专利名称：食品或饲料中三聚氰胺掺杂的快速检测方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及三聚氰胺的快速检测技术及试剂盒。
背景技术：
三聚氰胺(Melamine)，别名蜜胺，分子式:C3N6H6，分子中氮含 量高达66.7%。三聚氰胺是一种化工原料，可由尿素合成而得，是生 产三聚氰胺-甲醛树脂的原料，应用广泛。但是三聚氰胺不是食品添 加剂。
食品和饲料中蛋白质的含量通常采用"凯氏定氮法"测定。该方法 是将蛋白质消化处理，生成铵盐，通过测定氨的含量而算出氮的含量， 再通过氮的含量而推算出样品中的蛋白质含量。现行产品质量标准一 般对含蛋白质较高的食品或饲料原料作出含量最低要求的规定，如生 鲜奶中蛋白质的含量应大于或等于2.95%，即l升生鲜奶中蛋白质的含 量应大于或等于29.5克。由于三聚氰胺在"凯氏定氮法"测定样品时能 增加样品中蛋白质的表观含量(1克三聚氰胺约可增加4克蛋白质的表 观含量)，因此被不法分子违法添加在食品或饲料中。掺假者在生鲜 奶中掺三聚氰胺， 一般在每l升的掺入量在几克以上，否则掺假就没 有意义。
2007年，美国报道了宠物猫、狗因食入含三聚氰胺饲料而死亡的 事件，随后美国食品药品管理局(FDA)制订了相应的检验方法。2008 年9月11日，有关部门披露，某些奶粉中含有三聚氰胺，导致了一些
婴幼儿因食用含三聚氰胺奶粉而出现肾结石症状，少数婴幼儿抢救无 效而死亡。随后在一些液体奶和与奶粉有关的食品中也检出三聚氰 胺，给整个食品行业带来巨大的冲击，社会影响极坏。其中三鹿奶粉 中有两个批号的产品检出三聚氰胺的含量分别为每千克含二千多毫
克和六千多毫克。2008年10月，国家有关部门参考美国食品药品管理 局(FDA)和美国食品化学品法典(FCC)三聚氰胺检测方法，制定 了《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》国家标准(GB/T 223888-2008)。该标准中规定乳及乳制品中三聚氰胺可根据限量的要 求，选用高效液相色谱法、液相色谱-质谱法和气相色谱-质谱法中的 其中一种。
"三聚氰胺"事件后，国家有关部门的调査结果表明，原料奶在进 入奶制品生产企业进行生产前经历了奶站收购原料奶、运输等环节， 这些环节易被不法分子违法添加三聚氰胺，是风险控制的关键所在， 一旦原料奶混有三聚氰胺而生产企业未及时发现，进入生产环节后将 会导致大量的成品奶受污染。 一吨掺杂的原奶可使几百吨奶制品报 废。如果用受污染原料制成的奶制品进入流通环节，召回产品将会耗 费大量的人力和财力并产生极坏的影响。在奶站和奶制品生产企业收 购原料时对其是否含三聚氰胺进行检验是最为必要和最为经济的。
原料奶是低价值商品，奶站收购的原料来自不同的牧场或专业饲 养户，数量多少不一，有的交售一、两百公斤，有的交销两、三吨或 一、二十吨。如果都采用仪器方法进行检验， 一来会大大增加检验成 本导致终端产品的价格明显升高，二来检验周期太长不切合实际(原
料奶需低温保存以防变质)，还有就是中小奶制品企业不具备相应的 检验设备和检验人才。
其它食品或饲料原料，如豆粉、鱼粉等的收购也面临同样的问题， 在收购原材料的时应检验其是否含有三聚氰胺。
现有的检验方法(高效液相色谱法、液-质联用法和气-质联用法) 存在设备投入成本高、检验周期长、检验费用大，检验操作不易为普 通工作人员掌握，在原料收购站、中小企业难以推广等缺点。
因此，需要建立检验成本低、操作简便、不使用贵重仪器，省时、 一般工作人员也能掌握的快速检测方法，以对付在食品或词料中掺三 聚氰胺的违法行为，保护企业自身的利益。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术上存在的缺点，提供一种低检验 成本、操作简便、省时、不使用贵重仪器、易于为普通工作人员掌握， 易于推广的食品或饲料中三聚氰胺掺杂的快速检测方法。
本发明的另一个目的是提供用于检测食品或词料中三聚氰胺掺 杂的试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案
食品或饲料中三聚氰胺掺杂的快速检测方法，包括如下步骤
(1)除去待测样品中的大部分蛋白质
对于液态样品，往液态样品中加入甲醇或甲醇水溶液，再加入三 氯乙酸溶液，均质、超声处理，离心处理，取出离心后的上清液；
对于粉末状样品，先加水、均质，然后加入甲醇或甲醇水溶液，
再加入三氯乙酸溶液，均质、超声处理，离心处理，取出离心后的上
清液；
对于颗粒或块状样品，研细或粉碎处理后，先加水、均质，然后 加入甲醇或甲醇水溶液，再加入三氯乙酸溶液，均质、超声处理，离 心处理，取出离心后的上清液；
(2) 除去上清液中残留的微量蛋白质制得供试液 上清液流过反相固相萃取柱，残留的微量蛋白质被柱上填料吸
附，收集过柱后的流出液作供试液；
(3) 结晶反应和结果判断 往供试液中加入三硝基苯酚的饱和水溶液，静置；当供试液中含
有三聚氰胺，加入三硝基苯酚的饱和水溶液，静置后将可观察到试管 中析出针束状晶体(目视可辨别)；三聚氰胺掺杂量越大，析出的速 度越快，晶体的析出量越大；不含三聚氰胺的供试液无析出物。
吸出含析出物的液体一滴，置于载玻片上，压片，在低倍显微镜 下检视，析出的晶体呈针束放射状，易于鉴别，即可确证，无需再进 行色谱检验。
不含甲醇的三聚氰胺水溶液加入三硝基苯酚饱溶液后立即生成 胶团状析出物。三聚氰胺溶于甲醇或者含甲醇浓度10%以上的水溶 液，所得到的溶液加入三硝基苯酚饱溶液后析出针束状晶体。
当不含三聚氰胺的样品，按本发明粗除蛋白质之方法处理后得到 的上清液(未过反相固相萃取柱)，取出置于试管中，加入三硝基苯 酚饱溶液后有呈雾状的固体微粒析出，表明上清液(未过反相固相萃
取柱)仍然有残留的蛋白质。这些固体微粒在低倍显微镜下检视为无 定形固体(非晶体)。这种上清液流过反相固相萃取柱，用试管收集 过柱后的流出液作供试液，往供试液中加入三硝基苯酚饱溶液后无析 出物，表明过反相固相萃取柱能除去残留的蛋白质。
当含有三聚氰胺的样品，按本发明粗除蛋白质之方法处理后得到 的上清液(未过反相固相萃取柱)，取出置于试管中，加入三硝基苯 酚饱溶液后有固体微粒析出，这些固体微粒在低倍显微镜下检视为无 定形固体，有的固体体积较小而且不透明，有的固体体积较大而且透 明。如果这种上清液流过反相固相萃取柱，用试管收集过柱后的流出 液作供试液，往供试液中加入三硝基苯酚饱溶液后则有晶状固体析 出，目视呈蓬松团状。这种结晶的单位质量具有较大的目视表观体积
从而提高了灵敏度(0.3mg三聚氰胺对应于2—3mL目视结晶体积)， 在低倍显微镜下检视，析出的晶体呈针束放射状，易于鉴别。结果表 明用反相固相萃取柱除去残留的蛋白质有利于晶体的形成。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
1.现有的样品除蛋白质的方法一般采用醇沉淀法、加重金属盐沉 淀法、加热法沉淀法、加三氯乙酸沉淀法等，但溶液中还有较多的蛋 白质残留；seveage法用氯仿一正丁醇混合液加入样品溶液中，在两 相相交界处有蛋白质析出，通过离心除去，如此反复多次，也能较彻 底地除去蛋白质，但操作时间长，手续繁琐。而本发明是在普通的粗 除蛋白质之后，通过将离心后的上清液注入反相固相萃取柱，使残留 的微量蛋白质被柱上填料吸附，收集过柱后的流出液作供试液，从而
实现除尽溶液中残留微量蛋白质的目的。净化方式为"穿透式"，即填 料不吸附三聚氰胺，不造成提取液中三聚氰胺浓度的下降。
2. 本发明与己有离子交换柱除蛋白质和大孔树脂除蛋白质在作 用机理上也不同。离子交换柱除蛋白的作用机理离子交换，蛋白质呈 带电荷状态，与离子交换柱上的相反电荷质点作用而被吸附，依靠的 是离子电荷作用力。大孔树脂除蛋白质的作用机理是分子排阻机理， 流出次序与分子大小有关，大分子较难进入树脂的孔穴而先流出，小 分子较易进入树脂的孔穴而后流出。本发明粗除蛋白质之后得到的上 清液中因含有三氯乙酸，溶液呈弱酸性，pH接近蛋白质的等电点， 溶液中残留的蛋白质呈电中性，蛋白质与反相固相萃取柱上的填料
(如C18填料)的作用力表现为色散力。因蛋白质的分子量很大， 所以其与固定相的作用力也很大。溶液流过反相固相萃取柱时，蛋白 质将被吸附，从而实现除尽溶液中残留微量蛋白质的目的。采用"穿 透式"的反相固相萃取方式除残留蛋白质，其操作比现有的离子交换 法和大孔树脂法简便、快速。
3. 本发明的供试液中含有一定量的甲醇有利于析出有特殊形状 的晶体。
4. 本发明的三聚氰胺检测方法成本低、操作简便、省时、不使用 贵重仪器、易于为普通工作人员掌握，易于推广。
具体实施例方式
设备和材料
离心机(转速3000r/min，每支离心管容量^10mL);超声振荡器
(参考型号SB5200DT);旋涡震荡器(均质用，参考型号 Vortex-genie )。
反相固相萃取柱Cw填料的固相萃取柱。实施例中使用的反相
固相萃取柱为Waters公司出品的SEP-PAK CLASSIC C18固相萃取柱 (部件号为WAT051910)。新开封的固相萃取柱依次分别注入10 mL 水、lOmL甲醇、lOmL水和几管空气(驱去残留柱上的水)，即完成 活化，供使用。
甲醇、三氯乙酸和三硝基苯酚为分析纯或化学纯。 三硝基苯酚饱和水溶液配制称取三硝基苯酚约2.5g，置于烧杯 中，加入20mL水，搅拌，使烧杯中保留有小量未溶解的三硝基苯酚， 连同未溶解的三硝基苯酚一并转移至试剂瓶中，即得。以下称三硝基 苯酚饱和溶液。
质量百分浓度为10%的三氯乙酸溶液配制称取三氯乙酸约4 g，置于20mL容量瓶中，加水溶解，定容于20mL，即得。
实施例l:液体奶(阳性)的检测
取已知三聚氰胺含量为500mg/L的液体奶12mL，置25 mL的 比色管中，加6mL甲醇，加入质量百分浓度为10%的三氯乙酸溶液 lmL，加水lmL (使混合样品中甲醇的体积百分浓度约为30% )，旋 涡震荡器上均质2min，超声10min，离心5min (3000r/min)，吸取上 清液约8mL，注入经活化处理的固相萃取柱，将初始流出的约lmL 溶液弃去，用试管收集随后流出的溶液约3—5mL作为供试液。往供 试液中滴入三硝基苯酚饱和溶液10滴(约0.5mL)，不振摇，静置。
静置后可观察到试管中析出针束状晶体。由此判断样品中含有三聚氰 胺。
曾试验，在不含三聚氰胺的液体奶中掺入不同量的三聚氰胺，掺
入量分别为1000mg/L、 500mg/L、 300mg/L、 200 mg/L、 100mg/L、 50 mg/L和25 mg/L，均可生成针束放射状晶体。晶体生成的速度和 生成的量与三聚氰胺的掺杂量有关。三聚氰胺的掺杂量越大，生成晶 体的速度越快，生成晶体的量越大，现象越明显。 实施例2:液体奶(阴性)的检测
取已知不含三聚氰胺的液体奶12mL，置25mL的比色管中，其 余操作参照实施例l。静置后试管中溶液澄清，无析出物。由此判断 样品中不含有较高含量的三聚氰胺。 实施例3:奶粉(阳性)的检测
取已知三聚氰胺含量为500mg/L的奶粉5g，置于50 mL的比色 管中，加入体积百分浓度为30呢的甲醇溶液约35mL，加入10%三氯 乙酸2.5mL，再用体积百分浓度为30%的甲醇溶液定容至刻度，旋涡 震荡器上均质2min，超声10min，离心5min (3000 r/min)，吸取上 清液约8mL，注入经活化处理的固相萃取柱，将始流出的约lmL溶 液弃去，用小试管收集随后流出的溶液约3—5mL作为供试液。往供 试液中滴入三硝基苯酚饱和溶液10滴(约0.5mL)，不振摇，静置。 静置后可观察到试管中析出针束状晶体。由此判断样品中含有三聚氰 胺。
实施例4:奶粉(阴性)的检测
取已知不含三聚氰胺的奶粉5g，置于50mL的比色管中，其余操 作参照实施例3。静置后试管中溶液澄清，无析出物。由此判断样品
中不含有较高含量的三聚氰胺。
实施例5:蛋白粉(含大豆蛋白，阳性)的检测
取蛋白粉(含大豆蛋白，已知三聚氰胺含量为700mg/kg) 5g， 置于50mL的比色管中，其余操作参照实施例3。静置后可观察到试 管中析出针束状晶体。由此判断样品中含有三聚氰胺。
实施例6:蛋白粉(含大豆蛋白，阴性)的检测
取已知不含三聚氰胺的的蛋白粉(含大豆蛋白)5g，置于50mL 的比色管中，其余操作参照实施例3。静置后不含三聚氰胺的供试液 无析出物。由此判断样品中不含有较高含量的三聚氰胺。
实施例7:饲料(阳性)的检测
饲料经研碎(已知三聚氰胺含量为1500mg/kg)，取样2g，置于 50mL的比色管中，其余操作参照实施例3。静置后可观察到试管中 析出针束状晶体。由此判断样品中含有三聚氰胺。 实施例8:词料(阴性)的检测
已知不含三聚氰胺的词料经研碎，取样2g，置50mL的比色管中, 其余操作参照实施例3。静置后试管中溶液澄清，无析出物。由此判 断样品中不含有较高含量的三聚氰胺。
实施例9:腐竹(阳性)的检测
腐竹经粉碎(已知三聚氰胺含量为700mg/kg)，取样5g，置于 50mL的比色管中，其余操作参照实施例3。静置后可观察到试管中
析出针束状晶体。由此判断样品中含有三聚氰胺。 实施例10:腐竹(阴性)的检测
已知不含三聚氰胺的腐竹粉碎，取样5g，置50mL的比色管中， 其余操作参照实施例3。静置后试管中溶液澄清，无析出物。由此判 断样品中不含有较高含量的三聚氰胺。
权利要求
1. 食品或饲料中三聚氰胺掺杂的快速检测方法，其特征在于包括如下步骤(1)除去待测样品中的大部分蛋白质对于液态样品，往液态样品中加入甲醇或甲醇水溶液，再加入三氯乙酸溶液，均质、超声处理，离心处理，取出离心后的上清液；对于粉末状样品，先加水、均质，然后加入甲醇或甲醇水溶液，再加入三氯乙酸溶液，均质、超声处理，离心处理，取出离心后的上清液；对于颗粒或块状样品，研细或粉碎处理后，先加水、均质，然后加入甲醇或甲醇水溶液，再加入三氯乙酸溶液，均质、超声处理，离心处理，取出离心后的上清液；(2)除去上清液中残留的微量蛋白质制得供试液上清液流过反相固相萃取柱，残留的微量蛋白质被柱上填料吸附，收集过柱后的流出液作供试液；(3)结晶反应和结果判断往供试液中加入三硝基苯酚的饱和水溶液，静置；当供试液中含有三聚氰胺，加入三硝基苯酚的饱和水溶液，静置后将可观察到试管中析出针束状晶体；三聚氰胺掺杂量越大，析出的速度越快，晶体的析出量越大；不含三聚氰胺的供试液无析出物。
2. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述三氯乙酸溶液
3.用于检测食品或饲料中三聚氰胺惨杂的试剂盒，其特征在于包括如下试剂甲醇、质量百分数10%的三氯乙酸溶液、三硝基苯酚的 饱和水溶液。
全文摘要
本发明公开了食品或饲料中三聚氰胺掺杂的快速检测方法及其试剂盒。包括如下步骤(1)除去待测样品中的大部分蛋白质；(2)除去上清液中残留的微量蛋白质制得供试液；(3)结晶反应和结果判断往供试液中加入三硝基苯酚的饱和水溶液，静置；当供试液中含有三聚氰胺，加入三硝基苯酚的饱和水溶液，静置后将可观察到试管中析出针束状晶体；不含三聚氰胺的供试液无析出物。试剂盒包括如下试剂甲醇、质量百分数10％的三氯乙酸溶液、三硝基苯酚的饱和水溶液。本发明的三聚氰胺检测方法成本低、操作简便、省时、不使用贵重仪器、易于为普通工作人员掌握，易于推广。
文档编号G01N1/28GK101393175SQ20081021860
公开日2009年3月25日 申请日期2008年10月23日 优先权日2008年10月23日
发明者张永慧, 朱炳辉, 杨杏芬, 钟志雄, 高燕红, 龙朝阳 申请人:广东省疾病预防控制中心