号转导蛋白，所述信号转导蛋白包括针对小分子代谢物的结合位点，其中当所述信号转导蛋白结合于所述小分子代谢物时改变构象，且所述信号产生部件包括抗体，所述抗体检测所述信号转导蛋白的激活构象；(b)使所述设备与靶向小分子代谢物接触；(c)在允许Fl-ATP酶的活性旋转所述Fl- Y子单位的条件下，向所述设备中添加ATP ；以及(d)比较在靶向代谢物存在下由结合于所述显微镜载玻片的旋转的电磁检测探针产生的信号，与在所述靶向代谢物不存在下由所述探针产生的所述信号，其中在所述代谢物存在下，所述信号的增强表明所述代谢物结合于所述信号转导蛋白。在另一个实施方案中，本发明提供了一种证明DNA的方法，包括:(a)制备本发明的纳米检测设备，其中所述桥连部件内的所述蛋白是DNA证明蛋白，所述DNA证明蛋白识别DNA序列中的修饰碱基，且所述信号产生部件包括对待检测的DNA序列是互补的DNA序列，其中当待检测的所述DNA与固定于所述电磁检测探针的所述DNA序列进行DNA碱基配 对时发生所述设备的组装；(b)使所述设备与待证明的DNA序列接触；(c)在允许Fl-ATP酶的活性旋转所述Fl- Y子单位的条件下，向所述设备中添加ATP ；以及(d)通过在待证明的DNA存在下，测定由结合于所述显微镜载玻片的旋转的电磁探针产生的信号来测定待证明的DNA序列中存在修饰DNA，其中当与固定于所述电磁检测探针的DNA序列进行DNA碱基配对时产生信号。在本文描述的任一种使用方法中，测定/检测步骤优选地包括使用暗视场显微镜的可视检测来检测由所述信号产生部件产生的信号。更具体地，该方法包括测定来自检测探针的一个或多个波长下的光的强度振荡。本文还教导了用于识别靶向代谢物的存在的试剂盒，所述试剂盒包括(a)蛋白，其特异性地结合感兴趣的小分子代谢物，其中所述蛋白以不干扰所述感兴趣的小分子代谢物的方式被生物素化；(b) Fl-ATP酶分子，其中所述Fl-ATP酶分子具有组氨酸标签以有利于Fl-ATP酶附着于固体载体且另外其中所述Fl-ATP酶被生物素化；以及(C)金纳米棒，其被结合于分子，这在所述蛋白被结合于感兴趣的小分子代谢物时识别(a)内的所述蛋白。在具体的实施方案中，试剂盒还包括固体载体。在另外其他的实施方案中，试剂盒还包括亲和素。
本发明还设想一种用于检测至少一种靶向小分子代谢物的方法，包括锚固部件、桥连部件以及信号产生部件，其中:(a)所述锚固部件包括分子马达，其中所述分子马达是能够被引起能够被检测到的平移或旋转运动的生物分子或合成分子；(b)所述桥连部件包括至少一个生物组分或合成组分，所述至少一个生物组分或合成组分结合或以其他方式应答于待检测的小代谢物的存在，其中所述桥连部件通过共价的或高亲和性结合的相互作用被连接于所述锚固部件；(C)信号产生部件，所述信号产生部件包括至少一个电磁检测探针，所述至少一个电磁检测探针已经在待检测的所述代谢物的存在下被特异性地结合于所述桥连部件或与所述桥连部件分离的部分官能化。在另一个实施方 案中，本发明涉及一种纳米检测样品中的靶分子的方法，包括:(a)使多个分子马达中的每一个结合于选定的桥连部件，其中所述分子马达是能够被引起能够被检测到的平移或旋转运动的生物分子或合成分子，且所述桥连部件是结合或以其他方式应答于待检测的小代谢物的存在的至少一个生物部件或合成部件；(b)在由所述桥连部件组装所述分子马达后，将所述多个分子马达锚固到固体载体；(C)将对所述桥连部件是特异性的电磁检测探针结合于固定的桥连设备，其中所述桥连部件在不存在靶向代谢物下具有对所述探针的高亲和性；且其中靶向代谢物结合于所述桥连部件导致探针对所述桥连部件的亲和性减弱；(d)应用疑似含有对所述桥连部件是特异性的所述靶向代谢物的样品；(e)引起偶联于所述固体载体的所述至少一个分子马达的平移或旋转运动；以及(f)通过显微镜检测偶联于所述固体载体的所述至少一个分子马达的平移或旋转运动，其中由探针的电磁特性的变化标示的在存在的所述样品内存在平移或旋转运动表示所述样品内缺乏靶向代谢物，而由探针的电磁特性缺乏变化标示的在存在的所述样品内不存在平移或旋转运动表示所述样品内存在靶向代谢物。本发明的另一个实施方案涉及一种纳米检测样品中的靶分子的存在的方法，包括:(a)使多个分子马达中的每一个结合于选定的桥连部件；其中所述分子马达是能够被引起能够被检测到的平移或旋转运动的生物分子或合成分子，且所述桥连部件是结合或以其他方式应答于待检测的小代谢物的存在的至少一个生物部件或合成部件；(b)在由所述桥连部件组装所述分子马达后，将所述多个分子马达锚固到固体载体；(C)应用疑似含有在不存在所述电磁探针下对所述桥连部件是特异性的所述靶向代谢物的样品；(d)结合对所述桥连部件是特异性的电磁探针，其中所述桥连部件在对所述桥连部件是特异性的靶向代谢物被结合于所述桥连部件时具有对所述探针的高亲和性；(e)引起偶联于所述固体载体的所述至少一个分子马达的平移或旋转运动；以及(f)通过监测所述探针的电磁特性的变化由显微镜检测偶联于所述固体载体的所述至少一个分子马达的平移或旋转运动，
其中由所述样品内存在的平移或旋转运动的增强标示的所述探针对所述桥连部件的增强的亲和性表明所述样品内存在对所述桥连部件是特异性的靶向代谢物，而由所述样品内存在的平移或旋转运动的减弱标示的所述探针对所述桥连部件的减弱的亲和性表明所述样品内不存在对所述桥连部件是特异性的靶向代谢物。在又一个实施方案中，存在一种纳米检测样品中的靶分子的方法，包括:(a)使多个分子马达中的每一个结合于固体载体，其中所述分子马达是能够被引起能够被检测到的平移或旋转运动的生物分子或合成分子；(b)使多个分子马达中的每一个连接至桥连部件，所述桥连部件包括结合或以其他方式应答于待检测的小代谢物的存在的至少一个生物部件或合成部件；(c)将对所述桥连部件是特异性的电磁检测探针结合于固定的桥连设备，其中所述桥连部件在不存在靶向代谢物下具有对所述探针的高亲和性；且其中靶向代谢物结合于所述桥连部件导致所述探针对 所述桥连部件的亲和性减弱(d)应用疑似含有对所述桥连部分是特异性的所述靶分子或靶向代谢物的样品；(e)引起偶联于所述固体载体的所述至少一个分子马达的平移或旋转运动；以及(f)通过显微镜检测偶联于所述固体载体的所述至少一个分子马达的平移或旋转运动，其中由探针的电磁特性的变化标示的在存在的所述样品内存在平移或旋转运动表示所述样品内缺乏靶向代谢物，而由探针的电磁特性缺乏变化标示的在存在的所述样品内不存在平移或旋转运动表示所述样品内存在靶向代谢物。在本发明的又一个实施方案中，存在一种纳米检测样品中的靶分子的方法，包括:(a)使多个分子马达中的每一个结合于固体载体，其中所述分子马达是能够被引起能够被检测到的平移或旋转运动的生物分子或合成分子；(b)使多个分子马达中的每一个连接至桥连部件，所述桥连部件包括结合或以其他方式应答于待检测的小代谢物的存在的至少一个生物部件或合成部件；(c)应用疑似含有在不存在所述电磁探针下对所述桥连部件是特异性的所述靶向代谢物的样品；(d)结合对所述桥连部件是特异性的电磁探针，其中所述桥连部件在对所述桥连部件是特异性的靶向代谢物被结合于所述桥连部件时具有对所述探针的高亲和性；(e)引起偶联于所述固体载体的所述至少一个分子马达的平移或旋转运动；以及(f)通过监测所述探针的电磁特性的变化由显微镜检测偶联于所述固体载体的所述至少一个分子马达的平移或旋转运动，其中如由所述样品内存在的平移或旋转运动的增强标示的所述探针对所述桥连部件的增强的亲和性表明所述样品内存在对所述桥连部件是特异性的靶向代谢物，而如由所述样品内存在的平移或旋转运动的减弱标示的所述探针对所述桥连部件的减弱的亲和性表明所述样品内不存在对所述桥连部件是特异性的靶向代谢物。应理解在上述方法中可以在步骤(d)之前、之后或与步骤(d)同时执行步骤(C)。在本发明的任一种方法中，所述桥连部分是转录调控蛋白，所述转录调控蛋白包括针对特异性DNA序列的结合位点和针对该小分子代谢物的结合位点且所述信号产生部件包括已知结合所述转录调控因子的特异性DNA序列。优选地，所述转录调控蛋白是转录激活蛋白，其中当所述特异性DNA序列结合于所述转录激活蛋白时出现所述设备的组装，这仅发生在所述小分子代谢物结合于所述转录调控蛋白的存在下。可选择地，所述转录调控蛋白是转录阻遏蛋白，其中当所述特异性DNA序列结合于所述转录阻遏蛋白时出现所述设备的组装且所述电磁检测探针在所述小分子代谢物的存在下与所述蛋白分离。在一些实施方案中，所述桥连部件是信号转导蛋白，所述信号转导蛋白包括针对该小分子代谢物的结合位点，其中所述信号转导蛋白在结合于所述小分子代谢物时改变构象，且所述信号产生部件包括检测所述信号转导蛋白的所激活的构象的抗体。所述桥连部件可以是DNA证明蛋白，所述DNA证明蛋白识别DNA序列中的修饰碱基，且所述信号产生部件包括对待检测的DNA序列是互补的DNA序列，其中当该待检测的DNA与固定于所述电磁检测探针的所述DNA序列进行DNA碱基配对时发生所述设备的组装。在本发明中，电磁指示器或探针包括至少一个光颗粒、磁颗粒和热颗粒。例如，所述电磁指示器或探针包括包含至少一个荧光珠和光散射颗粒的光指示器。在示例性的实施方案中，所述电磁指示器或探针是来自所述元素金属组的胶态颗粒。若干副图的简述

图1:用于纳米检测代谢物的暗视野显微镜装置。图2A到2C:当纳米棒被相对于偏光滤光器定位在0°、45°和90°时，通过偏光滤光器看到的从单个金纳米棒散射的光的显微照片。该图显示了金纳米棒附着于Fl-ATP酶的旋臂(Y子单位)。在位置A(0° )，颜色是绿色，在位置C，颜色是红色。在位置B，颜色不是橙色而是从纳米棒散射的绿光和红光强度的混合。图3:柱图描述了基于在30个连续视野内观察到的纳米棒的数目，检测细胞上清液中的Stx2毒素蛋白，使用包含产生大肠杆菌EDL933Stx2的菌株(图3A、3C)或产生大肠杆菌MG1655的非毒素的菌株(图3B、3D)的细胞上清液。图3C和图3D中的纳米设备是对照，其省略了捕获(抗_S tx2B)抗体。图4:柱图描绘了检测含有纯化毒素的样品或来自含有EDL933(产毒素菌株)或MG1655(产非毒素菌株)的唾液样品中的Stx2毒素蛋白。图5:柱图描绘了在10个连续视野中由纳米设备组件测得的细胞上清液中的Stx2毒素蛋白的检测限值(蓝色)对10个(红色柱)或30个(绿色柱)连续视野内的旋转纳米棒的数目。图6:柱图描绘了在10个连续视野中测定的纯化的Stx2毒素蛋白的基于旋转的检测限制，且数据表示为随样品内的靶分子的数目(图6A)或靶浓度(图6B)变化。图7:用于识别和量化数码相机视野内的红色、绿色、蓝色和黄色纳米棒的算法中使用的标准的概述。图8:描绘了用于多像素检测同一样品孔内的Stx2毒素蛋白(左侧，红色纳米棒)和stxl基因DNA序列(右侧，绿色纳米棒)的自组装纳米设备。图9:柱图描绘了使用红色和绿色纳米棒同时测定分别在含有来自大肠杆菌EDL933(+毒素)或MG1655(-毒素)的上清液的孔中的同一样品内的Stx2蛋白和stx2基因DNA序列。图10:描绘了使用转录激活蛋白进行代谢物检测。图10A，靶向代谢物(cAMP)结合于被固定在F1分子马达的旋臂上的激活蛋白(CAP)。图1OB描绘了 cAMP结合于CAP诱导构象变化，这产生针对DNA受体序列的高亲和性结合位点。图1OC描绘了涂覆有特异性DNA受体序列的金纳米棒将CAP-cAMP复合物结合于复合的纳米设备组件且通过显微镜实现代谢物检测。图11:组装好的部件(左侧，包括F1、亲和素、CAP以及DNA)的晶体结构且描绘了使用转录调控蛋白作为检测代谢物的致动子(actuator)的纳米设备部件。图12:描述了使用转录阻遏蛋白检测代谢物。图12A描述了结合于固定在Fl分子马达的旋臂上的阻遏蛋白(NRP)的靶向代谢物(NADH)。图12B描绘了 NADH结合于NRP置换了 NAD+且诱导了消除针对DNA受体序列的结合位点的构象变化。图12C描绘了涂覆有特异性DNA受体序列的金纳米棒通过洗涤被去除且代谢物通过显微镜载玻片上结合的纳米棒数目的减少被检测。图13:描述了用于使用NADH检测代谢物的有序的纳米设备阵列。图14:描述了使用电子束光刻来在显微镜载玻片上以受控尺寸的图案构建纳米尺度镍岛。发明详述在本发明中，提供了一种用于使用采用了固定的F1-ATP酶的纳米检测方法来检测靶向代谢物的方法。存在多种转录调控蛋白，每一种结合具有高亲和性和特异性的小分子。由于结合到特异性DNA序列，因而这样的转录调控蛋白负责用于激活或阻遏DNA转录。这些调控蛋白中的大多数仅结合至呈二聚型的DNA，这是由于被单分子占据而发生的。对于转录激活蛋白，代谢物结合引发二聚作用并形成高亲和性结合位点以结合DNA。在阻遏蛋白中，代谢物的结合具有反面作用。调控蛋白的实例包括但不限于结合环状AMP的分解代谢产物激活蛋白、结合树胶醛糖的树胶醛糖转录调节因子、尿嘧啶依赖性转录调节因子、GTP和异亮氨酸应答调控因子、色氨酸阻遏蛋白以及麦芽糖转录调控因子、抗葡萄糖淀粉酶调控因子。靶向代谢物包括但不限于氨基酸、碳水化合物、核苷酸、核苷、激素、有机酸以及将特异性地结合于转录调控蛋白的任何小分子。可以基因修饰调控蛋白以改变代谢物的特异性。在一个实施方案中，树胶醛糖转录调节因子可以被突变，使得其对结合葡萄糖而取代树胶醛糖变得是特异性的。 在本发明中，提供了可以用于检测特异性代谢物的纳米级检测设备。示例性的这样的设备通过将F1-ATP酶的分子安装到显微镜载玻片的表面上且定位成旋转的Y -子单位轴远离表面来构建。这将通过在F1的α和/或β子单位的C端上存在组氨酸标签来实现，这具有结合至显微镜载玻片的未被修饰或已被官能化而包含镍-NTA的表面的高亲和性。Fl-ATP酶Y-子单位被基因修饰以包含半胱氨酸，半胱氨酸将被共价修饰以包含生物素部分，经由如生物素-马来酰亚胺。将提供检测靶分子(代谢物)的特异性的转录调控蛋白将被基因修饰以包含用于生物素化的半胱氨酸，其被定位成不会干扰二聚作用或DNA结合位点。生物素化的调控蛋白和生物素化的Fl-ATP酶随后使用亲和素被组装。在显微镜下可见的检测探针的表面包括但不限于金纳米棒，其将被官能化以包含双螺旋DNA且序列对调控蛋白是特异性的。当靶分子(代谢物)结合于调控蛋白时进行检测，这包括引发二聚作用并形成高亲和性结合位点以结合DNA。随后添加官能化的纳米棒将使纳米尺度的检测设备的复杂组件仅用于已经结合代谢物的调控蛋白。检测可以通过比较在靶向代谢物存在下与在靶向代谢物不存在下结合在显微镜载玻片上的纳米棒的数目来进行。使用纳米设备的组件的检测限制是纳米设备的靶向特异性组件的数目未明显增加到高于非特异性地结合于显微镜载玻片的表面的金纳米棒的数目的点。在这些限制条件下，添加ATP为Fl-ATP酶分子马达提供了燃料以引起旋转。唯一旋转的纳米棒是特异性地结合于正确组装的包含靶向代谢物的纳米设备的那些纳米棒。ATP的检测可以通过将金纳米棒直接附着于Fl-ATP酶Y-子单位来进行，原因是ATP的存在将引起旋转。类似的方式，ADP的存在可以使用偶联酶测定由高浓度的丙酮酸激酶和磷酸烯醇丙酮酸来进行。类似地，与Fl-ATP酶组装的抗葡萄糖淀粉酶调控因子可以用于经由酶偶联测定由己糖激酶和ATP来检测葡萄糖，以将葡萄糖转化成葡萄糖-6-磷酸盐(G-6-P)。G-6-P随后结合至调控蛋白以促进由DNA-官能化的金纳米棒进行组装以便用于检测。使用阻遏蛋白进行的检测通过由Fl-ATP酶和DNA官能化的纳米棒组装阻遏蛋白二聚体来实现。在此情形中，阻遏蛋白二聚体在靶向代谢物不存在下具有对DNA的高亲和性。靶向代谢物结合于阻遏蛋白造成复合物离解，这被检测为所观察到的结合于显微镜载玻片的表面的纳米棒 数目的减少。为了有利于量化结合的靶向代谢物的数目，纳米设备可以按纳米阵列图案以特定的间隔被组装在显微镜载玻片表面上。这将产生纳米棒的网格图案，该网格图案在结合靶向代谢物时被干扰。通过添加靶向代谢物之前和之后所观察到的纳米棒的数目来测定量化。在另一个实施方案中，使用信号转导蛋白激酶构建设备来检测靶向代谢物。通过结合特异性代谢物来激活若干蛋白激酶。具体实施方案是蛋白激酶A，其中激酶催化活性因结合环状AMP而被激活。蛋白包含两个催化子单位和两个结合环状AMP的调控子单位。环状AMP结合至调控子单位诱导造成催化子单位分解和激活的构象变化。为了使用这些激酶中的一种检测靶向代谢物，激酶的调控子单位将经由使用生物素-亲和素链已经被生物素化的基因修饰的半胱氨酸被附着于生物素化的F1-ATP酶。此组装将被设计成使得催化子单位远离F1-ATP酶。当结合靶向代谢物时，催化子单位将分解，由此暴露调控子单位的先前螯合的区域。将已经被单克隆抗体官能化的金纳米棒添加至调控子单位的在激活时暴露的那个部分将允许组装纳米设备，且由此实现检测。在另一个实施方案中，设备被构建，使得形成纳米棒/纳米颗粒与Fl-ATP酶之间的桥的蛋白组分是用于检测修饰DNA的DNA校对蛋白。DNA中的半胱氨酸甲基化是主要的表观遗传信号，该信号在细胞分裂期间的增殖染色质状况中起到重要作用。校对蛋白特异性地结合于包含修饰碱基如5-甲基胞嘧啶的DNA序列。例如，类似泛素的，含有PHD和无名指域(UHRFl) SRA域是DNA复制叉处CpG维护甲基化所需要的。此蛋白特异性地结合于DNA序列中的5-甲基胞嘧啶并使碱基翻出DNA螺旋。负责结合于特异性修饰的DNA的校对蛋白将经由亲和素-生物素链附着于F1-ATP酶。包含修饰碱基的单链靶向DNA将被引入此检测复合物中，或将被杂交到称为检测探针链的互补的DNA链中。此互补的链将被修饰以包含在任一端以共价方式附着于涂覆亲和素的金纳米棒的生物素以便组装纳米设备而实现检测。因而本发明提供了新颖的设备和用于使用这样的设备来极其灵敏地检测给定样品内的靶向代谢物的方法。本文所公开的方法检测靶向小分子代谢物，在于该待检测的小分子代谢物与结合蛋白的相互作用，仅在待检测的特异性小分子代谢物的存在下，该结合蛋白才特异性地结合该小分子代谢物并在设备内产生信号。结合于该感兴趣的小分子代谢物的特异性蛋白用于桥连锚固到固体表面的分子马达与检测探针。然而，桥仅在蛋白被结合于待检测的小分子代谢物时才形成。当此结合发生时，通过揭示了由分子马达赋予的运动至桥连部件的检测探针进行揭示，该运动表示待检测的小分子代谢物结合于桥连部件内的蛋白。赋予探针的运动通过合适地选择来自检测探针的信号的检测工具被观察。本发明的方法能够检测待检测的小分子代谢物的单个分子，且因而提供用于具有多种应用的靶检测的极其灵敏的技术，这些应用包括但不限于临床诊断、法庭分析、基因表达分析、DNA排序和证明以及DNA计算。本发明所使用的装置可以被描述为由三个单独的部分构成:锚固部件、桥连部件以及信号产生部件。锚固部件将是将整个组件锚固至显微镜载玻片并允许基于显微镜检测所产生的信号的部分。锚固部件包括经由定点突变修饰的Fl-ATP酶分子，以便包括在F1-Ci或？^^子单位的N端上的组氨酸标签和F1-Y子单位上的半胱氨酸，其中多个F1-ATP酶分子被固定至显微镜载玻片的表面，使得每一个F1-ATP酶分子被定位成所述F1- Y子单位远离所述显微镜载玻片的所述表面，其中所述F1-Y子单位上的所述半胱氨酸被生物素化。桥连部件包括结合至或以其他方式应答于待检测的小分子代谢物的存在，其中所述桥连部件内的所述蛋白被生物素化并通过生物素-亲和素-生物素链由所述锚固部件的生物素化的F1-Y子单位连接于所述锚固部件；以及所述信号产生部件包括电磁检测探针，所述电磁检测探针已经在待检测的所述代谢物的存在下，被特异性地结合于所述桥连部件的所述蛋白的部分官能化。待检测的小分子代谢物可以是能够结合于感兴趣的蛋白的任何分子，其中蛋白被用作分子马达与检测马达引起的运动的检测探针之间的桥内的蛋白且被用于形成对待检测的那个小分子代谢物是特异性的那个桥的工具。待检测的小分子代谢物可以是能够结合于感兴趣的蛋白的任何分子，其中蛋白被用作分子马达与检测马达引起的运动的检测探针之间的桥内的蛋白且被用于形成对待检测的那个小分子代谢物是特异性的那个桥的工具。执行待检测 的小分子代谢物的检测的样品可以是感兴趣的任何样品，包括但不限于合成核酸、基因组DNA、细胞裂解物、组织匀浆、法医样品、环境样品以及从细胞、组织或完整的生物体分离出的核酸样品。此外，样品可以来自可以用于识别结合于是桥连部件的一部分的蛋白的剂的小分子库。这样，可以识别形成设备的桥连部件的蛋白的新的调节物。本领域的技术人员可以容易地实现对用于在由此待检测的小分子代谢物将结合于设备的桥连部件内的蛋白的条件下，使含有或疑似含有待检测的小分子代谢物的样品接触纳米检测设备的条件进行优化。A.锚固部件纳米检测设备的锚固部件包括分子马达，其是能够被引起能够被检测到的平移或旋转运动的任何生物分子或合成分子。在优选的实施方案中，分子马达包括生物分子马达。这样的生物分子马达的非限制性示例包括Fl-ATP酶、肌动球蛋白、纤毛轴丝(ciliaryaxoneme)、细菌鞭毛马达、驱动蛋白/微管以及核酸解螺旋酶和聚合物酶。在优选的实施方案中，分子马达包括Fl-ATP酶。Fl-ATP酶在其碱基结构内包括α-子单位和β_子单位。碱基结构是不旋转的且被优先锚固或附着于表面。表面可以是DNA微阵列、载玻片或其他电介质基材的一部分。举个例子，Fl-ATP酶上的旋转子单位包括Y子单位和ε子单位，而α子单位、β子单位以及δ子单位并不旋转。因而，若Fl-ATP酶被用作分子马达，那么优选地第一亲和性标签(直接地或间接地)结合于y子单位和/或s子单位，而分子马达经由官能部分诸如组氨酸标签通过α子单位、β子单位或δ子单位被附着于底物。在优选的实施方案中，Fl-ATP酶旋转生物分子马达是α3β3γ子单位的复合物。此复合物提供了 Fl-ATP酶最佳地结合于固体载体且Y子单位结合于DNA。Fl-ATP酶组件、子单位组成以及Fl-ATP酶旋转的引起对本领域技术人员是众所周知的；例如参见，US20030215844 ；Yoshida 等人，Journal of Biological Chemistry, 252:3480-3485(1977) ；Du 等人，Journal of Biological Chemistry,276:11517-11523(2001) ；Bald 等人，Journalof Biological Chemistry,275:12757-12762(2000) ;Kato_Yamada 等人，Journal ofBiological Chemistry, 273:19375-19377(1998), Kato 等人，Journal of BiologicalChemistry, 272:24906-24912 (1997) ;Tucker 等人，Journal of Biological Chemistry,279:47415-8(2004) ;Tucker 等人，Eur.J.Biochem.268:2179-86(2001)以及 Du 等人，Journal of Biological Chemistry,276:11517-23(2001).
可以用于本发明的方法和组合物中的Fl-ATP酶子单位的示例性的非限制性示例对本领域技术人员来说是已知的且包括以下述基因银行登录号被保藏的那些:基因银行登录号NM128864 ;基因银行登录号NM121348 ;基因银行登录号NM104043 ;基因银行登录号D14699 ;基因银行登录号D14700 ；AB095026 ;基因银行登录号BT000409 ;基因银行登录号AY136289 ;基因银行登录号AY114540 ;基因银行登录号AJ487471 ;基因银行登录号M20929 ;基因银行登录号A F034118 ;基因银行登录号D10491 ;基因银行登录号X05366 ；基因银行登录号AY072309 ;基因银行登录号AY062627 ;基因银行登录号U61392 ;基因银行登录号U61391 ;基因银行登录号X05970 ;基因银行登录号AB044942 ;基因银行登录号AF052955 ;基因银行登录号D37948 ;基因银行登录号AB022018 ;基因银行登录号AB007034 ;基因银行登录号D15065 ;基因银行登录号D00022 ;基因银行登录号J05397 ；AF134892 ;基因银行登录号Z00018 ;基因银行登录号U46215 ;基因银行登录号X53537 ;基因银行登录号X03559 ;基因银行登录号AF010323 ;基因银行登录号AB003549 ;基因银行登录号D88377 ;基因银行登录号D88376 ;基因银行登录号D88375 ;基因银行登录号D88374 ；基因银行登录号D10660 ;基因银行登录号X68691 ;基因银行登录号X56008 ;基因银行登录号X55389 ;基因银行登录号X59066 ;基因银行登录号L13320 ;基因银行登录号X51422 ；基因银行登录号Z00026 ;基因银行登录号X07745 ；X55963 ;基因银行登录号X68690 ;基因银行登录号X56133 ;基因银行登录号V00312 ;基因银行登录号U37764 ;基因银行登录号M65129 ;基因银行登录号J03218 ;基因银行登录号M16222 ;基因银行登录号J02603 ；以及基因银行登录号U09305。Fl-ATP酶优选地被固定用于旋转可视化技术或如果检测取决于局部环境的扰动，诸如微电流或阻抗。一系列分子马达，相同的或两个或更多不同的分子马达，可以被固定在表面上以产生本发明的纳米检测设备的阵列。如果每一个Fl-ATP酶被附着于设备的桥连部件内的不同的蛋白，且不同的设备被用不同的标签标记，那么此分子马达阵列可以用于以类似于使用基因芯片的方式来检测多个小分子代谢物。正如本文中使用的，“阵列”包括固体表面，且分子马达附着于所述表面。在一些实施方案中，阵列是附着于固体表面的多个本发明的纳米检测的随机阵列，其中设备检测相同的或不同的小分子代谢物(即，纳米检测设备的桥连部件内的蛋白检测不同的小分子)。在其他实施方案中，阵列是“可编址的”阵列，其中包含特异性蛋白的特定纳米检测设备的位置是给出的阵列上的具体位置，且该位置由不同的颜色或允许特定分子马达的位置被精确定位的其他选定的标记标示。阵列通常包括连接于不同捕获基团的多个分子马达，捕获基团连接于不同的已知位置内的基材的表面。例如，存在若干娃烧衍生物以将多个官能团附着于玻璃表面。正如本文中使用的，术语“固体表面”指的是具有刚性或半刚性表面的材料。这样的材料将优选地呈小片、板、载玻片、盖玻片、小珠、球丸、盘的形式或其他便利的形式，但是也可以使用其他形式。这些表面通常被涂覆有亲和性靶。这样的固体表面可以以任何方式被涂覆，改善了对其表面的期望结合和/或使非特异性结合于其表面为最少。在优选的实施方案中，使用镍-次氮基三乙酸(N1-NTA)亲和树脂(Sigma-Aldrich产S#P6611)。在另一实施方案中，可添加乙酰基化BSA以减少非特异性结合。可以使用如电子束光刻来制造阵列。Fl-ATP酶的Y子单位被分子偶联于碱基结构并定位成朝上垂直于基材的表面。Fl-ATP酶作为分子马达那样操 作，且α子单位和β子单位引起Y子单位臂的旋转。因而，Y子单位表现为驱动臂，定位成朝上，垂直于酶所附着的表面，并应答于α子单位和β子单位的活性而旋转。在显微镜下难以直接看到Y子单位臂的旋转，且因此Y子单位被偶联于信号产生部件。B.信号产生部件和信号的检测在本发明的纳米检测设备的信号产生部件中存在检测探针。检测探针可以是能够附着于设备的桥连部件并提供检测由分子马达产生的运动的工具的任何物，诸如金属纳米颗粒(棒、球、量子点等)、荧光染料以及被荧光染料标签的纳米颗粒。在优选的实施方案中，元素金属纳米棒被使用，包括但不限于金、银、铝、钼、铜、锌以及镍。在一个实施例中，能够通过显微镜目视观察的金棒检测探针被官能化以具有经由生物素-亲和素结合附着于其上的部分，当桥连部件的蛋白被结合于待检测的小分子时，该部分结合于该蛋白。金纳米棒被用蛋白或其它结合分子，诸如亲和素，附着于Y子单位臂。Y子单位臂可以附着于金纳米棒的任何部分，如任一端，在中间，或之间的任一点。结合分子将纳米棒连接于Y子单位臂，使得Y子单位臂的旋转运动被赋予金纳米棒。金纳米棒借助Y子单位臂的旋转运动而旋转。在另外的实施例中，金纳米棒被涂覆有抗-DIG抗体(亲和性靶)，这特异性地结合于DIG (地谷新配基)第二亲和性标签。金属纳米颗粒诸如金纳米棒是光的有效的吸收剂和散射体，原因是它们的称为表面等离子体振子的导电电子的统一振荡。表面等离子体振子带的数目、位置和形状由金属种类、颗粒的尺寸和形状以及周围介质的介电常数决定。非球形的纳米颗粒具有多表面等离子体振子模式。例如，棒形的纳米颗粒表现出两种共振模式，分别对应于它们的长轴和短轴。金纳米棒被成形为具有圆端或扁平端的棒、轴或圆柱形。金纳米棒直径约15_40nm且沿着对称轴的长度是约60-80nm。在其他实施方案中，金纳米棒具有2.5: I到20:1之间的长径比。棒形纳米颗粒通常由碱基片或球生长。金纳米棒表现出光学各向异性，在于其具有对应于轴的直径和长度的两种表面等离子体振子共振。短轴对应于棒的横向等离子体振子共振。长轴对应于棒的纵向等尚子体振子共振。金纳米棒的短轴和长轴散射随各自尺寸的变化将入射白光散射出不同波长的光。长轴具有比短轴大的表面积。金纳米棒的短轴或端表面因较少的表面积而散射较短波长的光，而金纳米棒的长轴或侧表面因其较大的表面积而散射较长波长的光。在一个实施方案中，金纳米棒的短轴散射具有约520-570nm波长的绿光，而长轴散射具有685-730nm波长的红光。金纳米棒的其他相对尺寸将入射白光散射两种不同波长的光。金纳米棒的光散射特征连同其由Y子单位臂赋予的旋转运动允许观察和测量纳米尺度的分子结构的物理特征和行为现象。以简化的观点，全光谱，白光源通常指向在参考方向。白光光子撞击金纳米棒作为波函数，且根据金纳米棒相对于偏光滤光器的入射角的方位，一些波长的光将被散射。对给定尺寸的金纳米棒来说，当纳米棒被对齐，使得短轴平行于偏光器(位置A)，绿光的散射最大且红光的散射最小。当纳米棒的长轴与偏光方向(位置B)对齐时，红光的散射最大且绿光的散射最小。这可以在图2中看到。从金纳米棒散射的光被偏振。红光和绿光共振的强度取决于纳米棒相对于入射光的偏振面的相对方位。由于其连接至自旋的Fl-ATP酶分子马达，金纳米棒的旋转性质产生闪现的或闪烁的交替的绿光和红光的可观察的光。红光和绿光的闪烁强度和速率随Y子单位的旋转速度变化。通过观察金纳米棒的闪烁的红光和绿光，可以检测并测量Fl-ATP酶的旋转运动。可见的闪烁光比物理旋转结构本身更易于观察。此外，散射的波长的偏光性质使金纳米棒在位置A-D之间变暗。闪现的绿光和红光是使用暗视野显微镜可检测的、可观察的和可测量的。图1显示了用以检测、观察和测量来自金纳米棒30的散射光的暗视野显微镜仪器装置。来自光源38的全光谱白光被入射至暗视野聚光器和透镜40，这又改变了光路以产生相对于金纳米棒30的长轴和短轴方位的倾斜角度。附着金纳米棒30的Fl-ATP酶放置于载玻片表面20。Fl-ATP酶10和旋转的金纳米棒30被暴露于白光。Fl-ATP酶10的旋转运动和金纳米棒30的相应旋转使红光和绿光波长的入射光根据纳米棒的方位散射。当长轴暴露于白光时，红光 散射，而当短轴暴露于白光时，绿光散射。未散射的光继续进入物镜42，在此处由虹膜44阻挡。由金纳米棒30散射的光的波长穿过虹膜或孔44。偏光滤光器46被定位在物镜42的出口且穿过与偏光滤光器对齐的散射光的波长，且进一步阻挡任何未与偏光滤光器对齐、散射的或未散射的光，。与偏光滤光器46对齐的散射的红光穿过滤光器。类似地，与偏光滤光器46对齐的散射的绿光穿过滤光器。散射的红光和绿光的强度相对于偏光角度变化且当金纳米棒30的适当的轴线平行于偏振面时具有最大值。当从金纳米棒30的长轴散射的光与偏光滤光器46对齐时，那么红光被通过。当从金纳米棒30的短轴散射的光与偏光滤光器46对齐时，那么绿光被通过。没有其他光通过偏光滤光器46,即偏光滤光器46的其他的输出是暗的。红光和绿光强度由光学处理设备48收集，这使红光和绿光分成个别通道。可使用MetaVue软件来分离、检测、观察以及测量红光和绿光的强度。当闪烁的红光和绿光通过偏光滤光器46时，观察到Fl-ATP酶引起的旋转，这是因为金纳米棒30的表面等离子体振子共振。交替闪烁的红光和绿光已经提供了 Fl-ATP酶10的物理和行为特征的可观察的且可量化的表示，就如红光和绿光的闪烁速率随Fl-ATP酶10的旋转速度变化。纳米颗粒可以是椭圆形的、棒形的或其他各向异性的形状。纳米颗粒可以由纯金属或合金制备，且可以被涂覆有不同类型的金属或其他材料如玻璃。纳米颗粒可以是如通过电子束光刻被图案化到金属化表面上的扁平结构。通过本领域的关于给定分子马达的标准方法引起分子马达的运动。例如，Fl-ATP酶的运动通过使用标准技术添加ATP来引起(Noji，H.，Yasuda, R.，Yoshida, M.和Kinosita, K.(1997)Nature386，299-302)。用于本发明的方法中的合适的ATP浓度的范围在IpM到2mM ;优选在200 μ M到ImM之间。Fl-ATP酶的选择速度可以通过所使用的ATP浓度得到控制。例如，一些检测方法能够比另一些方法检测更大的旋转速率，且因而所使用的ATP的特定浓度将部分取决于所采用的检测技术。本领域的技术人员能够使用类似的已公开的方案测定如何引起其他已知的分子马达的运动。本发明的特定方面是被检测到的唯一运动将源于被连接于检测探针的分子马达且此连接依赖于待检测的小分子代谢物结合于分子的桥连部件内的蛋白，或者此连接只有在待检测的小 分子代谢物结合于分子的桥连部件内的蛋白时才发生。由于该连接将取决于结合于桥内的蛋白的待检测的小分子代谢物的存在，这源于待检测的小分子代谢物和蛋白的特异性结合，所以观察到此运动将确认存在待检测的小分子代谢物。通过检测探针检测分子马达的运动可以通过任何合适的方式来实现。在一个实施方案中，使用直接目视运动。在优选的实施方案中，能够通过显微镜目视观察的元素金属棒检测探针被附着于设备的桥连部件。其他观察工具包括但不限于单分子荧光共振能量转移、荧光寿命各向异性以及原子力显微镜。除了显微镜外，其他方法可以用于观察检测探针的旋转，包括但不限于(I)将分子马达附着到纳米电极上并测量因旋转产生的微电流变化或阻抗变化；(2)将荧光标签诸如Pacific blueTM(分子探针)附着到分子马达的不旋转部分上；以及(3)单分子各向异性测量。在另一个可选择方案中，旋转可以通过荧光信号的周期性猝灭由猝灭物检测探针观察。在另外的实施方案中，表面等离子共振生物传感器可以用于测量金属纳米棒旋转期间的表面等离子共振变化。在最优选的实施方案中，金属(诸如金)纳米棒被用可见光(400-700mm波长范围)来检测旋转，以提供改进的检测能力(参见，如W02004/053501)。从纳米棒散射的光分别被从棒的长轴和短轴散射的更长的波长和更短的波长偏振。当通过偏光滤光器观察时，散射光的强度取决于棒相对于滤光器方向的角度。观察从棒的长轴和短轴散射的光以使这些轴平行于滤光器的方向时具有最大值，而垂直于滤光器时具有最小值。例如，如果散射光的长波长和短波长分别是红色和绿色时，红光强度将在绿光是最小时是最大的。因而，通过偏光滤光器看到的金属纳米棒的旋转将显示出闪烁的红色和绿色。在此实施方案中，监测纳米棒旋转时红光和绿光两者的强度振荡提供了棒发生旋转的独立构象。在另外优选的实施方案中，测量了只有一种波长的光强度的振荡，这进一步改善了信噪比。在这些实施方案中，可以使用两种波长的光(如使用分束器或彩色照相机)或仅使用一种波长的光(如使用绿光或红光偏光器)来进行测量。就数码照相机仍足够灵敏地测量由旋转纳米棒产生的强度振荡的帧速率(数据采集的速度)而言，限制了一些数码照相机。单光子计数器可以用于进行振荡测量。针孔可以起到暗箱的作用且一次仅可以测量一个棒的振荡；能够以高得多的信噪比以大得多的帧速率进行。数码相机可以一次采集许多纳米棒的振荡数据，而相机的速度和灵敏度仅需要足以捕捉棒旋转的速率。优选的振荡速率是借助用于进行测量的检测设备易于测量的速率。在采用元素金属纳米棒的这些实施方案中，暗视场显微镜检查是优选的检测方法，因为只有从纳米棒散射的光被观察到，这进一步改善了信噪比。在另一个实施方案中，使用亮视场显微镜检查来进行检测。由于本发明的方法能够检测待检测的小分子代谢物的单个分子，因而他们提供了量化样品中存在的待检测的小分子代谢物的量的精确方式。在一个实施方案中，通过目视来确定旋转分子的数目且计算所看到的全部样品的份数。用目前与DNA微阵列一起使用的荧光检测方法是不可能这样做的。

虽然在具体的实施方案中，锚固部件通过生物素/亲和素被连接于相邻的桥连部件，但其他结合对也可以用于获得此链。其他这样的结合对实例的非限制性示例包括地谷新配基(DIG)/抗-地谷新配基抗体和其他抗原/抗体对。抗原决定基标签，诸如组氨酸标签以及针对抗原决定基标签(或其片段)的抗体是用于与本发明的方法一起使用的结合对的另外的示例。本领域技术人员将理解本文所列出的某些实施方案是亲和性标签的间接结合且分子马达或检测探针也可以用于直接结合的实施方案。C.桥连部件在本发明中，在纳米颗粒与Y子单位之间存在由结合于或以其他方式应答于待检测的代谢物存在的蛋白构成的连接、桥连或偶联部分。如本文中上面所述的，蛋白可以是转录调控蛋白、信号转导蛋白、DNA证明蛋白或起到结合感兴趣的代谢物的蛋白作用的任何其他蛋白。示例性的转录调控蛋白包括JNKl (C-jun激酶I ;分裂素激活的蛋白激酶8 ;MAPK8) ;P38激酶(分裂素激活的蛋白激酶 14 ；MAPK14 ；p38MAP KINASE ；p38-ALPHA) ;ATF2、MEF2C以及MAX，细胞循环调控因子CDC25B、肿瘤抑制剂p53 ;基因编码cdc2、基因编码Cyclin (Cyclin A、Cyclin D、Cyclin E)、cdc25C、WAFl (野生型 p53 激活的片段 I)、INK4、⑶K (⑶K1XDK2、⑶K4、⑶K6)、Rb蛋白以及E2F。示例性的转录阻遏蛋白包括如四环素(tet)阻遏蛋白。如上所述，可以使用的特异性信号转导蛋白是蛋白激酶A。可以使用的其他蛋白激酶包括Ras、A-Raf、B-Raf和Raf-1以及类似蛋白激酶。D.试剂盒和示例性的实施方案在另一个方面，本发明提供了用于检测小分子代谢物的试剂盒，包括(a)蛋白，其特异性地结合感兴趣的小分子代谢物，其中所述蛋白以不干扰所述感兴趣的小分子代谢物的方式被生物素化；(b)分子马达，诸如3个子单位或5个子单位的Fl-ATP酶分子，其中所述Fl-ATP酶分子具有组氨酸标签以有利于Fl-ATP酶附着于固体载体且另外其中所述Fl-ATP酶被生物素化；以及(c)金纳米棒，其被结合于分子，这在所述蛋白被结合于感兴趣的小分子代谢物时识别(a)内的所述蛋白。该试剂盒还可包括固体载体和生物素。在优选的实施方案中，试剂盒还包括结合于桥连部件的分子马达和/或结合于桥连部件的检测探针。在另一个实施方案中，分子马达被结合于固体载体，诸如盖玻片或其他合适的载体。载体可以以用于结合到分子马达的任何合适的方式得到。本发明还提供了一种组合物，包括锚固部件、桥连部件以及信号产生部件，其中:(a)锚固部件包括经由定点突变修饰的Fl-ATP酶分子，以便包括在Fl-α或Fl-β子单位的N端上的组氨酸标签和Fl-Y子单位上的半胱氨酸，其中多个Fl-ATP酶分子被固定至显微镜载玻片的表面，使得每一个Fl-ATP酶分子被定位成所述Fl-Y子单位远离所述显微镜载玻片的所述表面，其中所述Fl-Y子单位上的所述半胱氨酸被生物素化；(b)所述桥连部件包括结合至或以其他方式应答于待检测的小分子代谢物的存在蛋白，其中所述桥连部件内的所述蛋白被生物素化并通过生物素-亲和素-生物素链由所述锚固部件的生物素化的Fl-Y子单位连接于所述锚固部件；以及(c)所述信号产生部件包括电磁检测探针，所述电磁检测探针已经在待检测的所述代谢物的存在下，被特异性地结合于所述桥连部件的所述蛋白的部分官能化。
本发明还提供了一种组合物，包括锚固部件、桥连部件以及信号产生部件，其中:(a)锚固部件包括经由定点突变修饰的Fl-ATP酶分子，以便包括在Fl-α或Fl-β子单位的N端上的组氨酸标签和Fl-Y子单位上的半胱氨酸，其中多个Fl-ATP酶分子被固定至显微镜载玻片的表面，使得每一个Fl-ATP酶分子被定位成所述Fl-Y子单位远离所述显微镜载玻片的所述表面，其中所述Fl-Y子单位上的所述半胱氨酸被生物素化；(b)所述桥连部件包括转录调控蛋白，其包括当结合至或以其他方式应答于待检测的小分子代谢物的存在时，针对特异性DNA序列的结合位点，其中所述桥连部件内的所述蛋白被生物素化并通过生物素-亲和素-生物素链由所述锚固部件的生物素化的Fl- Y子单位连接于所述锚固部件；以及(C)所述信号产生部件包括电磁检测探针，当蛋白被结合于待检测的所述代谢物时，所述电磁检测探针已经被已知结合所述桥连部件的所述转录调控因子的特异性DNA序列官能化。本发明还提供了一种组合物，包括:(a)固体载体；和(b)附着于固体载体的多个分子马达，其中多个分子马达被附着于桥连部件，所述桥连部件包括对待检测的小分子代谢物是特异性的蛋白。在优选的实施方案中，该些多个分子马达包括超过一种类型的分子马达。在另一个优选的实施方案中，载体上的不同类型的分子马达包括桥连部件内的对待检测的不同的小分子代谢物是特异性的不同的蛋白。在另一个优选的实施方案中，组合物还包括桥连部件内的第一蛋白，所述第一蛋白是转录激活蛋白，其通过生物素-亲和素-生物素链将待检测的小分子代谢物特异性地结合于分子马达。在另一个优选的实施方案中，桥连部件内的蛋白是转录阻遏蛋白，其被结合于DNA分子，所述DNA分子通过具有亲和性标签诸如生物素-亲和素链的链被结合于金纳米棒。基于上面讨论的那些原因，这样的方法具有价值，原因是金纳米棒优选用于检测测定中，诸如本发明中描述的那些。F.实施例实施例1:在本发明的一个实施方案中，第一亲和性标签生物素被附着于将形成本发明的设备的桥连部件的一部分的蛋白上的半胱氨酸残基。此生物素化的蛋白经由亲和性标签被用作分子马达与用于检测由马达产生的运动的检测探针之间的桥。桥连部件的生物素化的蛋白被附着于分子马达的移动部件。当待检测的靶向小分子代谢物存在时，桥连部件被连接于检测部分，原因是桥连部件内的蛋白的构象被改变，使得检测探针上存在的部分能够结合于纳米检测设备的桥连部件。在具体的实施例中，检测探针包括能够通过显微镜被看到的金纳米棒，附着于桥连部件内所结合或识别到蛋白的部分通过生物素亲和素链被结合于纳米棒。特定的金棒具有尺寸且被照射成有规律地改变颜色，从红色到绿色(或黑色，如果仅仅是红色)并变回，这典型地表明棒的旋转。在Fl-ATP酶、桥连部件的组装和纳米棒检测部分的制备后，Fl-ATP酶被固定到固体基材上诸如显微镜载玻片。此固定通过纳米旋转的Fl马达结构组氨酸结合于镍表面来实现。通过添加ATP引起分子马达运动。将会被检测到的唯一运动将源于被连接于所附着的检测探针的马达。由于该连接将取决于结合于桥内的蛋白的待检测的靶向小分子代谢物的存在且因为在待检测的靶向小分子代谢物被结合于桥连部件内的蛋白时才可以仅仅导致纳米棒珠上的部分结合于桥连部件内的蛋白，因而观察到此运动将确认样品内存在待检测的靶向小分子代谢物。实施例2:分别制备纳米检测设备的四个部件:(I)由针对待检测的靶向小分子代谢物的特异性蛋白制造的蛋白桥；⑵修饰过的Fl-ATP酶；(3)镍涂覆的盖玻片；以及(4)涂覆的纳米棒。在制备这些部件后，通过添加待检测的靶向小分子代谢物将它们组装成设备。只有当待检测的靶向小分子代谢物存在而实现设备的组装时才能观察到附着于设备的纳米棒旋转。将被用作桥连蛋白的蛋白将被基因修饰以在将会是最佳地用于经由生物素-亲和素-生物素链附着于分子马达的位置中引入半胱氨酸。半胱氨酸的位置将被选择成对桥连蛋白是特异性的以确保不改变桥连蛋白的官能特征，且确保半胱氨酸并不会干扰用于附着可见的探针的DNA识别/结合位点的形成。桥连蛋白也可以被基因修饰以改变其对靶分子的特异性。在一个实施例中，可以对树胶醛糖激活蛋白进行突变以增强其对葡萄糖而不是树胶醛糖的亲和性。在另一个实施方案中，DNA识别/结合位点可以通过蛋白的基因修饰而被改变，使得桥 连部件识别不同的DNA序列以完成纳米设备的组装。修饰过的Fl-ATP酶。从大肠杆菌菌株AB004中分离出的Fl-ATP酶包含全部5个子单位且具有化学计量α3β3γ δ ε。这些蛋白的序列对应于基因银行登录号:α，ΑΑΑ24735 ； β，ΑΑΑ24737 ； y，AAA24736 ； δ，ΑΑΑ24734 ;以及 ε，ΑΑΑ24738，且具有下面的变化。进行突变以用丙氨酸替代α、β、Υ、δ和ε子单位中的所有现有的半胱氨酸。α子单位被突变以用6个组氨酸延长N端。Y子单位被突变以用半胱氨酸替代赖氨酸-109，这起到使用生物素马来酰亚胺进行生物素化的位点的作用。以3倍摩尔过量的EZLINKTM PEO马来酰亚胺激活生物素(Pierce Endogen ;产品#21901)在室温下温育I小时且轻微摇动来进行生物素化。通过尺寸排阻凝胶过滤去除未结合的生物素。在此位点共价结合的生物素起到亲和素的有效结合位点的作用，可以附着于此位点的其他生物素化的部分包括类似代谢物激活蛋白的桥连部件。y子单位的α、β域上的或ε子单位上的此半胱氨酸的替代可以被改变至并不干扰ATP酶的活性和/或旋转的任何暴露的位置。酶的这三个子单位α3β3γ子复合物也可以起到Fl-ATP酶的作用，正如5个子单位Fl-ATP酶能够起到的作用，其中通过突变用丙氨酸替代6个子单位的半胱氨酸。由任何生物源纯化而来的3个子单位或5个子单位Fl-ATP酶将满足此任务的需要，只要进行组氨酸-标签和半胱氨酸修饰。用于将Fl附着于盖玻片的此组氨酸标签可以可选择地(或另外)在α子单位和/或β子单位上，只要其不干扰ATP酶的活性。来自嗜热菌PS3的Fl-ATP酶的α 3 β 3 Y子复合物也成功地用于类似的实验中，α3β3γ子复合物包含β子单位上的IOX组氨酸标签和有利于生物素化和DNA附着的位置内的半胱氨酸。也可以使用F1，如来自衣藻属或菠菜叶绿体的Fl进行类似的工作构建。将生物素化的Fl添加到500 μ I的洗涤过的镍-次氮基三乙酸(N1-NTA)亲和树脂(Sigma-Aldrich产品#Ρ6611)中，并在室温下轻微地搅拌30分钟以使6 X组氨酸标签的Fl结合于N1-NTA树脂。将结合有Fl的N1-NTA树脂被装载到注射器-柱中且用Iml的洗涤缓冲液冲洗柱。以lmg/ml的浓度且相对于初始Fl浓度约8到10倍的摩尔比溶解在洗涤缓冲液中的中性亲和素(分子探针产品#A2666)被通过N1-NTA树脂以允许中性亲和素结合于生物素部分。在中性亲和素处理后，用5ml的洗涤缓冲液冲洗N1-NTA树脂以去除未结合的中性亲和素，然后用Iml的洗脱缓冲液从柱释放并收集生物素化且亲和素化的Fl。以这种方式将亲和素结合于Fl允许使用大量过量的亲和素并确保所有Fl结合亲和素。保持没有亲和素的任何Fl将降低检测灵敏度。如果在Fl结合于盖玻片后向Fl添加亲和素，那么这允许桥接部分的生物素化的蛋白直接结合于不存在Fl的盖玻片。这样的结合蛋白将结合纳米棒，但将不能够旋转，且因而降低灵敏度且被计算为增加的背景。在Fl的生物素化和凝胶过滤步骤后，Fl的回收通常是起始量的5%。在生物素化的Fl结合于N1-NTA树脂、亲和素化、和从N1-NTA树脂洗脱后，回收了起始Fl的约75%。生物素化且亲和素化的Fl的ATP酶活性是起始活性的约90%。用于制备N1-NTA盖玻片的过程。按照Kastner等人的程序(2003, BiophysicalJournal84:1651-1659)来制 备N1-NTA盖玻片。在500°C下烘焙2小时来预清洁盖玻璃(22X 22mm，VWR)。依次地，在90°C下的密封溶液(2% (V/V) 3-缩水甘油基氧基丙基-三甲氧基硅烷(Fluka，Buchs, Switzerland),0.01 % (V/V)乙酸)中温育玻璃 3 小时；在 60°C下的涂覆溶液(2% (V/V)N, N 双(羧甲基)-L-赖氨酸(Fluka, Buchs, Switzerland)、2mMKHCO3, ρΗΙΟ.0)中温育16小时；以及在室温下的Ni2+溶液(IOmMNiSO4, 5mM甘氨酸，pH8.0)中温育至少2小时。每一次涂覆步骤后，用超纯水洗涤玻璃。合成金纳米棒并用亲和素涂覆它们的方案。影响金纳米颗粒的形状和尺寸的因素包括鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)浓度、Au晶种浓度、银(AgNO3)的存在、NaOH、抗坏血酸浓度以及所有这些因素的合适组合。增加金纳米棒相对于其他形状的百分数的技术具有价值，原因是金纳米棒优选地用于检测测定，诸如本文描述的那些。在合成金纳米棒的典型实验中，CTAB涂覆的晶种溶液通过向IOml体积的CTAB(IOOmM)中添加25 μ I的Au溶液(50mM)，然后添加55 μ I的NaBH4 (30mM，冰冷却的)且剧烈涡旋约2分钟来制备。此晶种溶液可以立即被使用，但将保持活性至少一天。为了生长金纳米棒，向IOml CTAB(IOOmM)中添加100 μ I的Au溶液(50mM)，然后添加AgNO3 (10mM，50-125 μ I)且轻微摇动。接着，添加85 μ I的抗坏血酸(IOOmM)且立即摇动，使溶液成为无色的。最后，添加24μ I的所制备的晶种溶液且轻微摇动。10-20分钟内显示出紫色与蓝色的混合物。在高温(55-100°C )下生长金纳米棒导致溶液中更多的深蓝色。在此方法中，晶种浓度对于增加纳米棒的百分数来说是最重要的参数。
金亲和素化的程序:使用1.5ml的金棒制备；此以4000rpm被离心10分钟；弃去上清液且将小球重新悬浮在Iml的ImM CTAB中。以6000rpm将此混合物离心5分钟，弃去上清液且小球再次重新悬浮在0.5ml的ImM CTAB中。采集吸光光谱且用ImM CTAB稀释样品，使得棒的吸光度峰值(A650)是约2.0。添加中性亲和素至40μ g/ml的最终浓度；以及在室温下温育混合物且轻轻搅拌I小时。这产生能够被存储在室温下或4°C下的亲和素化的棒。各部分组装成官能化的设备。将三羟甲基氨基甲烷缓冲液(50mM三羟甲基氨基甲烷，IOmM KCl，ρΗ8.0)中的5 μ I的亲和素化的Fl (80g/ml)点样到N1-NTA盖玻片且温育5分钟。接着用三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗涤盖玻片30秒。接下来的步骤包括向盖玻片添加4μ I的生物素化的蛋白桥且温育5分钟。然后用三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗涤组件30秒。接着在将结合于组件的桥连部件的蛋白的小分子的存在下，用4μ I的亲和素涂覆的金棒温育组件。温育混合物5分钟并用三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗涤30秒。为了在显微镜下观察到旋转，添加4μ I的三羟甲基氨基甲烷缓冲液。此缓冲液还将包含ImM的Mg2+-ATP以引起旋转。

添加到盖玻片的每一个部分的体积可以按照期望基于测定格式来改变。虽然此实施例显示了添加ImM的Mg2+-ATP来引起旋转，但只要添加0.4mM的Mg2+-ATP已显示旋转。在这些较低的ATP浓度下，旋转速率较慢且因而记录旋转所需的帧速率并不需要太快。使用来自嗜热菌PS3的Fl的三个子单位复合物，可以在低至2pM的ATP浓度下观察到旋转。下面描述了使用与生物素和DIG桥连的蛋白组装设备使得DIG将结合于抗DIG涂覆的纳米棒的可选择的方案。此实验还使用与上面描述的Fl不相同的F1，原因在于该Fl包含用于生物素化的YY215C的额外突变，使得亲和素可以产生附着于Fl的两个点。此实验不同于上面描述的实验，原因在于该实验采用了流动池。因此，可以在添加ATP之前拍摄已组装的设备的视频，然后又在ATP添加之后引起旋转后拍摄视频。45 μ I的具有α3β3γ δ ε的组成的子单位且包括突变UK109C、YL215C)的
0.5nM Fl与8 μ I的蛋白混合以便形成桥。在室温下温育该混合物30分钟。然后向样品中添加相同体积的BSA(20mg/ml)。通过使用双面透明胶带将N1-NTA盖玻片附着于载玻片来制备显微镜流动池。每一个流动池被填充有25 μ I的样品且在室温下温育5分钟。用300 μ I的含有10mg/mlBSA的洗涤缓冲液(50mM三羟甲基氨基甲烷，IOmM KCl，pH8)洗涤流动池。添加25 μ I的抗DIG涂覆的金纳米棒并在室温下温育5分钟，然后用洗涤缓冲液进行5X200 μ I的洗涤。在使流动池置于显微镜下之前，向流动池中添加100 μ I的旋转缓冲液(50mM三羟甲基氨基甲烷，IOmMKCl，pH8、0.2mM ATP,0.2mM MgCl2,29.lmg/ml 的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、1.25mg/ml的丙酮酸激酶(PK)、1.25mg/ml的乳酸脱氢酶(LDH)、4mg/ml的还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH))。PEP、PK、LDH和NADH用于从ADP和磷酸盐再生ATP以便在整个测量中保持浓度恒定。借助或不借助分束器以500帧每秒拍摄视频。分束器允许测量视频的每一帧内来自纳米棒的红色和绿色散射光两者的强度振荡。在不存在分束器时，红光滤光器仅用于测量红光振荡。下面描述了振荡分析。从纳米棒散射的光强度的振荡分析以确定纳米棒是否旋转。一步检测程序。由完全组装的纳米检测设备和溶液中存在的ATP制备载玻片。为了能够区分布朗运动与实际的旋转，优选以足够快到能够分开两种变化源的速率收集数据。在优选的实施方案中，这通过使用单光子计数器来测量变化而实现，这允许实时可视化旋转。多步程序。可以检测旋转的另一种方式是使用流动池和高速视频照相机。这要求拍摄至少两个视频，但是优选三个。至少拍摄存在和不存在ATP时棒的视频。在偏光透镜旋转时拍摄棒的视频是有帮助的。这测定了如果该棒旋转时，待预期的强度振荡的深度。此对照增强了测定Fl依赖性旋转的信心，然而这也可以无需额外的测量来证实。软件:为实现同一目的而开发出的两种不同的软件是棒因Fl或不因Fl而旋转。所收集的数据总是随时间变化的强度。第一种方法包括分析来自高速照相机的数据的趋势。软件读取数据，优选来自三个实验:没有ATP、没有ATP同时旋转偏光镜以及有ATP。旋转期间预期的动态范围由偏光镜控制来计算且可以用于确保正在检测的分子实际上是金棒。接着，动态范围与有和没有ATP时的测量结果的标准差进行比较。如果有ATP的视频不同于没有ATP的视频，且在整个所计算的全动态范围内波动，那么分子正在旋转。软件程序能够对给定视域内的所有棒做这些。软件是确定旋转的优选方式，但是也可以手动收集和解释信息来做出最终的确定。任一种方式来说，标准是相同的。可以由本领域技术人员使用标准技术来执行软件。软件具体地回答了视域内存在的所有棒是否在发生旋转。为光子计数系统而开发的软件计算了信号处理中常用的数值统计测量，包括周期、频率、跃迁率、工作周期、超调、下超调、停留时间、傅里叶变换以及能谱。唯一需要的统计是能谱，尽管通常计算傅里叶变换来得到能谱。可以从能谱确定是否发生与布朗运动不同的旋转。来自运动的额外分析的其他统计是有用的，但不需以之确定是否发生Fl依赖性旋转。可以由本领域技术人员使用标准技术来执行软件。实施例3:在本发明的一些实施方案中，纳米检测设备用于检测蛋白靶。在一个实施例中，由大肠杆菌0157:H7菌株产生的Stx2Shiga毒素被用作蛋白祀。产生Shiga毒素的大肠杆菌(STEC)菌株产生称为Stxl和STx2Shiga毒素的细胞毒素，其具有A，B5的子单位组成。为了检测Stx2毒素，抗-Stx2A和抗-Stx2B单克隆抗体在检测设备中被分别用作检测和捕获抗体。对蛋白检测来说，生物素化的蛋白G被结合到附着于载玻片上的F1马达的亲和素。蛋白G将抗-Stx2B(“捕获”)抗体结合并固定在载玻片的表面上。金纳米棒被涂覆有未生物素化的蛋白G，“检测”抗体，即抗-Stx2A被结合于该蛋白G。检测和捕获抗体对靶向蛋白(Stx2毒素)的不同域是特异性的。此纳米设备可以检测含有产生Stx2的大肠杆菌菌株(EDL933)的细胞上清液中的Stx2毒素(图3A和3C)，与产生大肠杆菌非毒素的菌株(MG1655)进行比较(图3B和3D)，正如通过测定30个连续视域内观察到的纳米棒的数目。图3C和3D是对照；在图3C中，捕获抗体被省略且在图3D中，Stx2毒素被省略。纳米设备可以检测唾液样品中的Stx2毒素蛋白，与含有产毒素菌株(EDL933)或非毒素菌株(MG1655)的纯化毒素进行比较，正如通过30个连续视域内观察到的纳米棒的数目所测量的，正如图4显示的。 图5显示了用于以每ml产毒素菌株的细胞形成单元(B卩，细菌细胞的数目)呈现的粗细胞上清液中的Stx2蛋白毒素的检测限值。以纳米设备组件的10个连续视域(蓝色柱)对10个连续视域(红色柱)或30个连续视域(绿色柱)内的旋转纳米棒的数目测量了检测。通过对组装的纳米设备相对于10个连续视域内的非特异性结合的纳米棒的数目进行计数获得了 108cfu/ml的检测限值。通过对同样数目的视域内的旋转纳米棒的数目进行计数提高了检测限值1000倍，且通过测量30个连续视域内的旋转将检测限值提高100，100倍至103cfu/ml。图6显示了使用纯化的Stx2靶向蛋白的系统的基于旋转的检测限值。数据以随样品内存在的靶分子的数目(图6A)或靶向浓度(图6B)的变化表达。使用2μ I的样品体积且仅计数10个视域，可以在IOfgmr1溶液中检测到少至1000个靶分子。
实施例4:在本发明的一些实施方案中，纳米检测设备用于检测样品内的超过一个靶。在一些实施方案中，在一个样品内可以检测到多个靶，如蛋白靶和DNA靶。这可以通过使用不同颜色的纳米棒而发生，如绿色、红色或黄色，以对应于不同的靶分子。图7描绘了用于确认和量化视域的数码照片内的红色、绿色、蓝色和黄色纳米棒的数目的算法中使用的标准的概述。这些包括给定范围的红色、绿色和蓝色值内的相邻像素的数目以及量化在具有给定颜色的纳米棒的预期值的给定范围内的同一颜色范围内的相邻像素的圆度和直径的量度。具有足够圆形的且具有对应于它们的直径的红色、绿色、蓝色(RGB)值的共同范围的唯一的连续像素的组被计数为特定颜色的纳米棒，因而来自纳米尺度的灰尘的光被去除。图8描绘了用于Stx2毒素蛋白(红色纳米棒)和stx2基因DNA序列(绿色纳米棒)的在单孔内多像素检测的纳米设备的部分。每一个孔内的载玻片表面包含被按照两种方式中的一种所修饰的Fl。Fl分子的一列包含用于DNA检测的暴露的亲和素而Fl的第二叠加的列包含用于Stx2蛋白(抗-Stx2B抗体)的暴露的捕获抗体。来自大肠杆菌0157:H7的上清液的样品在孔内温育，然后添加包含纳米棒的溶液。红色纳米棒被用蛋白G和抗-Stx2A抗体官能化且绿色纳米棒被用蛋白G和抗-FITC单克隆检测抗体官能化。当stx2基因革巴存在时，其被转化成用于纳米设备组装的3’生物素化，5’FITC-标签的DNA。图9描绘了以3次重复的平均值计的针对Stx2毒素和stxl基因的同时多像素检测蛋白和DNA的结果。数据显示出当在同一孔内同时探测时，特异性的蛋白和DNA靶可以被检测且彼此区分。实施例5:在本发明的一些实施方案中，纳米检测设备用于包括作为致动子的转录激活蛋白的代谢物检测。一个实施方案是可以检测单个环腺苷酸(cAMP)分子的设备。cAMP已知为第二信使，因为其合成通过多种信号分子经由腺苷酸环化酶刺激和抑制G-蛋白-偶联受体的激活和抑制来调控。结合于cAMP以形成活性构象的细菌蛋白，分解代谢产物激活蛋白(CAP)，将被用在纳米设备中。乳糖操纵子的正性调控将涉及结合于cAMP的CAP结合于DNA。此细菌分解代谢产物激活蛋白(CAP)，优选大肠杆菌CAP将被修饰以在将允许由Fl-ATP酶马达经由亲和素的结合进行组装的位置包含可开裂的组氨酸标签(基于纯化目的)和半胱氨酸(用于由生物素马来酰亚胺进行生物素化)。半胱氨酸可以被添加到，如，但不限于大肠杆菌CAP的N端或残基-109。含有能够结合于CAP的激活构象的序列的DNA分子将被生物素化以便附着于亲和素涂覆的金纳米棒。纳米设备包括Fl分子马达、改变的CAP以及由DNA受体序列官能化的金纳米棒，正如图10描绘的。检测激活纳米设备的组装的靶向CAMP将经由暗视场显微镜检查从纳米棒散射的光来完成。cAMP结合于CAP可以引起产生针对DNA受体序列的高亲和性结合位点的构象变化。显微镜载玻片将被制备以包含结合的生物素化的Fl的阵列，生物素化的CAP将经由生物素-亲和素链被固定至该生物素化的F1。靶向cAMP分子高亲和性地结合于固定在载玻片上的F1分子的旋臂上的CAP (图10A)将激活蛋白以产生针对其受体DNA序列的高亲和性结合位点(图10B)。纳米设备的组装随后通过添加被具有特异性地结合于激活的CAP-cAMP复合物的序列的DNA分子的涂层官能化的金纳米棒来完成(图10C)。检测激活纳米设备的组装的靶向cAMP将经由暗视场显微镜检查从纳米棒散射的光来完成，正如本文描述的。实施例6:在本发明的一些实施方案中，使用转录阻遏蛋白来完成代谢物检测。在一个实施方案中，使用NADH阻遏蛋白(NRP)来制备检测单个NADH分子的纳米尺度的检测设备。还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)是细胞能量通货的主要形式。在磷酸化作用期间，线粒体氧化NADH以产生ATP，细胞NADH的水平可以提供对细胞能量储备的了解。NRP充分表征了转录阻遏蛋白。NRP将由包含具有可开裂的组氨酸标签的NRP (以提供可以使用镍珠纯化的形式)的质粒表达。NRP序列也将被改变以包括不会干扰NRP功能，但可以经由生物素马来酰亚胺被生物素化的半胱氨酸。NRP将经由亲和素被固定在F1分子马达的旋臂上。被亲和素官能化的纳米棒将被涂覆有对NRP结合位点是特异性的生物素化的DNA序列。由于在纯化期间，用NRP结合NADH纯化，此二核苷酸将通过酸性硫酸铵沉淀物被去除。接着，在NAD+的存在下除去硫酸铵允许被NAD+结合的NRP 二聚作用。为了检测NADH，含有结合的NAD+的生物素化的NRP将被添加到已经被固定在显微镜载玻片上的亲和素化的Fl-ATP酶中(图12A-B)，且组装将通过添加由对NRP是特异性的DNA官能化的金纳米棒来完成(图12C)。当靶结合造成诱导DNA离解的构象变化时，通过结合于显微镜载玻片的纳米棒的数目的减少来进行NADH的检测。因为NAD+或NADH总是结合于NRP，所以检测系统能够确定两者的比。NRP也可以被用在NAD+检测系统中。在这些条件下，载玻片将提前被制备有NADH，使得DNA官能化的纳米棒将不被结合。不束缚于任何理论，我们期望NRP将表现得像转录激活蛋白以能够在添 加NAD+时由DNA涂覆的纳米棒进行组装。实施例7:本发明的一些实施方案提供了纳米设备的有序阵列用于含有转录调控蛋白的代谢物检测。在阻遏蛋白依赖性纳米设备的一些实施方案中，NADH由纳米设备的拆解来检测，正如图13所描绘的。因而，所释放的纳米棒的数目将被更容易确认为干扰网格持续性的遗漏的光斑。在其他实施方案中，有序的阵列可以被用于检测cAMP检测用的使用激活因子依赖性纳米设备的系统。有序阵列将由显微镜载玻片的表面上的暴露的N1-NTA岛的阵列来制造，每一个阵列能够结合单个Fl分子。制造工艺可以是如电子束光刻，正如图14所描绘的。首先，用IOOmM EDTA冲洗干净的N1-NTA涂覆的显微镜载玻片以去除镍且彻底洗涤。硅醇-NTA保持嵌入在玻璃表面上。然后用聚_(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)抗蚀单层( 40nm)旋涂表面。使用预设计的图案将PMMS抗蚀层随后暴露于电子束。在随后的O2等离子处理后，将增加硫酸镍，这将会结合于通过电子束暴露的岛NTA。O2等离子处理步骤清洁表面以有利于镍牢固的粘合。最后，将用丙酮洗涤表面以去除PMMA。这样，载玻片的表面将包括组氨酸标签的Fl将会结合的镍岛的有序阵列。镍岛之间的间距隔开得足够远以防止一个金纳米棒桥接在相邻岛上的两个Fl分子之间，如约300nm。还提供足够的距离，使得任一个纳米棒的旋转不会受到相邻岛上的纳米棒的旋转所影响。 有序的阵列优选地使每一个N1-NTA岛具有一个Fl分子。镍岛可以具有适于提供用于至少一个Fl分子结合的碱 基的直径。
权利要求
1.一种用于检测至少一种靶向小分子代谢物的方法，包括锚固部件、桥连部件以及信号产生部件，其中: (a)所述锚固部件包括分子马达，其中所述分子马达是能够被引起能够被检测到的平移或旋转运动的生物分子或合成分子； (b)所述桥连部件包括至少一个生物组分或合成组分，所述至少一个生物组分或合成组分结合或以其他方式应答于待检测的小代谢物的存在，其中所述桥连部件通过共价的或高亲和性结合的相互作用被连接于所述锚固部件； (c)信号产生部件，所述信号产生部件包括至少一个电磁检测探针，所述至少一个电磁检测探针已经被在待检测的所述代谢物的存在下特异性地结合于所述桥连部件或与所述桥连部件分离的部分官能化。
2.—种纳米检测样品中的靶分子的方法，包括: (a)使多个分子马达中的每一个结合于选定的桥连部件，其中所述分子马达是能够被引起能够被检测到的平移或旋转运动的生物分子或合成分子，且所述桥连部件是结合或以其他方式应答于待检测的小代谢物的存在的至少一个生物部件或合成部件； (b)在由所述桥连部件组装所述分子马达后，将所述多个分子马达锚固到固体载体； (C)将对所述桥连部件是特异性的电磁检测探针结合于固定的桥连设备，其中所述桥连部件在不存在靶向代谢物下具有对所述探针的高亲和性；且其中靶向代谢物结合于所述桥连部件导致探针对所述桥连部件的亲和性减弱； (d)应用疑似含有对所述桥连部件是特异性的所述靶向代谢物的样品； (e)引起偶联于所述固体载体的所述至少一个分子马达的平移或旋转运动；以及 (f)通过显微镜检测偶联于所述固体载体的所述至少一个分子马达的平移或旋转运动，其中由探针的电磁特性的变化标示的在存在的所述样品内存在平移或旋转运动表示所述样品内缺乏靶向代谢物，而由探针的电磁特性缺乏变化标示的在存在的所述样品内不存在平移或旋转运动表示所述样品内存在靶向代谢物。
3.—种纳米检测样品中的靶分子的方法，包括: (a)使多个分子马达中的每一个结合于选定的桥连部件；其中所述分子马达是能够被引起能够被检测到的平移或旋转运动的生物分子或合成分子，且所述桥连部件是结合或以其他方式应答于待检测的小代谢物的存在的至少一个生物部件或合成部件； (b)在由所述桥连部件组装所述分子马达后，将所述多个分子马达锚固到固体载体； (C)在不存在所述电磁探针下应用疑似含有对所述桥连部件是特异性的所述靶向代谢物的样品； (d)结合对所述桥连部件是特异性的电磁探针，其中所述桥连部件在对所述桥连部件是特异性的靶向代谢物被结合于所述桥连部件时具有对所述探针的高亲和性； (e)引起偶联于所述固体载体的所述至少一个分子马达的平移或旋转运动；以及 (f)通过监测所述探针的电磁特性的变化由显微镜检测偶联于所述固体载体的所述至少一个分子马达的平移或旋转运动， 其中由所述样品内存在的平移或旋转运动的增强标示的所述探针对所述桥连部件的增强的亲和性表明所述样品内存在对所述桥连部件是特异性的靶向代谢物，而由所述样品内存在的平移或旋转运动的减弱标示的所述探针对所述桥连部件的减弱的亲和性表明所述样品内不存在对所述桥连部件是特异性的靶向代谢物。
4.一种纳米检测样品中的靶分子的方法，包括: (a)使多个分子马达中的每一个结合于固体载体，其中所述分子马达是能够被引起能够被检测到的平移或旋转运动的生物分子或合成分子； (b)使多个分子马达中的每一个连接至桥连部件，所述桥连部件包括结合或以其他方式应答于待检测的小代谢物的存在的至少一个生物部件或合成部件； (c)将对所述桥连部件是特异性的电磁检测探针结合于固定的桥连设备，其中所述桥连部件在不存在靶向代谢物下具有对所述探针的高亲和性；且其中靶向代谢物结合于所述桥连部件导致所述探针对所述桥连部件的亲和性减弱 (d)应用疑似含有对所述桥连部分是特异性的所述靶分子或靶向代谢物的样品； (e)引起偶联于所述固体载体的所述至少一个分子马达的平移或旋转运动；以及 (f)通过显微镜检测偶联于所述 固体载体的所述至少一个分子马达的平移或旋转运动，其中由探针的电磁特性的变化标示的在存在的所述样品内存在平移或旋转运动表示所述样品内缺乏靶向代谢物，而由探针的电磁特性缺乏变化标示的在存在的所述样品内不存在平移或旋转运动表示所述样品内存在靶向代谢物。
5.—种纳米检测样品中的靶分子的方法，包括: (a)使多个分子马达中的每一个结合于固体载体，其中所述分子马达是能够被引起能够被检测到的平移或旋转运动的生物分子或合成分子； (b)使多个分子马达中的每一个连接至桥连部件，所述桥连部件包括结合或以其他方式应答于待检测的小代谢物的存在的至少一个生物部件或合成部件； (c)在不存在所述电磁探针下应用疑似含有对所述桥连部件是特异性的所述靶向代谢物的样品； (d)结合对所述桥连部件是特异性的电磁探针，其中所述桥连部件在对所述桥连部件是特异性的靶向代谢物被结合于所述桥连部件时具有对所述探针的高亲和性； (e)引起偶联于所述固体载体的所述至少一个分子马达的平移或旋转运动；以及 (f)通过监测所述探针的电磁特性的变化由显微镜检测偶联于所述固体载体的所述至少一个分子马达的平移或旋转运动， 其中由所述样品内存在的平移或旋转运动的增强标示的所述探针对所述桥连部件的增强的亲和性表明所述样品内存在对所述桥连部件是特异性的靶向代谢物，而由所述样品内存在的平移或旋转运动的减弱标示的所述探针对所述桥连部件的减弱的亲和性表明所述样品内不存在对所述桥连部件是特异性的靶向代谢物。
6.如权利要求2到5中任一项所述的方法，其中在步骤(d)之前、之后或与步骤(d)同时执行步骤(C)。
7.如权利要求2到6中任一项所述的方法，其中所述桥连部分是转录调控蛋白，所述转录调控蛋白包括针对特异性DNA序列的结合位点和针对该小分子代谢物的结合位点且所述信号产生部件包括已知结合所述转录调控因子的特异性DNA序列。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述转录调控蛋白是转录激活蛋白，其中当所述特异性DNA序列结合于所述转录激活蛋白时出现所述设备的组装，这仅发生在所述小分子代谢物结合于所述转录调控蛋白的存在下。
9.如权利要求7所述的的方法，其中所述转录调控蛋白是转录阻遏蛋白，其中当所述特异性DNA序列结合于所述转录阻遏蛋白时出现所述设备的组装且所述电磁检测探针在所述小分子代谢物的存在下与所述蛋白分离。
10.如权利要求2到6中任一项所述的方法，其中所述桥连部件是信号转导蛋白，所述信号转导蛋白包括针对该小分子代谢物的结合位点，其中所述信号转导蛋白在结合于所述小分子代谢物时改变构象，且所述信号产生部件包括检测所述信号转导蛋白的所激活的构象的抗体。
11.如权利要求2到6中任一项所述的方法，其中所述桥连部件是DNA证明蛋白，所述DNA证明蛋白识别DNA序列中的修饰碱基，且所述信号产生部件包括对待检测的DNA序列是互补的DNA序列，其中当待检测的所述DNA与固定于所述电磁检测探针的所述DNA序列进行DNA碱基配对时发生所述设备的组装。
12.如权利要求2-11中任一项所述的方法，其中所述电磁指示器包括至少一个光颗粒、磁颗粒和热颗粒。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述电磁指示器包括包含至少一个荧光珠和光散射颗粒的光指示器。
14.如权利要求2-11中任一项所述的方法，其中所述电磁指示器是来自所述元素金属组的胶态颗粒。
15.一种纳米检测设备，其包括锚固部件、桥连部件以及信号产生部件，其中: (a)锚固部件包括经由定点突变修饰的Fl-ATP酶分子，以便包括在Fl-α或Fl-β子单位的N端上的组氨酸标签和Fl- Y子单位上的半胱氨酸，其中多个Fl-ATP酶分子被固定至显微镜载玻片的表面，使得每一个Fl-ATP酶分子被定位成所述Fl-Y子单位远离所述显微镜载玻片的所述表面，其中所述Fl-Y子单位上的所述半胱氨酸被生物素化； (b)所述桥连部件包括结合至或以其他方式应答于待检测的小分子代谢物的存在的蛋白，其中所述桥连部件内的所述蛋白被生物素化并通过生物素-亲和素-生物素链由所述锚固部件的生物素化的Fl-Y子单位连接于所述锚固部件；以及 (c)所述信号产生部件包括电磁检测探针，所述电磁检测探针已经在待检测的所述代谢物的存在下，被特异性地结合于所述桥连部件的所述蛋白的部分官能化。
16.如权利要求15所述的纳米检测设备，其中所述桥连部件内的所述蛋白是转录调控蛋白，所述转录调控蛋白包括针对特异性DNA序列的结合位点和针对该小分子代谢物的结合位点且所述信号产生部件包括已知结合所述转录调控因子的特异性DNA序列。
17.如权利要求16所述的纳米检测设备，其中所述转录调控蛋白是转录激活蛋白，其中当所述特异性DNA序列结合于所述转录激活蛋白时出现所述设备的组装仅发生在所述小分子代谢物结合于所述转录调控蛋白的存在下。
18.如权利要求16所述的纳米检测设备，其中所述转录调控蛋白是转录阻遏蛋白，其中当所述特异性DNA序列结合于所述转录阻遏蛋白时出现所述设备的组装且所述电磁检测探针在所述小分子代谢物的存在下与所述蛋白分离。
19.如权利要求15所述的纳米检测设备，其中所述桥连部件内的所述蛋白是信号转导蛋白，所述信号转导蛋白包括针对该小分子代谢物的结合位点，其中所述信号转导蛋白在结合于所述小分子代谢物时改变构象，且所述信号产生部件包括检测所述信号转导蛋白的所激活的构象的抗体。
20.如权利要求15所述的纳米检测设备，其中所述桥连部件内的所述蛋白是DNA证明蛋白，所述DNA证明蛋白识别DNA序列中的修饰碱基，且所述信号产生部件包括对待检测的DNA序列是互补的DNA序列，其中当待检测的所述DNA与固定于所述电磁检测探针的所述DNA序列进行DNA碱基配对时发生所述设备的组装。
21.如权利要求15-20中任一项所述的纳米检测设备，其中所述电磁指示器包括至少一个光颗粒、磁颗粒和热颗粒。
22.如权利要求21所述的纳米检测设备，其中所述电磁指示器包括包含至少一个荧光珠和光散射颗粒的光指示器。
23.如权利要求15-20中任一项所述的纳米检测设备，其中所述电磁指示器是来自所述元素金属组的胶态颗粒。
24.一种用于检测分子是否结合了转录调控蛋白的激活因子的方法，包括: (a)制备根据权利要求15所述的纳米检测设备； (b)使所述设备与靶向小分子代谢物接触； (c)在允许Fl-ATP酶的活性旋转所述Fl-Y子单位的条件下，向所述设备中添加ATP；以及 (d)比较在靶向代谢物存在下由结合于所述显微镜载玻片的旋转的电磁检测探针产生的信号，与在所述靶向代谢物不存在下由所述探针产生的所述信号，其中在所述代谢物存在下，所述信号的增强表明所述代谢物结合于所述转录调控蛋白。
25.一种用于检测结合阻遏蛋白的分子的方法，包括: (a)制备根据权利要求18所述的纳米检测设备； (b)使所述设备与靶向小分子代谢物接触； (c)在允许Fl-ATP酶的活性旋转所述Fl-Y子单位的条件下，向所述设备中添加ATP；以及 (d)比较在靶向代谢物存在下由结合于所述显微镜载玻片的旋转的电磁检测探针产生的信号，与在所述靶向代谢物不存在下由所述探针产生的所述信号，其中在所述代谢物存在下，所述信号的减弱表明所述代谢物结合于所述阻遏蛋白。
26.一种用于检测分子结合于信号转导蛋白的方法，包括: (a)制备根据权利要求19所述的纳米检测设备； (b)使所述设备与靶向小分子代谢物接触； (c)在允许Fl-ATP酶的活性旋转所述Fl-Y子单位的条件下，向所述设备中添加ATP；以及 (d)比较在靶向代谢物存在下由结合于所述显微镜载玻片的旋转的电磁检测探针产生的信号，与在所述靶向代谢物不存在下由所述探针产生的所述信号，其中在所述代谢物存在下，所述信号的增强表明所述代谢物结合于所述信号转导蛋白。
27.一种证明DNA的方法，包括: (a)制备根据权利要求20所述的纳米检测设备； (b)使所述设备与待证明的DNA序列接触； (c)在允许Fl-ATP酶的活性旋转所述Fl-Y子单位的条件下，向所述设备中添加ATP；以及 (d)通过在待证明的DNA存在下，测定由结合于所述显微镜载玻片的旋转的电磁探针产生的信号来测定待证明的DNA序列中存在修饰DNA，其中当与固定于所述电磁检测探针的DNA序列进行DNA碱基配对时产生信号。
28.如权利要求24、25、26或27所述的方法，其中步骤(d)包括使用暗视场显微镜的可视检测来检测所述信号。
29.如权利要求24、25、26或27所述的方法，其中步骤(d)包括测定来自检测探针的一个或多个波长下的光的强度振荡。
30.一种试剂盒，包括: (a)蛋白，其特异性地结合感兴趣的小分子代谢物，其中所述蛋白以不干扰所述感兴趣的小分子代谢物的方式被生物素化； (b)Fl-ATP酶分子，其中所述Fl-ATP酶分子具有组氨酸标签以有利于Fl-ATP酶附着于固体载体且另外其中所述Fl-ATP酶被生物素化；以及 (c)金纳米棒，其被结合于分子，这在所述蛋白被结合于感兴趣的小分子代谢物时识别(a)内的所述蛋白。
31.如权利要求30所述的试剂盒，还包括固体载体。
32.如权利要求30所述 的试剂盒，还包括亲和素。
全文摘要
本发明提供了用于高度灵敏地检测感兴趣的代谢物的方法和组合物，其包括使用包括锚固部件、桥连部件以及信号产生部件的纳米检测设备，其中锚固部件是分子马达，信号产生部件是纳米棒且桥连部件是特异性地结合于感兴趣的代谢物的蛋白。
文档编号C12M1/34GK103221530SQ201180043168
公开日2013年7月24日 申请日期2011年7月7日 优先权日2010年7月7日
发明者韦恩·弗拉施 申请人:作为亚利桑那州的一个法人团体并且代表亚利桑那州大学行事的亚利桑那州大学董事会